Specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu

Metoda ta zapewnia technikę izolowania kwasów nukleinowych z określonych populacji komórek jajnika od tej samej myszy bez konieczności sortowania komórek. Technika ta może pomóc w określeniu, jak zmieniają się określone populacje komórek w różnych warunkach. Na przykład ze starzeniem się.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na sparowaną analizę epigenomiczną i transkryptomiczną z określonego typu komórek jajnika bez konieczności sortowania komórek. To znacznie zwiększa przepustowość, obniża koszty i eliminuje potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu podczas wykonywania analizy specyficznej dla typu komórki z tkanki jajnikowej. W tym przypadku naszym celem jest zidentyfikowanie zmian specyficznych dla typu komórek, które zachodzą wraz ze starzeniem się jajników przed starzeniem się reprodukcyjnym, co ma implikacje w leczeniu niepłodności kobiet.

Metodę tę można zastosować do dowolnego typu komórki w różnych układach ciała, dla których dostępny jest sterownik Cre specyficzny dla typu komórki. Najtrudniejszą częścią tej techniki jest wybór odpowiedniej linii Cre dla interesującego Cię typu komórki. Zalecana jest szeroko zakrojona walidacja swoistości komórkowej.

Na początek zbierz jeden jajnik od uśpionej myszy w 500 mikrolitrach buforu do lizy jąder i pokrój jajnik na osiem części w buforze za pomocą samootwierających się mikronożyczek. Przenieś zmielony jajnik i bufor do lizy do szklanego homogenizatora odbijającego na lodzie i homogenizuj jajnik 10 do 20 razy za pomocą luźnego tłuczka A. Dodaj 400 mikrolitrów buforu do lizy do tłuczka do mycia homogenizatora A. A następnie homogenizuj jajnik ciasnym tłuczkiem B 10 do 20 razy. Przenieś homogenat do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem i odwiruj przy 200 g przez 1,5 minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć niezdysocjowaną tkankę i naczynia krwionośne.

Po wstępnym zwilżeniu sitka o długości 30 mikrometrów ze 100 mikrolitrami buforu do lizy, przefiltruj supernatant przez sitko do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Przenieść jądra zawierające mieszaninę do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem. Odwirować próbkę o masie 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.

Zawiesić osad jąder w 250 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy, krótko wirując z umiarkowaną lub dużą prędkością. Zwiększ objętość do 1,75 mililitra, dodając 1,5 mililitra buforu do lizy. Delikatnie wymieszać i oprzeć zawiesinę jąder na lodzie na pięć minut.

Granulować jądra przez odwirowanie w temperaturze 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając osadu jądrowego. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego bufora do przechowywania w niskiej temperaturze i krótko zawirować, aby całkowicie zawiesić osad jądra.

Zarezerwować 10% zawieszonego osadu jako wejściową próbkę jąder do dalszej analizy. Wziąć zawieszoną paletę jąder i uzupełnić objętość do dwóch mililitrów lodowatym buforem do oczyszczania jądrowego lub NPB. Dodaj 30 mikrolitrów zawieszonych kulek do każdej próbki do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem.

Następnie dodać jeden mililitr NPB i dobrze zawiesić przez pipetowanie. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby oddzielić koraliki. Wyrzuć supernatant i wyjmij rurkę z magnesu.

Ponownie zawiesić umyte kulki magnetyczne w jednym mililitrze NPB. Powtórz krok prania, w sumie trzy prania. A po ostatnim praniu ponownie zawieś koraliki w początkowej objętości NPB.

Dodać 30 mikrolitrów umytych kulek do dwóch mililitrów zawiesiny jądrowej i dobrze zawiesić mieszaninę jąder kulek, pipetując i delikatnie odwracając probówkę. Umieścić probówki na mieszalniku obrotowym w chłodni lub lodówce na 30 minut przy niskiej prędkości i inkubować próbki wejściowe bez kulek w tych samych warunkach. Umieść probówki z zawiesiną jąder i koralikami na magnesie na trzy minuty, aby oddzielić biotynylowane jądra związane z kulkami streptawidyny od ujemnej frakcji jąder.

Usunąć supernatant. Przełóż frakcję ujemną do świeżej dwumililitrowej probówki i zarezerwuj ją na lodzie. Dla każdej probówki z frakcją dodatnią wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś zawartość w jednym mililitrze NPB.

Umieść probówkę na magnesie na jedną minutę i wyrzuć supernatant. Zawiesić mieszaninę jąder kulek frakcji dodatniej w 30 mikrolitrach NPB. Przenieść jajnik i 100 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego do szklanego homogenizatora z dnakiem i homogenizować 10 do 20 razy za pomocą luźnego tłuczka A. Dodać 400 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego TRAP do tłuczka do mycia A i przenieść homogenat do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem.

Umyj homogenizator dodatkowym mililitrem buforu homogenizacyjnego TRAP i przenieś umytą objętość do dwumililitrowej rurki z okrągłym dnem. Odwirować homogenat o stężeniu 12 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I przenieś oczyszczony supernatant do świeżej dwumililitrowej rurki z okrągłym dnem.

Po odrzuceniu osadu przenieś 100 mikrolitrów oczyszczonego homogenatu do świeżej dwumililitrowej rurki z okrągłym dnem i zachowaj go jako wsad na lód. Pozostałą część oczyszczonego homogenatu inkubować z pięcioma mikrogramami na mililitr przeciwciała anty-GFP przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, obracając się w mieszalniku typu end-over-end. Inkubować próbkę wejściową w tych samych warunkach.

Przenieś 50 mikrolitrów kulek magnetycznych białka G dla każdej próbki do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania o niskiej zawartości soli do kulek i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Umieść rurkę w stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby zebrać koraliki z boku rurki.

Po odrzuceniu supernatantu wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj do niej jeden mililitr buforu do płukania o niskiej zawartości soli. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Ponownie umieść rurkę w stojaku magnetycznym i powtórz ten krok, co daje łącznie trzy prania.

Po ostatnim praniu ponownie zawiesić kulki w początkowej objętości bufora do płukania o niskiej zawartości soli. Przenieś ponownie zawieszone umyte kulki do mieszaniny przeciwciał próbki antygenu i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, obracając się w mieszalniku typu end-do-end. Próbki wejściowe należy inkubować przez noc w równoważnych warunkach.

Następnie oddziel frakcję dodatnią lub kulki magnetyczne z docelowym rybosomem RNA od frakcji ujemnej lub supernatantu za pomocą podstawki magnetycznej przez 2,5 do 3 minut. Odessać frakcję ujemną. Umieść go w świeżej dwumililitrowej probówce z okrągłym dnem i odłóż na lód.

Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania o wysokiej zawartości soli do probówki z frakcją dodatnią i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym utrzymywanym na lodzie przez jedną minutę, aby oddzielić koraliki. Po wyrzuceniu supernatantu wyjmij rurkę z magnesu i powtórz ten krok, w sumie trzy płukania.

Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś kulki w 350 mikrolitrach buforu do lizy RNA uzupełnionym 3,5 mikrolitrami 2-merkaptoetanolu. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej, mieszając przez 10 minut przy 900 obr./min w cyfrowym wytrząsarce. Oddziel kulki od roztworu, który zawiera teraz docelowe rybosomy RNA, za pomocą podstawki magnetycznej na jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Zbierz eluowaną frakcję dodatnią w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Obrazowanie immunofluorescencyjne przeprowadzono na parafinizowanych jajnikach myszy Cyp17-Cre dodatnich NuTRAP flox i Cyp17-Cre-ujemnych NuTRAP flox. Białko EGFP wybarwiono za pomocą koziego przeciwciała pierwszorzędowego anty-GFP i wtórnego przeciwciała anty-koziego osła Alexa 488, a jądra wybarwiono DAPI.

Zdjęcia wykonano pod mikroskopem fluorescencyjnym w 20-krotnym powiększeniu. Wejściowy i dodatni frakcji RNA TRAP wyizolowano z jajników myszy Cyp17-Cre-dodatnich NuTRAP flox i zsekwencjonowano w sparowany sposób końcowy. Analiza głównych składowych wszystkich ulegających ekspresji genów wykazała oddzielenie frakcji wejściowej TRAP i dodatniej w pierwszym składniku.

Wykres wulkaniczny genów o zróżnicowanej ekspresji między frakcją wejściową a frakcją dodatnią jest pokazany tutaj. Porównanie frakcji dodatniej TRAP z danymi wejściowymi wykazało ogólne wzbogacenie genów markera komórek zrębu/osłonki oraz zubożenie genów markera komórek oocytów, ziarnistości, układu odpornościowego i komórek mięśni gładkich we frakcji dodatniej TRAP. Po pierwszym odwirowaniu zawiesiny jądrowej w celu usunięcia niezdysocjowanych naczyń krwionośnych, jądra znajdują się w supernatancie.

Upewnij się, że zachowałeś supernatant i wyrzuć osad w tym momencie. Podążając za nienaruszoną metodą, można przeprowadzić kilka technik epigenomicznych, w tym między innymi testy dostępności chromatyny lub modyfikacji DNA. Stosując metodę TRAP, można przeprowadzić sekwencjonowanie RT-qCPR lub RNA w celu oceny translatomii.

Jest to pierwsze zastosowanie metody NuTRAP w jajniku myszy. Pozwala to na wysokoprzepustową analizę epigenomiczną i transkryptomiczną określonych typów komórek jajnika, które mogą być wykorzystane do badania starzenia się jajników lub raka.