Name: Specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Poznaj metodę NuTRAP do sparowanej analizy epigenomu i transkryptomu komórek jajnika myszy bez sortowania komórek. Ta technika umożliwia badanie zmian związanych ze starzeniem się jajników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) i Presbyterian Health Foundation. Prace te były również częściowo wspierane przez I01BX003906 z nagrodą MERIT oraz nagrodą Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) przyznaną ISIBX004797 przez Stany Zjednoczone (USA). Departament ds. Weteranów, Laboratorium Biomedyczne Dział Badawczo-Rozwojowy. Autorzy chcieliby również podziękować Clinical Genomics Center (OMRF) i Imaging Core Facility (OMRF) za pomoc i korzystanie z instrumentów.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Myszy rodzicielskie zakupiono w Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) i wyhodowano oraz trzymano w warunkach SPF w środowisku barierowym HEPA w cyklu 14 godzin / 10 godzin światła / ciemności (światła włączone o 6:00 rano) w OMRF.
UWAGA: W tej demonstracji używamy samca Cyp17iCre+/−(Szczep # 028547, The Jackson Laboratory) sparowanego z samicą NuTRAP (Szczep # 029899, The Jackson Laboratory). Pożądane potomstwo Cyp17-NuTRAP (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) będzie wykazywać ekspresję allelu NuTRAP pod kontrolą promotora Cyp17a1 w komórkach zrębu jajników. Do przygotowania manuskryptu użyliśmy 4-miesięcznych samic myszy Cyp17-NuTRAP (n = 4). DNA wyekstrahowano z próbek kolczyka w uszach myszy w celu genotypowania w celu potwierdzenia dziedziczenia transgenów Cyp17iCre i NuTRAP oraz w celu wykrycia PCR 1) generycznego Cre, 2) Cyp17iCre i 3) NuTRAP floxowanego przy użyciu starterów wymienionych w Tabeli Materiałów, jak opisano wcześniej7,8.
1. Rozwarstwienie jajników myszy
<ol>
	<li>Przeprowadzić eutanazję myszy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i zgodą instytucji, a następnie pobrać jajniki.</li>
	<li>Wypreparuj jajniki w celu usunięcia tkanki tłuszczowej lub części jajowodów, które mogą być przyczepione do tkanki jajnika, przed umieszczeniem jajników w rurkach z buforem. Natychmiast przejdź do technik PUŁAPKI lub INTACT. 
	UWAGA: Ten protokół nie został zoptymalizowany do użytku z zamrożoną tkanką. Użycie jednego jajnika z tej samej myszy dla każdej techniki jest zalecane do przyszłej analizy statystycznej.</li>
</ol>
2. Izolacja jąder od określonych typów komórek jajnika
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu
	<ol>
		<li>Bufor do oczyszczania jądrowego (NPB): Aby przygotować 100 ml NPB, połącz 2 ml 1 M HEPES (końcowe stężenie: 20 mM HEPES), 0,8 ml 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 ml 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 ml 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 ml 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), i 92,2 ml wody wolnej od nukleaz. Suplement z 1x inhibitorem proteazy w dniu izolacji jąder. 
		UWAGA: NPB można przygotować bez inhibitora proteazy z wyprzedzeniem i utrzymuje się do 3 tygodni w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Bufor do lizy jąder (kompletny): Uzupełnij bufor do lizy jąder o 1x inhibitor proteazy w dniu izolacji jąder.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie zawiesiny jąder 
	UWAGA: Próbki należy przez cały czas przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.
	<ol>
		<li>Pobrać jeden jajnik od myszy Cyp17-NuTRAP (lub innego odpowiedniego Cre-NuTRAP) w 500 μl buforu do lizy jąder (kompletny). Pokrój jajnik na osiem części w buforze za pomocą samootwierających się mikronożyczek.</li>
		<li>Za pomocą końcówek do pipet o szerokim otworze przenieś rozdrobniony jajnik i 500 μl buforu do lizy do szklanego homogenizatora Dounce na lodzie. Homogenizować jajnik 10x-20x za pomocą luźnego tłuczka A. Dodać 400 μl buforu do lizy do homogenizatora Dounce, tłuczka myjącego A.</li>
		<li>Homogenizuj jajnik za pomocą ciasnego tłuczka B 10x-20x. Dodać 1 000 μl buforu do lizy, tłuczka myjącego B. Przenieść homogenat (1,9 ml) do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Wirować przy 200 x g przez 1,5 minuty w temperaturze 4 °C w celu usunięcia niezdysocjowanych tkanek i naczyń krwionośnych14. Supernatant zawiera jądra; Wyrzucić osad z niezdysocjowanej tkanki.</li>
		<li>Po wstępnym zwilżeniu sitka komórkowego o wielkości 30 μm ze 100 μl buforu do lizy i przefiltrowaniu supernatantu przez sitko do komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie przenieść mieszaninę zawierającą jądra do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Osad zawiera jądra.</li>
		<li>Zawiesić ponownie osad jądrowy w 250 μl lodowatego buforu do lizy, krótko wirując z umiarkowaną lub dużą prędkością. Zwiększyć objętość do 1,75 ml, dodając 1,5 ml buforu do lizy. Delikatnie wymieszaj i odłóż zawiesinę jądrową na lodzie na 5 minut.</li>
		<li>Osadzać jądra przez odwirowywanie w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odrzucić supernatant, nie naruszając osadu jądrowego. Ponownie zawiesić pastylkę w 200 μl lodowatego bufora do przechowywania i krótko wirować, aby całkowicie ponownie zawiesić pastylkę jądrową.</li>
		<li>Zachować 10% zawieszonego osadu (20 μl) jako wsadową próbkę jąder do dalszych analiz.</li>
		<li>Pobrać zawieszone jądra osadu i uzupełnić objętość do 2,0 ml lodowatym NPB. Przystąp do izolowania znakowanych jąder przy użyciu metody oczyszczania opartej na powinowactwie INTACT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja jąder znakowanych w określonych typach komórek (INTACT)
	<ol>
		<li>Wirować kulki streptawidyny w fiolce przez 30 s ze średnią prędkością, aby upewnić się, że są całkowicie zawieszone. Dodać 30 μl zawieszonych kulek do każdej próbki do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml (kulki na maksymalnie 10 próbek można umyć w jednej probówce), dodać 1 ml NPB i dobrze zawiesić przez pipetowanie.</li>
		<li>Umieść rurkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby oddzielić koraliki. Odrzucić supernatant i wyjąć rurkę z magnesu. Ponownie zawiesić umyte kulki magnetyczne w 1 ml NPB.</li>
		<li>Powtórz krok prania, w sumie trzy prania. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić kulki w początkowej objętości NPB (30 μl na próbkę).</li>
		<li>Dodać 30 μl przemytych kulek do 2 ml zawiesiny jądrowej z kroku 2.2.10. Dobrze zawiesić mieszaninę koralików i jąder, pipetując i delikatnie odwracając probówkę.</li>
		<li>Umieść rurki na obrotowym mikserze w chłodni lub lodówce na 30 minut na niskich obrotach. Inkubować próbki wejściowe bez kulek w tych samych warunkach.</li>
		<li>Umieść probówki z zawiesiną jądrową i koralikami na magnesie i oddziel biotynylowane jądra związane z kulkami streptawidyny (frakcja dodatnia) od ujemnej frakcji jąder. Pozwól koralikom rozdzielić się na magnesie przez 3 minuty.</li>
		<li>Usunąć supernatant, przenieść frakcję ujemną do świeżej probówki o pojemności 2,0 ml i odłożyć na lód. Dla każdej probówki z frakcją dodatnią wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś zawartość w 1 ml NPB.</li>
		<li>Umieść probówkę na magnesie na 1 minutę i wyrzuć supernatant. Wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś przemytą mieszaninę koralików i jąder w 1 ml NPB.</li>
		<li>Powtórz krok 2.3.8, co daje w sumie trzy prania. Po wykonaniu trzech płukań ponownie zawiesić mieszaninę frakcji dodatniej i jąder frakcji dodatniej w 30 μl NPB.</li>
		<li>Dla każdej probówki z frakcją ujemną odwirować zawiesinę jądrową z etapu 2.3.7 przy 500 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać i odrzucić supernatant. Zawiesić osad jąder frakcji ujemnej w 30 μl NPB.</li>
		<li>Jądra z materiału wejściowego (etap 2.2.9), frakcji ujemnej (etap 2.3.10) i frakcji dodatniej (etap 2.3.9) należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze −80 °C, aż będą gotowe do izolacji jądrowego DNA lub RNA. 
		UWAGA: Jąder nie należy zamrażać w przypadku protokołów wymagających nienaruszonych jąder jako danych wejściowych (tj. test chromatyny dostępnej dla transpozazy, immunoprecypitacja chromatyny).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja mRNA z określonych typów komórek jajnika
<ol>
	<li>Przygotowanie
	<ol>
		<li>Baza buforowa TRAP: Przygotuj 100 ml bazy buforowej TRAP, łącząc 78,8 ml wody wolnej od RNaz, 5 ml 1 M Tris-HCl (końcowe stężenie: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 ml 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 ml 1 M MgCl2 (12 mM MgCl2) i 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
		<li>Bufor o wysokiej zawartości soli: Przygotuj 100 ml bazy buforowej o wysokiej zawartości soli, łącząc 68,8 ml wody wolnej od RNaz, 5 ml 1 M Tris-HCl (końcowe stężenie: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 ml 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 ml 1M MgCl2 (12 mM MgCl2) i 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
		<li>Bufor homogenizacyjny TRAP (kompletny): Przygotować 1,5 ml na próbkę w dniu pobrania tkanki. Przygotować 10 ml buforu homogenizacyjnego TRAP, łącząc 10 ml zasady buforowej TRAP (z kroku 3.1.1) z 10 μl 100 mg/ml cykloheksymidu (końcowe stężenie: 100 μg/ml cykloheksymidu), 10 mg heparyny sodowej (1 mg/ml heparyny sodu), 20 μl 0,5 M DTT (1 mM DTT), 50 μl 40 U/μL inhibitora RNazy (200 U/ml inhibitora RNazy), 200 μl 0,1 M spermidyny (2 mM spermidyny) i jedna tabletka inhibitora proteazy bez EDTA (1x).</li>
		<li>Bufor do przemywania o niskiej zawartości soli (kompletny): Przygotować 1,5 ml na próbkę w dniu pobrania tkanki. Aby przygotować 10 ml buforu do przemywania o niskiej zawartości soli, należy połączyć 10 ml zasady buforowej TRAP (z kroku 3.1.1) z 10 μl cykloheksymidu 100 mg/ml (100 μg/ml cykloheksymidu) i 20 μl 0,5 M DTT (1 mM DTT).</li>
		<li>Bufor do przemywania o wysokiej zawartości soli (kompletny): Przygotować 1,5 ml na próbkę w drugim dniu izolacji TRAP. Aby przygotować 10 ml buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli, należy połączyć 10 ml buforu o wysokiej zawartości soli (z kroku 3.1.2) z 10 μl cykloheksymidu o stężeniu 100 mg/ml i 20 μl 0,5 M naziemnej telewizji cyfrowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie translacyjnego oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP)
	<ol>
		<li>Pobrać drugi jajnik od myszy Cyp17-NuTRAP (lub innego odpowiedniego Cre-NuTRAP) i umieścić go w 1,5 ml probówce wolnej od RNaz zawierającej 100 μl lodowatego buforu homogenizacyjnego TRAP (od kroku 3.1.3). Pokrój jajnik na osiem części w buforze za pomocą samootwierających się mikronożyczek.</li>
		<li>Za pomocą końcówek o szerokim otworze przenieś jajnik i 100 μl buforu homogenizacyjnego do szklanego homogenizatora Dounce. Homogenizować 10x-20x za pomocą luźnego tłuczka A. Dodać 400 μL buforu homogenizacyjnego TRAP, tłuczka myjącego A.</li>
		<li>Przenieść homogenat do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml. Umyć homogenizator Dounce dodatkowym 1 ml buforu homogenizacyjnego TRAP i przenieść umytą objętość do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Odwirować homogenat o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść oczyszczony supernatant do świeżej probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml. Wyrzuć granulkę.</li>
		<li>Przenieść 100 μl oczyszczonego homogenatu do świeżej probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml i odłożyć jako wsad na lodzie.</li>
		<li>Pozostałą część oczyszczonego homogenatu (z etapu 3.2.4) inkubować z przeciwciałem anty-GFP (5 μg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, obracając się od końca do końca. Inkubować próbkę wejściową w tych samych warunkach.</li>
		<li>W ciągu ostatnich 15 minut inkubacji przemyć kulki magnetyczne białka G w buforze do przemywania o niskiej zawartości soli, wykonując następujące czynności (3.2.8-3.2.11).</li>
		<li>Wirować fiolkę z kulkami magnetycznymi białka G przez 30 sekund, aby całkowicie zawiesić. Przenieś 50 μl kulek magnetycznych białka G dla każdej próbki (w jednej probówce można umyć do 10 próbek) do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Dodaj 500 μl buforu do płukania o niskiej zawartości soli do kulek i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby zebrać koraliki z boku rurki. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
		<li>Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj do niej 1 ml buforu do płukania o niskiej zawartości soli. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby zebrać koraliki z boku rurki. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
		<li>Powtórz krok 3.2.10, co daje w sumie trzy prania. Po końcowym płukaniu wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w początkowej objętości buforu do płukania o niskiej zawartości soli (50 μl na próbkę).</li>
		<li>Przenieść ponownie zawieszone umyte kulki (50 μl) do mieszaniny próbki antygenu i przeciwciał i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, obracając się w mieszadle typu "koniec po końcu". Próbki wejściowe należy inkubować, obracając się od końca do końca w temperaturze 4 °C przez noc w celu utrzymania równoważnych warunków.</li>
		<li>Po całonocnej inkubacji wyjmij probówki z rotatora i oddziel kulki magnetyczne z docelowymi rybosomami/RNA (frakcja dodatnia) od supernatantu (frakcja ujemna) za pomocą podstawki magnetycznej na 2,5-3 min. Odessać frakcję ujemną, umieścić ją w świeżej probówce okrągłodennej o pojemności 2 ml i odstawić na lód podczas przetwarzania frakcji dodatniej.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli (z kroku 3.1.5) do probówki z frakcją dodatnią i delikatnie odpipetować do wymieszania. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym utrzymywanym na lodzie na 1 minutę, aby oddzielić koraliki. Odrzucić supernatant i wyjąć rurkę z magnesu.</li>
		<li>Powtórz krok 3.2.14, co daje w sumie trzy prania. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś kulki w 350 μl buforu do lizy RNA uzupełnionego 3,5 μl 2-merkaptoetanolu (BME). Inkubować probówki w temperaturze pokojowej, mieszając przez 10 minut przy 900 obr./min w wytrząsarce cyfrowej.</li>
		<li>Oddziel kulki od roztworu, który zawiera teraz docelowe rybosomy/RNA, za pomocą podstawki magnetycznej na 1 minutę w temperaturze pokojowej. Zebrać eluowaną frakcję dodatnią (supernatant) w świeżej probówce o pojemności 1,5 ml i dodać 350 μl 100% etanolu. Odwróć, aby wymieszać. Przejdź do izolacji RNA.</li>
		<li>Opcjonalnie: Aby wyizolować RNA z próbki wejściowej (krok 3.2.5) i frakcji ujemnej (krok 3.2.13), przenieś 100 μl frakcji wejściowej i ujemnej do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml. Do każdej próbki dodać 350 μl buforu do lizy RNA uzupełnionego 3,5 μl BME. Odwróć, aby wymieszać. Dodaj 250 μl 100% etanolu do każdej probówki i odwróć do mieszania. Przejdź do izolacji RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja RNA
	<ol>
		<li>Przenieść 700 μl frakcji dodatniej i, opcjonalnie, frakcji wejściowej i/lub ujemnej do kolumny wirowej RNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wyizolować RNA z kolumny wirowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+aging%3A+Mechanisms+and+clinical+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences.</a> Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+in+translational+research%3A+Theory%2C+technical+considerations%2C+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li>
<li>Morris, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+cycling+murine+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the cycling murine ovary.</a> eLife. 11, 77239(2022).</li>
<li>Kendrick, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+mammary+epithelial+subpopulations+identifies+novel+determinants+of+lineage+commitment+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate.</a> BMC Genomics. 9, 591(2008).</li>
<li>Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+FACS+perturb+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Does FACS perturb gene expression.</a> Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Ocanas, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+ex+vivo+confounds+of+cell-isolation+techniques+on+transcriptomic+and+translatomic+profiles+of+purified+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia.</a> eNeuro. 9 (2), (2022).</li>
<li>Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BSIT%26%2334%3B+with+Emx1-NuTRAP+mice%3A+Simultaneous+INTACT+and+TRAP+for+paired+transcriptomic+and+epigenetic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">34;SIT&#34; with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing.</a> Current Protocols. 2 (10), 570(2022).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translatomic+response+of+retinal+Muller+glia+to+acute+and+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+Disease%22%5BJournal%5D)">Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress.</a> Neurobiology Disease. 175, 105931(2022).</li>
<li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).</li>
<li>Briley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+age-associated+fibrosis+in+the+stroma+of+the+mammalian+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary.</a> Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+reproductive+life+span+is+extended+by+targeted+removal+of+fibrotic+collagen+from+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary.</a> Science Advances. 8 (24), (2022).</li>
<li>Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+analysis+in+the+vertebrate+brain+using+immunolabeled+fresh+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei.</a> Bio-Protocol. 3 (22), 973(2013).</li>
<li>Saccon, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+follicle+reserve%2C+DNA+damage+and+macrophage+infiltration+in+the+ovaries+of+the+long-living+Ames+dwarf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice.</a> Experimental Gerontology. 132, 110851(2020).</li>
<li>Kinnear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ovarian+stroma+as+a+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">The ovarian stroma as a new frontier.</a> Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).</li>
<li>Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+the+estrous+cycle+and+induction+of+estrus+in+experimental+rodents%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update.</a> Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).</li>
<li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+droplet-based+ultra-high-throughput+single-cell+RNA-Seq+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems.</a> Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).</li>
<li>Zheng, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+by+shrinking%3A+Empowering+single-cell+%27omics%27+with+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoBATCH+for+high-throughput+single-cell+epigenomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling.</a> Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-cell+DNA+methylome+profiling+with+snmC-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2.</a> Nature Communications. 9, 3824(2018).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+atlas+of+the+mouse+brain+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution.</a> Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).</li>
<li>Yamawaki, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+high-throughput+single-cell+RNA-seq+methods+for+immune+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling.</a> BMC Genomics. 22 (1), 66(2021).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Natarajan, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+tagged+reverse+transcription+%28STRT-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Aldridge, S., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics comes of age.</a> Nature Communications. 11, 4307(2020).</li>
<li>Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics%3A+Powerful+new+methods+for+understanding+gene+regulation+and+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity.</a> Genome Biology. 17, 72(2016).</li>
<li>Christensson, E., Lewan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spermidine+for+the+isolation+of+nuclei+from+mouse+liver.+Studies+of+purity+and+yield+during+different+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+fu%CC%88r+Naturforschung.+Section+C%2C+Biosciences%22%5BJournal%5D)">The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions.</a> Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).</li>
<li>Levine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menopause+accelerates+biological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Menopause accelerates biological aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).</li>
<li>Ossewaarde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+at+menopause%2C+cause-specific+mortality+and+total+life+expectancy%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy.</a> Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).</li>
<li>Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+menopause+predicts+future+coronary+heart+disease+and+stroke%3A+the+Multi-Ethnic+Study+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis.</a> Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).</li>
<li>Camaioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+ovarian+aging%3A+It+is+not+just+about+oocytes+and+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Mysi modelNuTRAP 6 to potężne podejście do znakowania transgenicznego do sparowanego badania transkryptomu i epigenomu z określonych typów komórek, które można dostosować do dowolnego typu komórki za pomocą dostępnego sterownika Cre. W tym miejscu pokazujemy specyfikę mysiego modelu Cyp17-NuTRAP w celowaniu w komórki osłonki jajnika i zrębu. Model Cyp17-NuTRAP może być wykorzystany do dalszego wyjaśnienia specyficznych dla komórek osłonki i zrębu mechanizmów epigenetycznych związanych ze starzenie...

Jajniki odgrywają główną rolę w starzeniu się somatycznym1, z wyraźnym udziałem określonych populacji komórek. Heterogeniczność komórkowa jajnika utrudnia interpretację wyników molekularnych z masowych testów całego jajnika. Zrozumienie roli określonych populacji komórek w starzeniu się jajników jest kluczem do zidentyfikowania czynników molekularnych odpowiedzialnych za płodność i pogorszenie stanu zdrowia u starszych kobiet. Tradycyjnie, multiomiczna ocena określonych typów komórek jajnika była osiągana za pomocą technik takich jak mikrodysekcja laserowa2, podejścia jednokomórkowe3 lub sortowanie komórek4. Jednak mikrodysekcja może być kosztowna i trudna do przeprowadzenia, a sortowanie komórek może zmienić profile fenotypowe komórek5.
Nowatorskie podejście do oceny profili epigenomicznych i transkryptomicznych specyficznych dla komórek jajnika wykorzystuje mysi model NuTRAP (nuclear tagging and transling ribosomity affinity purification). Model NuTRAP umożliwia izolację kwasów nukleinowych specyficznych dla danego typu komórki bez konieczności sortowania komórek przy użyciu metod oczyszczania powinowactwa: translacji oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) i izolacji jąder oznaczonych określonymi typami komórek (INTACT)6. Ekspresja allelu NuTRAP jest kontrolowana przez kasetę STOP z floksacją i może być ukierunkowana na określone typy komórek jajnika za pomocą linii Cre specyficznych dla promotora. Poprzez skrzyżowanie myszy NuTRAP z linią Cre specyficzną dla typu komórki, usunięcie kasety STOP powoduje znakowanie eGFP kompleksu rybosomalnego i znakowanie biotyny/mCherry jądra w sposób zależny od Cre6. Techniki TRAP i INTACT mogą być następnie wykorzystane do wyizolowania mRNA i jądrowego DNA z interesującego typu komórki i przejścia do analiz transkryptomicznych i epigenomicznych.
Model NuTRAP został użyty w różnych tkankach, takich jak tkanka tłuszczowa6, brain tissue7,8,9, oraz retina10, aby ujawnić specyficzne dla typu komórki zmiany epigenomiczne i transkryptomiczne, które mogą nie być wykryte w homogenacie całej tkanki. Korzyści płynące z podejścia NuTRAP w porównaniu z tradycyjnymi technikami sortowania komórek obejmują: 1) zapobieganie artefaktom aktywacyjnym ex vivo8, 2) zminimalizowane zapotrzebowanie na specjalistyczny sprzęt (tj. sortery komórek) oraz 3) zwiększona przepustowość i obniżone koszty analiz specyficznych dla typu komórek. Ponadto zdolność do izolowania DNA i RNA specyficznych dla danego typu komórki od jednej myszy pozwala na analizy sparowane, które zwiększają moc statystyczną. Ponieważ ostatnie badania wykazały związek komórek zrębu jajników z fenotypami przedwczesnego starzenia się11,12,13, skierowaliśmy system ekspresji NuTRAP do komórek zrębu i osłonki za pomocą sterownika Cyp17a1-Cre. Tutaj pokazujemy, że indukcja konstruktu NuTRAP jest specyficzna dla komórek zrębu jajnika i osłonki, a z pojedynczego jajnika uzyskuje się wystarczającą ilość DNA i RNA do badań sekwencjonowania. Przedstawiony tu model NuTRAP i metody mogą być wykorzystane do badania dowolnego typu komórek jajnika z dowolną dostępną linią Cre.
Do wytworzenia specyficznej dla typu komórki linii myszy NuTRAP, allel NuTRAP do znakowania jądrowego i translacji powinowactwa rybosomów (NuTRAP) ma floksowany kodon STOP, który kontroluje ekspresję BirA, peptydu rozpoznającego ligazę biotyny (BLRP) oznaczonego mCherry/mRANGAP1 i eGFP/L10a. Po skrzyżowaniu z linią Cre specyficzną dla typu komórki, ekspresja kasety NuTRAP znakuje białko jądrowe mRANGAP1 biotyną/mWiśnią, a białko rybosomalne L10a eGFP w sposób zależny od Cre. Pozwala to na izolację jąder i mRNA od określonych typów komórek bez konieczności sortowania komórek. W celu oceny tego można połączyćklocek/flox NuTRAP z Cre specyficznym dla typu komórki, istotnym dla typów komórek jajnika.

<table><tbody><tr><td>0,1 M Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05292-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Thermo Scientific AM9530G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>100 mg/ml Cykloheksymid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4859-1ML</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>30 &mikro; Filtr siatkowy M&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GFP</td><td>Abcam</td><td>Ab290</td><td>Do buforu TRAP i IHC (poliklonalny królik do GFP)</td></tr> <tr><td>RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Bufor do lizy RNA w protokole</td></tr><tr><td>cKompletne, mini, wolne od EDTA tabletki inhibitora proteazy</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>do homogenizacji TRAP Bufor</td></tr><tr><td>Model myszy Cyp17iCre</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>28547</td><td>B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J</td></tr><tr><td>Magnes DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady genotypowania</td><td>IDT</td><td>Niestandardowy</td><td>ogólny Cre - Jackson Laboratory protokół 22392, Startery: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Cyp17iCre - Protokół Laboratorium Jacksona 30847, Startery: 21218, 31704, 31705, 35663</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>NuTRAP - Protokół Jackson Laboratory 21509, Startery: 21306, 24493, 32625, 32626</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitora proteazy Halt (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861278</td><td>Do buforu NPB</td></tr><tr><td>M-280 Streptawidin Dynabeads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11205D</td><td>2.8 & mikro; m średnica kulki</td></tr><tr><td>MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>5353000529</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji jąder: Nuclei EZ Prep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NUC101</td><td>zawiera bufor do lizy jąder i bufor do przechowywania jąder</td></tr><tr><td>1 m HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>5 m NaCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>Model myszy NuTRAP</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>29899</td><td>B6; 129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J</td></tr><tr><td>Pierce DTT No-Weigh Format</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>Białko G Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>10004D</td><td>Do TRAP</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2425</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7,5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy VWR</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9854190</td><td></td></tr></tbody></table>

specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu

Cell-Specific Paired Interrogation of the Mouse Ovarian Epigenome and Transcriptome

Ocena specyficznych dla typu komórki zmian epigenomicznych i transkryptomicznych jest kluczem do zrozumienia starzenia się jajników. W tym celu przeprowadzono optymalizację metody oczyszczania translacji powinowactwa rybosomów (TRAP) oraz metodę izolacji jąder znakowanych określonymi typami komórek (INTACT) w celu późniejszego sparowanego badania transkryptomu i epigenomu jajników specyficznych dla komórki przy użyciu nowego transgenicznego modelu myszy NuTRAP. Ekspresja allelu NuTRAP jest kontrolowana przez kasetę STOP z floksacją i może być ukierunkowana na określone typy komórek jajnika za pomocą linii Cre specyficznych dla promotora. Ponieważ ostatnie badania wykazały, że komórki zrębu jajnika odpowiadają za fenotypy przedwczesnego starzenia, system ekspresji NuTRAP został ukierunkowany na komórki zrębu przy użyciu sterownika Cyp17a1-Cre. Indukcja konstruktu NuTRAP była specyficzna dla fibroblastów zrębu jajnika, a z pojedynczego jajnika uzyskano wystarczającą ilość DNA i RNA do badań sekwencjonowania. Przedstawiony tu model NuTRAP i przedstawione metody mogą być wykorzystane do badania dowolnego typu komórek jajnika z dostępną linią Cre.

Schemat protokołów TRAP i INTACT przedstawiono na Rysunku 1. Tutaj specyficzność modelu mysiego Cyp17-NuTRAP względem komórek stromalnych i tekalnych jajnika została wykazana za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego oraz RNA-Seq z RNA wyizolowanego metodą TRAP. Najpierw wykonano obrazowanie immunofluorescencyjne sygnału eGFP w jajniku oraz lokalizację sygnału eGFP w komórkach tekalnych i stromalnych. W skrócie, skrawki o grubości 5 µm odparafinowano przy użyciu gradientu ksylenu i etano...

W tym protokole, metoda oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP) i izolacja jąder oznaczonych określonymi typami komórek (INTACT) zostały zoptymalizowane pod kątem sparowanego przesłuchania specyficznego dla komórki transkryptomu i epigenomu jajnika przy użyciu mysiego modelu NuTRAP skrzyżowanego z myszą linią Cyp17a1-Cre.

Specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu

Assessing cell-type-specific epigenomic and transcriptomic changes are key to understanding ovarian aging. To this end, the optimization of the ...

Metoda ta zapewnia technikę izolowania kwasów nukleinowych z określonych populacji komórek jajnika od tej samej myszy bez konieczności sortowania komórek. Technika ta może pomóc w określeniu, jak zmieniają się określone populacje komórek w różnych warunkach. Na przykład ze starzeniem się.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na sparowaną analizę epigenomiczną i transkryptomiczną z określonego typu komórek jajnika bez konieczności sortowania komórek. To znacznie zwiększa przepustowość, obniża koszty i eliminuje potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu podczas wykonywania analizy specyficznej dla typu komórki z tkanki jajnikowej. W tym przypadku naszym celem jest zidentyfikowanie zmian specyficznych dla typu komórek, które zachodzą wraz ze starzeniem się jajników przed starzeniem się reprodukcyjnym, co ma implikacje w leczeniu niepłodności kobiet.Metodę tę można zastosować do dowolnego typu komórki w różnych układach ciała, dla których dostępny jest sterownik Cre specyficzny dla typu komórki. Najtrudniejszą częścią tej techniki jest wybór odpowiedniej linii Cre dla interesującego Cię typu komórki. Zalecana jest szeroko zakrojona walidacja swoistości komórkowej.Na początek zbierz jeden jajnik od uśpionej myszy w 500 mikrolitrach buforu do lizy jąder i pokrój jajnik na osiem części w buforze za pomocą samootwierających się mikronożyczek. Przenieś zmielony jajnik i bufor do lizy do szklanego homogenizatora odbijającego na lodzie i homogenizuj jajnik 10 do 20 razy za pomocą luźnego tłuczka A. Dodaj 400 mikrolitrów buforu do lizy do tłuczka do mycia homogenizatora A. A następnie homogenizuj jajnik ciasnym tłuczkiem B 10 do 20 razy. Przenieś homogenat do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem i odwiruj przy 200 g przez 1,5 minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć niezdysocjowaną tkankę i naczynia krwionośne.Po wstępnym zwilżeniu sitka o długości 30 mikrometrów ze 100 mikrolitrami buforu do lizy, przefiltruj supernatant przez sitko do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Przenieść jądra zawierające mieszaninę do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem. Odwirować próbkę o masie 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.Zawiesić osad jąder w 250 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy, krótko wirując z umiarkowaną lub dużą prędkością. Zwiększ objętość do 1,75 mililitra, dodając 1,5 mililitra buforu do lizy. Delikatnie wymieszać i oprzeć zawiesinę jąder na lodzie na pięć minut.Granulować jądra przez odwirowanie w temperaturze 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając osadu jądrowego. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego bufora do przechowywania w niskiej temperaturze i krótko zawirować, aby całkowicie zawiesić osad jądra.Zarezerwować 10% zawieszonego osadu jako wejściową próbkę jąder do dalszej analizy. Wziąć zawieszoną paletę jąder i uzupełnić objętość do dwóch mililitrów lodowatym buforem do oczyszczania jądrowego lub NPB. Dodaj 30 mikrolitrów zawieszonych kulek do każdej próbki do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem.Następnie dodać jeden mililitr NPB i dobrze zawiesić przez pipetowanie. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby oddzielić koraliki. Wyrzuć supernatant i wyjmij rurkę z magnesu.Ponownie zawiesić umyte kulki magnetyczne w jednym mililitrze NPB. Powtórz krok prania, w sumie trzy prania. A po ostatnim praniu ponownie zawieś koraliki w początkowej objętości NPB.Dodać 30 mikrolitrów umytych kulek do dwóch mililitrów zawiesiny jądrowej i dobrze zawiesić mieszaninę jąder kulek, pipetując i delikatnie odwracając probówkę. Umieścić probówki na mieszalniku obrotowym w chłodni lub lodówce na 30 minut przy niskiej prędkości i inkubować próbki wejściowe bez kulek w tych samych warunkach. Umieść probówki z zawiesiną jąder i koralikami na magnesie na trzy minuty, aby oddzielić biotynylowane jądra związane z kulkami streptawidyny od ujemnej frakcji jąder.Usunąć supernatant. Przełóż frakcję ujemną do świeżej dwumililitrowej probówki i zarezerwuj ją na lodzie. Dla każdej probówki z frakcją dodatnią wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś zawartość w jednym mililitrze NPB.Umieść probówkę na magnesie na jedną minutę i wyrzuć supernatant. Zawiesić mieszaninę jąder kulek frakcji dodatniej w 30 mikrolitrach NPB. Przenieść jajnik i 100 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego do szklanego homogenizatora z dnakiem i homogenizować 10 do 20 razy za pomocą luźnego tłuczka A. Dodać 400 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego TRAP do tłuczka do mycia A i przenieść homogenat do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem.Umyj homogenizator dodatkowym mililitrem buforu homogenizacyjnego TRAP i przenieś umytą objętość do dwumililitrowej rurki z okrągłym dnem. Odwirować homogenat o stężeniu 12 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I przenieś oczyszczony supernatant do świeżej dwumililitrowej rurki z okrągłym dnem.Po odrzuceniu osadu przenieś 100 mikrolitrów oczyszczonego homogenatu do świeżej dwumililitrowej rurki z okrągłym dnem i zachowaj go jako wsad na lód. Pozostałą część oczyszczonego homogenatu inkubować z pięcioma mikrogramami na mililitr przeciwciała anty-GFP przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, obracając się w mieszalniku typu end-over-end. Inkubować próbkę wejściową w tych samych warunkach.Przenieś 50 mikrolitrów kulek magnetycznych białka G dla każdej próbki do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania o niskiej zawartości soli do kulek i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Umieść rurkę w stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby zebrać koraliki z boku rurki.Po odrzuceniu supernatantu wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj do niej jeden mililitr buforu do płukania o niskiej zawartości soli. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Ponownie umieść rurkę w stojaku magnetycznym i powtórz ten krok, co daje łącznie trzy prania.Po ostatnim praniu ponownie zawiesić kulki w początkowej objętości bufora do płukania o niskiej zawartości soli. Przenieś ponownie zawieszone umyte kulki do mieszaniny przeciwciał próbki antygenu i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, obracając się w mieszalniku typu end-do-end. Próbki wejściowe należy inkubować przez noc w równoważnych warunkach.Następnie oddziel frakcję dodatnią lub kulki magnetyczne z docelowym rybosomem RNA od frakcji ujemnej lub supernatantu za pomocą podstawki magnetycznej przez 2,5 do 3 minut. Odessać frakcję ujemną. Umieść go w świeżej dwumililitrowej probówce z okrągłym dnem i odłóż na lód.Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania o wysokiej zawartości soli do probówki z frakcją dodatnią i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym utrzymywanym na lodzie przez jedną minutę, aby oddzielić koraliki. Po wyrzuceniu supernatantu wyjmij rurkę z magnesu i powtórz ten krok, w sumie trzy płukania.Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś kulki w 350 mikrolitrach buforu do lizy RNA uzupełnionym 3,5 mikrolitrami 2-merkaptoetanolu. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej, mieszając przez 10 minut przy 900 obr./min w cyfrowym wytrząsarce. Oddziel kulki od roztworu, który zawiera teraz docelowe rybosomy RNA, za pomocą podstawki magnetycznej na jedną minutę w temperaturze pokojowej.Zbierz eluowaną frakcję dodatnią w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Obrazowanie immunofluorescencyjne przeprowadzono na parafinizowanych jajnikach myszy Cyp17-Cre dodatnich NuTRAP flox i Cyp17-Cre-ujemnych NuTRAP flox. Białko EGFP wybarwiono za pomocą koziego przeciwciała pierwszorzędowego anty-GFP i wtórnego przeciwciała anty-koziego osła Alexa 488, a jądra wybarwiono DAPI.Zdjęcia wykonano pod mikroskopem fluorescencyjnym w 20-krotnym powiększeniu. Wejściowy i dodatni frakcji RNA TRAP wyizolowano z jajników myszy Cyp17-Cre-dodatnich NuTRAP flox i zsekwencjonowano w sparowany sposób końcowy. Analiza głównych składowych wszystkich ulegających ekspresji genów wykazała oddzielenie frakcji wejściowej TRAP i dodatniej w pierwszym składniku.Wykres wulkaniczny genów o zróżnicowanej ekspresji między frakcją wejściową a frakcją dodatnią jest pokazany tutaj. Porównanie frakcji dodatniej TRAP z danymi wejściowymi wykazało ogólne wzbogacenie genów markera komórek zrębu/osłonki oraz zubożenie genów markera komórek oocytów, ziarnistości, układu odpornościowego i komórek mięśni gładkich we frakcji dodatniej TRAP. Po pierwszym odwirowaniu zawiesiny jądrowej w celu usunięcia niezdysocjowanych naczyń krwionośnych, jądra znajdują się w supernatancie.Upewnij się, że zachowałeś supernatant i wyrzuć osad w tym momencie. Podążając za nienaruszoną metodą, można przeprowadzić kilka technik epigenomicznych, w tym między innymi testy dostępności chromatyny lub modyfikacji DNA. Stosując metodę TRAP, można przeprowadzić sekwencjonowanie RT-qCPR lub RNA w celu oceny translatomii.Jest to pierwsze zastosowanie metody NuTRAP w jajniku myszy. Pozwala to na wysokoprzepustową analizę epigenomiczną i transkryptomiczną określonych typów komórek jajnika, które mogą być wykorzystane do badania starzenia się jajników lub raka.

cell-specific-paired-interrogation-mouse-ovarian-epigenome

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Mutageneza z użyciem pirosiarczynu jest złotym standardem analizy metylacji DNA. Nasz zmodyfikowany protokół umożliwia analizę metylacji DNA na poziomie pojedynczych komórek i został zaprojektowany specjalnie dla poszczególnych oocytów. Może być on również stosowany w przypadku embrionów w stadium przedziałowym.

Mutageneza z użyciem pirosiarczynu w pojedynczych oocytach

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania pęcherzyków w hodowanych jajnikach młodych myszy bez seryjnego cięcia. Stosując immunofluorescencję całego narządu i oczyszczanie tkanek, cięcie fizyczne zastępuje się cięciem optycznym. Ta metoda przygotowania i wizualizacji próbek utrzymuje integralność narządów i ułatwia automatyczną ocenę ilościową określonych komórek.

Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania całych jajników do analiz ilościowych i jakościowych przy użyciu barwienia immunologicznego z całą mocą, mikroskopii wielofotonowej oraz wizualizacji i analizy 3D. Protokół ten umożliwia wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które ma zastosowanie w toksykologii, diagnostyce klinicznej i testach genomowych funkcji jajników.

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Przedstawiono metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, która pozwala na pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Ponadto opisano nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodowych. Metody te są odpowiednie do późniejszej analizy genów i białek funkcjonalnie różnych segmentów jajowodów i zdysocjowanych komórek jajowodowych.

Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Poznaj metodę NuTRAP do sparowanej analizy epigenomu i transkryptomu komórek jajnika myszy bez sortowania komórek. Ta technika umożliwia badanie zmian związanych ze starzeniem się jajników.

Specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu

Przeglądaj więcej filmów