Name: Ludzki model organoidowy przeszczepu komórek nerwowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj protokół przeszczepu i śledzenia komórek nerwowych w ludzkich organoidach mózgowych. Ta metoda umożliwia długoterminową ocenę wszczepienia komórek in vitro oraz testowanie różnych leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Fundusze na tę pracę zostały dostarczone przez fundusze filantropijne IRIC z fundacji Marcelle i Jean Coutu oraz z Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. otrzymuje wsparcie płacowe od FRQS w postaci stypendium Chercheurs-boursiers Junior 1 (#283502). M.I.I.R. był wspierany przez IRIC Doctoral Award od Institut of Research in Immunology and Cancer, a Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat z Uniwersytetu w Montrealu oraz Bourse de Mérite aux cycles supérieurs.

<ol><li>Spurlock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+penetrating+ballistic-like+brain+injury+induced+cognitive+deficits+after+neuronal+differentiation+of+transplanted+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Amelioration of penetrating ballistic-like brain injury induced cognitive deficits after neuronal differentiation of transplanted human neural stem cells.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (11), 1981(2017).</li>
<li>Zhou, Y., Shao, A., Xu, W., Wu, H., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+of+stem+cell+treatment+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Advance of stem cell treatment for traumatic brain injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 301(2019).</li>
<li>Hayashi, Y., Lin, H. -T., Lee, C. -C., Tsai, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neural+stem+cell+transplantation+in+Alzheimer%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models.</a> Journal of Biomedical Science. 27 (1), 29(2020).</li>
<li>Kefalopoulou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+clinical+outcome+of+fetal+cell+transplantation+for+Parkinson+disease%3A+Two+case+reports%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: Two case reports.</a> JAMA Neurology. 71 (1), 83-87 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+graft-derived+dopaminergic+innervation+is+maintained+24+years+after+transplantation+in+the+degenerating+parkinsonian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensive graft-derived dopaminergic innervation is maintained 24 years after transplantation in the degenerating parkinsonian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (23), 6544-6549 (2016).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+Kyoto+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">iPS cell-based therapy for Parkinson's disease: A Kyoto trial.</a> Regenerative Therapy. 13, 18-22 (2020).</li>
<li>Krause, M., Phan, T. G., Ma, H., Sobey, C. G., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapies+for+stroke%3A+Are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapies for stroke: Are we there yet.</a> Frontiers in Neurology. 10, 656(2019).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+Growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: Growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+neural+stem+cells+to+model+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Using human neural stem cells to model neurological disease.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+vulnerability+and+responses+to+stressors+between+human+and+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of vulnerability and responses to stressors between human and mouse astrocytes.</a> Nature Communications. 12 (1), 3958(2021).</li>
<li>Morizane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+matching+improves+engraftment+of+iPSC-derived+neurons+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MHC matching improves engraftment of iPSC-derived neurons in non-human primates.</a> Nature Communications. 8 (1), 385(2017).</li>
<li>Khrameeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+transcriptome+map+of+human%2C+chimpanzee%2C+bonobo%2C+and+macaque+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution transcriptome map of human, chimpanzee, bonobo, and macaque brains.</a> Genome Research. 30 (5), 776-789 (2020).</li>
<li>Powell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+brains%3A+The+ethics+of+transplanting+human+neurons+into+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hybrid brains: The ethics of transplanting human neurons into animals.</a> Nature. 608 (7921), 22-25 (2022).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>García-Delgado, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+to+evaluate+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Brain organoids to evaluate cellular therapies.</a> Animals. 12 (22), (2022).</li>
<li>Lin, J. -R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+single+cells+using+a+high-throughput+cyclic+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method.</a> Nature Communications. 6 (1), 8390(2015).</li>
<li>Knapp, D. J. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+identifies+a+CD33%2B+subset+of+human+cord+blood+cells+with+high+regenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).</li>
<li>Georgala, P. A., Carr, C. B., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax6+in+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of Pax6 in forebrain development.</a> Developmental Neurobiology. 71 (8), 690-709 (2011).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+G2019S-LRRK2+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+3D+midbrain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling G2019S-LRRK2 sporadic Parkinson's disease in 3D midbrain organoids.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 518-531 (2019).</li>
<li>Smits, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Parkinson%27s+disease+in+midbrain-like+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids.</a> NPJ Parkinson's Disease. 5, 5(2019).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-I-interferon+signaling+drives+microglial+dysfunction+and+senescence+in+human+iPSC+models+of+Down+syndrome+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease.</a> Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).</li>
<li>Sun, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, e76707(2022).</li>
<li>Popova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+states+are+conserved+across+experimental+models+and+regulate+neural+stem+cell+responses+in+chimeric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).</li>
<li>Wang, S., Li, B., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+fluorophores+for+deep-tissue+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging.</a> ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Biorąc pod uwagę duże zainteresowanie podejściami do terapii komórkowej w leczeniu urazów OUN/zaburzeń neurodegeneracyjnych 1,2,3,4,5,6,7,8, modele funkcji komórek w warunkach przeszczepu zyskują na znaczeniu. W pracy przedstawiono metodę przeszczepiania znakowanych, ludzkich NPC do ludzkich organoidów mózgowych, wraz ze śledzeniem ich żywych komórek i oceną punktu końcowego za pomocą histologii i barwienia immunofluorescencyjnego. Co ważne, wykazaliśmy, że przeszczepione komórki były zdolne do migracji, różnicowania i długotrwałego (4 miesiące) utrzymywania się w środowisku organoidowym. Taka długotrwała trwałość stanowi wyraźny wzrost w stosunku do możliwości utrzymania kultur wycinków mózgu17. System ten jest zatem odpowiedni do badania wielu zachowań, które trzeba byłoby ocenić w potencjalnym otoczeniu terapeutycznym, takich jak przeżycie, proliferacja i różnicowanie. Rzeczywiście, badanie ortogonalne wykazało niedawno, że przeszczepione NPC zachowywały się podobnie w organoidach mózgowych w porównaniu z NPC przeszczepionymi do mózgów myszy NSG20, potwierdzając w ten sposób użyteczność organoidów jako biorcy przeszczepu. Ponieważ jest to system in vitro, łatwo jest również dodać cytokiny lub interesujące go leki. Można to wykorzystać do lepszego zrozumienia wpływu określonych środowisk, takich jak stan zapalny i leki immunosupresyjne, na przeszczepione komórki, aby jeszcze bardziej naśladować to, co mogą napotkać w środowisku terapeutycznym. Zademonstrowany przez nas protokół cyklicznej immunofluorescencji (w oparciu o wcześniejsze badania21) jeszcze bardziej rozszerza moc tego podejścia, umożliwiając jednoczesną ocenę szerokiego wachlarza markerów specyficznych dla linii i, potencjalnie, choroby w jednym przekroju, a tym samym umożliwiając dokładne śledzenie przeszczepionych komórek i ich wpływu na tkankę. Oczywiście zamiast tego można zastosować inne metody oceny punktów końcowych, w zależności od celów analizy. Na przykład oczyszczanie tkanek z rekonstrukcją 3D może być stosowane, jeśli morfologia komórek jest głównym zainteresowaniem, lub dysocjacja, po której następuje cytometria przepływowa, może być zastosowana, jeśli celem końcowym jest kwantyfikacja określonych typów komórek. Spodziewamy się, że metoda ta będzie łatwo rozszerzalna na inne typy komórek, takie jak guzy OUN, potencjalnie umożliwiając ich badanie w kontekście istotnym dla mikrośrodowiska. Podobnie, organoidy wykorzystywane jako biorcy mogą być wymieniane na organoidy modelowechoroby 25,26,27, co potencjalnie pozwala na modelowanie metod transplantacji w tych stanach.
Jak wszystkie modele, również ten prezentowany tutaj ma swoje ograniczenia. Po pierwsze, organoidy pochodzące z iPSC są niedojrzałerozwojowo19 , a zatem mają istotne różnice w porównaniu ze starzejącym się mózgiem, w którym objawia się wiele chorób neurodegeneracyjnych. Organoidy mózgowe są również niejednorodne w rozwoju19, co wyklucza konsekwentne wstrzykiwanie do tej samej dokładnie fizjologicznej niszy. Co więcej, chociaż zawierają typy komórek odpowiednich regionów mózgu18, 19, brakuje im składników śródbłonka, mikrogleju i układu odpornościowego, które są również ważne w warunkach in vivo 14. Ogranicza to badanie, jak gospodarz zareaguje na przeszczep komórek. Obecnie dostępne są techniki dodawania komórek naczyniowych28 imikrogleju 29 , a także zwiększania konsystencji organoidów i regionalizacji18, poprawiając w ten sposób moc modelowania systemu przeszczepiania organoidów. Wymagałyby one jednak dalszych testów i optymalizacji wykraczających poza to, co zostało tutaj przedstawione. Chociaż protokół ten jest niedrogi i nie wymaga specjalistycznego sprzętu, pozostaje wiele ważnych kwestii technicznych - na przykład głębokość wtrysku. Wynika to zarówno z faktu, że organoidy nie są perfundowane, a zatem często mają nekrotyczne centrum, jeśli rosną zbyt duże19 , a światło nie może przeniknąć przez rdzeń organoidu w celu śledzenia żywych komórek. W ten sposób komórki, które zostały wstrzyknięte zbyt głęboko, i kolonie, które migrowały do środka, mogą zostać pominięte. Chociaż można to poprawić poprzez zastosowanie fluoroforów o większej długości fali o lepszej penetracji tkanek30, w zależności od wielkości organoidu i aparatury wykrywającej, prawdopodobnie pozostanie to brane pod uwagę. Wreszcie, ponieważ organoidy mózgowe są w fazie rozwoju, czas przeszczepu jest kolejnym kluczowym czynnikiem, ponieważ środowisko prawdopodobnie będzie się różnić w zależności od etapu rozwoju organoidu, do którego jest wstrzykiwany. Chociaż można to do pewnego stopnia kontrolować, zapewniając stały wiek organoidów w momencie wstrzyknięcia, jest to bez wątpienia czynnik, który wymaga rozważenia.
Protokół ten jest niedrogi, prosty, wolny od zwierząt i nie wymaga specjalistycznego sprzętu, dzięki czemu modelowanie przeszczepów jest dostępne dla szerszej gamy laboratoriów. Biorąc pod uwagę szybkie tempo postępu zarówno w terapii komórek nerwowych, jak i systemach modelowych organoidów, przewidujemy, że przedstawiony tutaj protokół przeszczepu organoidów będzie użytecznym modelem dla szeregu chorób i podejść terapeutycznych.

Ludzki mózg to złożony organ złożony z wielu typów komórek linii nerwowej i glejowej. Razem tworzą one wyrafinowaną sieć, która daje początek poznaniu. Istnieje duże zainteresowanie przeszczepianiem komórek do tego układu w leczeniu wielu różnych zaburzeń neurologicznych, w tym urazowego uszkodzenia mózgu (TBI)1,2, zaburzenia neurodegeneracyjne3,4,5,6,7, oraz stroke8. Jednym z głównych ograniczeń w rozwoju takich strategii jest jednak względny niedostatek dostępnych modeli przedklinicznych do określenia oczekiwanych wyników przeszczepu. Obecnie najczęściej stosowanymi modelami są metody hodowli in vitro w celu określenia potencjału komórkowego i ksenotransplantacji u myszy. Podczas gdy metody hodowli komórkowych mogą oceniać potencjał różnicowania i samoodnawiania9, są one wykonywane w optymalnych warunkach wzrostu, które nie naśladują mikrośrodowiska, z którym komórki zetknęłyby się w kontekście przeszczepu. Co więcej, sposób, w jaki komórki są hodowane, może wpływać na ich zachowanie10.
Mózgi myszy zawierają wszystkie komórki mikrośrodowiska i dlatego są niezwykle potężnymi systemami modelowymi do transplantacji11. Istnieją jednak istotne różnice między korą myszą a ludzką korą12,13 i nie wszystkie czynniki wzrostu reagują krzyżowo między gatunkami. Modele naczelnych są bliższą alternatywą, która lepiej naśladuje ludzki system i przyniosła również ważne wyniki przedkliniczne14. Jednak nawet ci bliżej spokrewnieni krewni zachowują istotne różnice w swoim składzie komórkowym15. Chociaż oba te systemy modelowe dostarczają cennych informacji na temat zachowania komórek podczas przeszczepu i zawierają elementy chirurgiczne ewentualnej terapii, pozostają niedoskonałe. Są one również kosztowne i trudne technicznie (np. trzeba przeprowadzić operację mózgu na zwierzętach), co ogranicza możliwą przepustowość. Co więcej, istnieje mnóstwo problemów etycznych związanych z przeszczepianiem ludzkich komórek mózgowych zwierzętom16. Hodowle wycinkowe mózgu pozwalają na wycięcie jednego mózgu i wykorzystanie go do wielu zabiegów, usuwając w ten sposób niektóre ograniczenia przeszczepów zwierząt; Mają one jednak ograniczoną żywotność (tygodnie), nadal pochodzą od zwierząt i (będąc cienkim plasterkiem) nie mają wystarczającej integralności objętości/powierzchni, aby naśladować wstrzykiwanie komórek17. W związku z tym nadal istnieje istotna luka między modelami stricte hodowlanymi/potencjalnymi a przeszczepami in vivo.
Organoidy mózgowe to model in vitro zawierający główne typy komórek nerwowych obecnych w mózgu i mogą być generowane w dużych ilościach z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)18,19. Takie organoidy zapewniają zatem kontekst komórkowy, który może umożliwić ocenę zdolności funkcjonalnej komórki testowej będącej przedmiotem zainteresowania w warunkach przeszczepu. Rzeczywiście, niedawne badanie wykazało, że neuronalne komórki progenitorowe (NPC) przeszczepione do ludzkich organoidów mózgowych przeżywają, namnażają się i różnicują podobnie jak NPC przeszczepione do mózgu myszy z niedoborem odporności (NSG) z niedoborem odporności (NSG) class<="xref">20. Organoidy mózgowe stanowią zatem wolny od okrucieństwa, długowieczny (>6 miesięcy), opłacalny system, który wychwytuje typy komórek ludzkiego mózgu. W związku z tym mogą one stanowić idealnego biorcę przeszczepu do wczesnego etapu testowania zdolności regeneracyjnych komórek nerwowych.
Ten artykuł przedstawia protokół przeszczepiania i późniejszego śledzenia oznakowanych ludzkich NPC do ludzkich organoidów mózgowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Rozpoczyna się to od wstrzyknięcia NPC znakowanych GFP do dojrzałych (2-4 miesięcznych) organoidów mózgowych18. Przeszczepione komórki są następnie poddawane mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek przez okres 4 miesięcy. W tym czasie pokazujemy zarówno trwałość komórek w miejscu wstrzyknięcia, jak i migrację do dystalnych obszarów organoidu. Na punkcie końcowym demonstrujemy pobieranie, barwienie i obrazowanie antygenu skrawków histologicznych pochodzących z tych organoidów, w tym protokół wygaszania istniejących barwników na bazie AlexaFluor, aby umożliwić dodatkowe rundy barwienia i obrazowania, w oparciu o poprzednie prace21. Protokół ten może być zatem przydatny w pomiarze zdolności różnicowania komórek w warunkach przeszczepu, trwałości przeszczepu, ekspansji komórek in situ i migracji komórek z miejsca przeszczepu. Przewidujemy, że będzie to przydatne zarówno w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej/terapii komórkowej, jak i w modelowaniu nowotworów poprzez wszczepianie komórek nowotworowych do odpowiednich organoidów specyficznych dla regionu.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>mieszanka enzymów proteolityczno-kolagenolitycznych</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-MAP2 (klon SMI 52)</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 przeciwciało anty-GFAP (klon SMI 25)</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anty-Nestin (klon 10C2)</td><td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 antytubulina &beta; 3 (TUBB3) (klon TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat kwasu cytrynowego</td><td>Fisher Chemical</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytacja 5 Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowy</td> Biotek-Denaturowany <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>alkohol etylowy (bezwodny)</td><td>ChapTec-DMEM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F12/ Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil Sulfoxide (DMSO), Sterylny</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, buforowany obojętnie, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica Biosystems-Matrigel</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Growth Factor Reduced (GFR)</td><td>Corning</td><td>356231</td> Ostrze mikrotomu MX35 <td>bez czerwieni fenolu i LDEV</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Epredia&nbsp;</td><td></td><td></td>3053835</tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma 655104</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca -Mg)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor Dichlorowodorku Puromycyny</td><td>Thermo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; Formy bazowe ze stali nierdzewnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; UNISETTE Przetwarzanie/Osadzanie biopsji Kaseta</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Zestaw do różnicowania neuronów przodomózgowia</td><td>StemCell Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neuron Progenitor Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do indukcji neuronów STEMdiff SMADi</td><td>StemCell Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Tissue</td><td></td></tr> <tr><td>Prep</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&nbsp; Procesor tkanek AI</td><td>Sakura Finetek-Toluen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(histologiczny)</td><td>ChapTec-Trypan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>niebieski; 0.4% (wt/vol)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

ludzki model organoidowy przeszczepu komórek nerwowych

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

Postęp metod przeszczepiania komórek wymaga systemów modelowych, które pozwalają na dokładną ocenę potencjału funkcjonalnego przeszczepionych komórek. W przypadku ośrodkowego układu nerwowego, chociaż ksenotransplantacja pozostaje najnowocześniejsza, takie modele są technicznie trudne, mają ograniczoną przepustowość i są drogie. Co więcej, obecne sygnały środowiskowe nie reagują idealnie krzyżowo z komórkami ludzkimi. W artykule przedstawiono niedrogi, dostępny i kompatybilny z wysoką przepustowością model przeszczepiania i śledzenia ludzkich komórek nerwowych do ludzkich organoidów mózgowych. Te organoidy można łatwo wytworzyć z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą komercyjnych zestawów i zawierają kluczowe typy komórek mózgu. 
Najpierw demonstrujemy ten protokół przeszczepu poprzez wstrzyknięcie do tych organoidów ludzkich komórek progenitorowych pochodzących z iPSC znakowanych EGFP. Następnie omawiamy rozważania dotyczące śledzenia wzrostu tych komórek w organoidzie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek i demonstrujemy śledzenie przeszczepionych NPC znakowanych EGFP w organoidzie przez okres 4 miesięcy. Na koniec przedstawiamy protokół cięcia, cyklicznego barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania przeszczepionych komórek w ich lokalnym kontekście. Przedstawiony tutaj model przeszczepu organoidów pozwala na długoterminowe (co najmniej 4 miesiące) śledzenie przeszczepionych komórek ludzkich bezpośrednio w ludzkim mikrośrodowisku za pomocą niedrogiego i prostego do wykonania protokołu. Stanowi zatem użyteczny model zarówno w terapiach komórek nerwowych (przeszczepach), jak i, prawdopodobnie, w modelowaniu nowotworów ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w sposób bardziej dokładny mikrośrodowiskowo.

W celu walidacji tożsamości organoidów mózgowych, przekroje histologiczne dojrzałego (2-miesięcznego) organoidu mózgowego barwiono pod kątem PAX6 (markera grzbietowych NPC23) oraz SATB2 (markera dojrzałych, postmitotycznych neuronów warstw górnych24). Zgodnie z oczekiwaniami, komórki PAX6+ znajdowały się we wnętrzu organoidu, a komórki SATB2+ w warstwach górnych (Rysunek 2). Wyniki te potwierdzają, że użyte organoidy mózgowe rzeczywiście odpowiadały grzbietowej części przedmózgowia, zgodnie ze specyfikacją zestawu do różnicowania. Aby ustalić zależność od dawki w systemie transplantacji organoidów mózgowych, do 2-miesięcznych organoidów mózgowych wstrzykiwano zwiększającą się liczbę EGFP+ NPC pochodzących z iPSC. Stwierdzono wyraźną zależność fluorescencji GFP od liczby wprowadzonych komórek, przy czym spójne skupiska komórek EGFP+ wykrywano przy liczbie 10 000 komórek i więcej (Rysunek 3). Następnie oceniono przeżywalność i migrację przeszczepionych NPC, śledząc transplantowane organoidy w czasie. W tym celu 50 000 EGFP+ NPC pochodzących z iPSC przeszczepiono do 2-3 miesięcznych organoidów mózgowych wygenerowanych z tej samej linii iPSC. Wstrzyknięte organoidy oraz kontrole obrazowano pod kątem obecności EGFP w określonych punktach czasowych w ciągu następnych 3-4 miesięcy. W tej serii transplantacji zaobserwowano utrzymywanie się miejsca wstrzyknięcia przez cały 4-miesięczny okres śledzenia (Rysunek 4A). Dodatkowe skupiska komórek EGFP+ pojawiły się do 9. dnia po transplantacji i utrzymywały się do końca badania (3-4 miesiące w zależności od organoidu), co wskazuje na migrację komórek i ich integrację w nowych miejscach (Rysunek 4A). Przy większym powiększeniu widoczna była wyraźna morfologia neuronalna z długimi wypustkami wnikającymi w organoid (Rysunek 4B), co potwierdza integrację wstrzykniętych komórek.
Aby określić status różnicowania wstrzykniętych komórek w późnym okresie po iniekcji, organoid śledzony przez 4 miesiące oraz jego kontrolę utrwalono, zatopiono w parafinie, pocięto na plastry o grubości 15 µm i osadzono na szkiełkach przedmiotowych. Następnie plastry poddano obróbce i barwieniu w jednej rundzie barwienia fluorescencyjnego (EGFP, TUJ1, NESTIN) lub w dwóch następujących po sobie cyklach barwienia w celu dodania dodatkowych markerów (MAP2, GFAP). Wstępne barwienie w jednej rundzie potwierdziło obecność komórek EGFP+ w miejscu wstrzyknięcia, w tym mieszankę komórek zachowujących status NPC (NESTIN+TUJ1−) oraz tych, które zróżnicowały się w kierunku linii neuronalnej (NESTIN−TUJ1+) (Rycina 5). Zarówno w organoidach kontrolnych, jak i wstrzykniętych, zaobserwowano bardzo niewiele NPC NESTIN+ (większość, choć nie wszystkie, stanowiły EGFP+ przeszczepione NPC w miejscu wstrzyknięcia), przy przewadze niedojrzałych i dojrzałych neuronów TUJ1+ (Rycina 5). Barwienie dwurundowe dostarczyło więcej szczegółów, ujawniając dojrzałe neurony (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) wokół większości zewnętrznego regionu organoidu, z obszarami neuronów niedojrzałych (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) w kierunku środka (Rycina 6A,B). Astrocyty (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) były obecne zarówno w organoidach wstrzykniętych, jak i kontrolnych oraz znajdowały się rozproszone wokół zewnętrznych krawędzi (Rycina 6A,B). Przekrój organoidu wstrzykniętego, w którym wykonano barwienie dwurundowe, wykazał obecność małej kolonii satelitarnej komórek EGFP+ daleko od miejsca wstrzyknięcia, które przyjęły fenotyp dojrzałych neuronów (Rycina 6B,C). Niektóre z nich zdawały się znajdować w bliskim sąsiedztwie astrocytów; jednak nie stwierdzono komórek EGFP+ z pełnym pokryciem z barwieniem GFAP, co sugeruje, że znajdowały się one obok astrocytów, a nie same je generowały (Rycina 6B,C).
<img alt="Organoidy grzbietowej części przedmózgowia: iniekcja komórek GFP, mikroskopia, obrazowanie żywych komórek, immunofluorescencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1Model transplantacji znakowanych komórek do organoidów mózgu. Schematyczny przegląd procesu generowania komórek znakowanych poprzez transdukcję lentiwirusową, ich transplantacji do organoidów mózgowych oraz śledzenia za pomocą obrazowania żywych komórek i immunofluorescencji. Skrót: GFP = zielone białko fluorescencyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; barwienie na DNA, PAX6, SATB2; analiza kolokalizacji markerów komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Immunofluorescencja przekrojów histologicznych ukazująca architekturę wczesnych i późnych organoidów. Organoid mózgowy w wieku 2 miesięcy został utrwalony, zatopiony w parafinie, pocięty i zabarwiony na PAX6, SATB2 oraz DAPI. Niezabarwiony przekrój posłużył do ustawienia czasu ekspozycji i czasu całkowania, aby uniknąć fałszywie dodatnich sygnałów wynikających z autofluorescencji. Komórki PAX6+ znajdowały się wewnątrz organoidu, natomiast komórki SATB2+ występowały w warstwach zewnętrznych. Obrazy w stosie Z (Z-stack) pobierano co 4.2 µm przez cały 15 µm przekrój tkanki. Przekroje optyczne połączono za pomocą funkcji focus stacking w oprogramowaniu Gen5 z ustawieniami domyślnymi. Paski skali = 100 µm. Skróty: PAX6 = białko paired box 6; SATB2 = special AT-rich sequence-binding protein 2; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wpływ liczby komórek na pobieranie barwnika; obrazy mikroskopowe pokazujące zmienną gęstość komórek, wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zależny od dawki zasiedlenie NPC w organoidach mózgowych. W organoidach przeszczepiono 0 (kontrola negatywna), 1 000, 5 000, 10 000 lub 50 000 GFP+ NPC pochodzących z iPSC. W 1. tygodniu po transplantacji organoidy obrazowano na urządzeniu Cytation 5 z użyciem kostki filtrów GFP. Kontrolę negatywną wykorzystano do ustawienia czasu naświetlania i integracji w celu zminimalizowania autofluorescencji. Ciemniejsze kolory wskazują na silniejszą fluorescencję EGFP w stosunku do kontroli negatywnej. Paski skali = 100 µm. Przedstawione są obrazy całych organoidów w powiększeniu 4x. Po obrazowaniu, przed wyświetleniem, wykonano odejmowanie tła metodą toczącej się kuli (rolling-ball) z promieniem piksela równym 50, aby skorygować zmienną intensywność tła w obrębie organoidów. Miejsca wstrzyknięcia, zidentyfikowane jako obszary najsilniejszego zasiedlenia, zaznaczono czerwoną strzałką w przypadkach, w których wystąpiło zasiedlenie. Skróty: NPC = neural progenitor cells; GFP = green fluorescent protein; EGFP = enhanced GFP; iPSC = induced pluripotent stem cell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki transplantacji komórek pokazujące wzrost przeszczepionych komórek na przestrzeni tygodni; obrazy mikroskopowe, skala 100 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Śledzenie wzrostu, migracji i przeżywalności przeszczepionych komórek za pomocą obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek. (A) Organoidy kontrolne i transplantowane (50 000 GFP+ NPC pochodzących z iPSC) były monitorowane za pomocą fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek w okresie od 2 do 4 miesięcy w dwóch niezależnych zestawach transplantacji. Organoidy kontrolne negatywne posłużyły do ustawienia czasu ekspozycji i integracji w celu zminimalizowania autofluorescencji w każdym punkcie czasowym. Obrazy EGFP rejestrowano przy użyciu kostki filtrów GFP na urządzeniu Cytation 5 we wskazanych odstępach czasu po transplantacji. Ciemniejsze kolory wskazują na silniejszą fluorescencję EGFP w stosunku do kontroli negatywnej dla danego punktu czasowego. Przed wyświetleniem wykonano odejmowanie tła metodą toczącej się kuli (rolling-ball) z promieniem piksela wynoszącym 50, aby skorygować zmienną intensywność tła w organoidach. Organoidy umieszczano w zbliżonej orientacji w każdym punkcie czasowym, a obrazy obrócono w celu zapewnienia spójności prezentacji i wyraźnego pokazania wzrostu przeszczepionych komórek. Miejsca iniekcji, zidentyfikowane jako regiony o najwyższym stopniu przyjęcia przeszczepu w najwcześniejszym punkcie czasowym, są zaznaczone czerwoną strzałką. Przykład organoidu kontrolnego negatywnego znajduje się w dolnej części rysunku. (B) Przedstawiono przykładowe obrazy z powiększeniem 20x z organoidów z przyjętym przeszczepem w 1. i 15. tygodniu po transplantacji. Przed wyświetleniem zwiększono lokalny kontrast za pomocą programu FIJI, aby zapewnić widoczność neurytów. Paski skali = 100 µm. Skróty: NPCs = neural progenitor cells; GFP = green fluorescent protein; EGFP = enhanced GFP; iPSC = induced pluripotent stem cell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna wstrzyknięcia organoidu; markery DNA, GFP, NESTIN, TUJ1; analiza porównawcza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Immunofluorescencja przekrojów histologicznych ujawniająca obecność przeszczepionych NPC w miejscu wstrzyknięcia wraz z migracją i różnicowaniem neuronalnym. Jednokanałowe obrazy fluorescencyjne z (A) niewstrzykniętych i (B) przeszczepionych organoidów. Nałożony obraz po prawej stronie pokazuje trzy interesujące kanały (NESTIN, TUJ1 oraz EGFP), ale nie obejmuje DAPI. Minimalne poziomy wyświetlania ustawiono tak, aby wykluczyć sygnał z komórek negatywnych (wyznaczone dla EGFP na podstawie kontroli niewstrzykniętej, a dla pozostałych kanałów na podstawie znanych kombinacji markerów). Maksymalne poziomy wyświetlania oparto na najwyższym sygnale zaobserwowanym dla danego przeciwciała w dowolnej komórce. Zakresy wyświetlania pozostawiono stałe pomiędzy organoidami niewstrzykniętymi a przeszczepionymi, aby umożliwić bezpośrednie porównanie. Paski skali = 100 µm. Skróty: NPCs = neural progenitor cells; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TUJ1 = beta-III tubulin; EGFP = enhanced green fluorescent protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna DNA, GFP, MAP2, GFAP; schemat rejestracji obrazów; analiza komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Ocena stanu różnicowania i lokalizacji przeszczepionych komórek za pomocą cyklicznej immunofluorescencji przekrojów histologicznych. Przedstawiono jednokanałowe obrazy fluorescencyjne z organoidów nieiniekcyjnych, (A) dobranych wiekowo oraz (B) przeszczepionych dla pierwszej i drugiej rundy barwienia, zgodnie z oznaczeniami. Minimalne wartości wyświetlania ustawiono tak, aby wykluczyć sygnał z komórek negatywnych (określono dla EGFP na podstawie kontroli nieiniekcyjnej, a dla pozostałych kanałów na podstawie znanych kombinacji markerów). Maksymalne wartości wyświetlania oparto na najwyższym sygnale zaobserwowanym dla danego przeciwciała w dowolnej komórce. Zakresy wyświetlania (a oczywiście parametry obrazowania) pozostawiono stałe pomiędzy organoidami kontrolnymi a iniekcyjnymi, aby umożliwić bezpośrednie porównanie. Paski skali = 100 µm. Po prawej stronie przedstawiono obraz nałożony (z wyłączeniem DAPI) dla każdej rundy barwienia dla każdego organoidu. (B) W przypadku organoidu iniekcyjnego, w którym przeprowadzono rejestrację obrazów, wszystkie obrazy zostały przycięte do obszaru zaobserwowanego w obu rundach barwienia. (B,C) Dla organoidu iniekcyjnego obszary komórek EGFP+ obramowano na niebiesko. Schemat wykorzystania DAPI do dopasowania cech podczas rejestracji obrazów przedstawiono w (C), a następnie ogólny obraz scalony zarejestrowanego obrazu. Skróty: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TUJ1 = beta-III tubulin; EGFP = enhanced green fluorescent protein; MAP2 = microtubule-associated protein 2; GFAP = glial fibrillary acidic protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td></td>
			<td>Klon</td>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>Stężenie</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Przeciwciało anty-NESTIN</td>
			<td>10C2</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1:2 000</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Przeciwciało anty-TUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1:2 000</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Przeciwciało anty-GFP</td>
			<td>FM264G</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1:200</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Przeciwciało anty-GFAP</td>
			<td>SMI 25</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1:500</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Przeciwciało anty-MAP2</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1:1 000</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Przeciwciało anty-PAX6</td>
			<td>O18-1330</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1:100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Przeciwciało anty-SATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1:500</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Stężenia przeciwciał do barwienia. Skróty: TUBB3 = beta-tubulina III; GFP = zielone białko fluorescencyjne; GFAP = kwaśne białko włókienstwie glejowe; MAP2 = białko towarzyszące mikrotubulom 2; PAX6 = białko paired box 6; SATB2 = specjalne białko wiążące sekwencje bogate w AT 2.

Tutaj opisujemy protokół przeszczepu i śledzenia oznakowanych komórek nerwowych do ludzkich organoidów mózgowych.

Ludzki model organoidowy przeszczepu komórek nerwowych

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

Wraz z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkowymi potrzebne są nowe metody oceny funkcjonalności tych komórek. Protokół ten umożliwia długoterminową ocenę in vitro tych przeszczepów komórkowych w kontekście neuronalnym. Główną zaletą tej techniki jest to, że wszystkie składniki pochodzą od człowieka.Ponadto wszczepienie można łatwo śledzić, a środowisko z organoidu można łatwo zmienić, co pozwala na testowanie różnych leków lub rodzajów leczenia. Technikę tę zademonstruje Iliana Ibanez, utalentowana doktorantka w moim laboratorium. Zacznij od usunięcia z lodu zawiesiny pojedynczej komórki indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z iPSC lub NPC i odwirowania ich w sile 300 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 miligramach na mililitr rozpuszczonej matrycy błony podstawnej, aby uzyskać końcową objętość dwóch mikrolitrów na wstrzyknięcie. Zawiesinę należy natychmiast odłożyć z powrotem na lód do czasu użycia. Przenieś wstępnie schłodzoną strzykawkę z zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza do wiadra z lodem w celu dalszego użycia.Następnie wyjmij płytkę organoidu mózgowego z inkubatora i przenieś organoid do 35-milimetrowej płytki za pomocą końcówki o szerokim otworze. Aby ustabilizować organoidy i ułatwić wstrzyknięcie, należy usunąć pożywkę w jak największym stopniu, nie uszkadzając organoidu. Umieścić 35-milimetrową szalkę zawierającą organoid pod mikroskopem preparacyjnym, aby ułatwić wstrzyknięcie.Gdy organoidy będą gotowe do wstrzyknięcia, delikatnie ponownie zawieś komórki NPC oznaczone EGFP za pomocą schłodzonej końcówki pipety P20 i przenieś dwa mikrolitry tych komórek na wstępnie schłodzone sterylne szkiełko podstawowe. Weź z lodu ampułkostrzykawkę insulinową i powoli nabierz 2 mikrolitry zawiesiny komórkowej skosem igły skierowanym w dół. Otwórz pokrywę naczynia zawierającego organoid przed ustawieniem na nim ostrości mikroskopu.Przytrzymaj naczynie jedną ręką, umieść skos igły do góry. A drugą ręką powoli wstrzyknij komórkę w powierzchnię organoidu. Po wstrzyknięciu komórek umieść pokrywkę z powrotem w naczyniu i inkubuj wstrzyknięty organoid przez jedną do dwóch minut.Następnie delikatnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki organoidowej do płytki przed przeniesieniem organoidu do 24-dołkowej płytki z końcówką o szerokim otworze. Inkubuj organoid w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, całkowicie zmieniając pożywkę co drugi dzień. Załadować organoid bez iniekcji lub organoid kontroli ujemnej do mikroskopu fluorescencyjnego.I ustaw intensywność oświetlenia w zakresie od 1 do 2 oraz czas ekspozycji od 80 do 100 milisekund, aby uzyskać minimalną autofluorescencję. Następnie załaduj organoid kontroli pozytywnej i zwiększ czas ekspozycji, aby upewnić się, że oznakowane komórki są widoczne. Zmień położenie organoidu za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze, aby znaleźć wzmocnione białko zielonej fluorescencji lub region EGFP plus do wstrzyknięcia.Całkowicie usuń pożywkę z organoidu przed załadowaniem organoidu. I zobrazuj go z wybranymi ustawieniami. Po zakończeniu obrazowania natychmiast dodaj świeże podłoże, aby zapobiec wysychaniu organoidu.Po powtórzeniu usuwania pożywki i obrazowania dla wszystkich organoidów, przywróć organoidy do normalnej inkubacji i zmian w pożywce. Powtarzaj obrazowanie w żądanych odstępach czasu. Umieść szkiełko w słoiku do barwienia szkiełek Coplin wypełnionym toluenem na dwie minuty i powtórz ten krok.Następnie przenieś szkiełko do szklanego słoika do barwienia Coplin wypełnionego 100% alkoholem etylowym na dwie minuty. I powtórz ten krok przed przeniesieniem szkiełka do słoika Coplin wypełnionego wodą na dwie minuty. Powtórz pranie z wodą.Następnie umieść plastikowy pojemnik w łaźni wodnej, upewniając się, że plastik nie dotyka dna wanny. Wlej bufor cytrynianu do plastikowego pojemnika i pozwól mu osiągnąć temperaturę od 95 do 100 stopni Celsjusza. Gdy bufor osiągnie żądaną temperaturę, umieść szkiełka w buforze i luźno przykryj pojemnik pokrywką, pozostawiając szkiełka w łaźni wodnej na 30 do 40 minut.Po inkubacji wyjmij plastikowy pojemnik z łaźni wodnej i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Umyj szkiełka trzy razy po dwie minuty za pomocą PBS. Usunąć PBS chusteczką papierową, nie dotykając próbki.Przygotuj bufor do przenikania i napełnij nim szklany słoik do barwienia. Zanurzyć szkiełka w buforze przepuszczalnym i inkubować przez 10 minut. Powtórz trzy prania PBS przez dwie minuty każde.Następnie przygotuj mieszankę barwiącą, aby pokryć każdą próbkę i dodaj 25 mikrolitrów do szkiełka organoidowego przed inkubacją szkiełka w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po inkubacji powtórzyć trzy płukania PBS przez dwie minuty każde i usunąć sole, spłukując szkiełko wodą destylowaną w szklanym słoiku do barwienia szkiełek. Następnie dodaj 10 mikrolitrów płynnych mocowań i DAPI do każdej próbki przed zobrazowaniem szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Do szklanego słoika do barwienia Coplin wypełnionego do połowy buforem hartowniczym 2X dodaj 45 mililitrów PBS i umieść szkiełka w tym słoiku. Inkubuj słoik przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby sprawdzić, czy fluorofory zostały skutecznie wygaszone przed powtórzeniem barwienia i obrazowania.Wyraźna zależność fluorescencji GFP od dawki była obecna w liczbie komórek wejściowych, ze spójną detekcją EGFP i łaty komórkowej na 10 000 komórek i więcej. Wstrzyknięte organoidy i grupy kontrolne zobrazowane pod kątem dodatniego wyniku EGFP wykazały trwałość wstrzykniętego miejsca przez cały czteromiesięczny okres monitorowania. Dodatkowe plamy komórkowe z dodatnim wynikiem EGFP pojawiły się dziewięć dni po przeszczepieniu i utrzymywały się do punktu końcowego badania, wskazując na migrację komórek i integrację w ich nowych miejscach.Przy większym powiększeniu można było zaobserwować wyraźną morfologię neuronalną z długimi projekcjami w organoidzie, potwierdzając integrację wstrzykniętych komórek. Początkowe barwienie w pojedynczej rundzie potwierdziło obecność komórek EGFP plus w miejscu wstrzyknięcia, w tym mieszaniny komórek zachowujących status NPC i tych, które zróżnicowały się w kierunku losu neuronalnego. W przypadku organoidów kontrolnych i wstrzykiwanych zaobserwowano bardzo niewiele Nestin plus NPC, z przewagą TUJ1 plus niedojrzałe dojrzałe neurony.Dwa okrągłe barwienia dały więcej szczegółów, odsłaniając dojrzałe neurony wokół większości zewnętrznego obszaru organoidu, z obszarami niedojrzałych neuronów w kierunku środka. Astrocyty były obecne w wstrzykniętych i kontrolnych organoidach i były przeplatane wokół zewnętrznych krawędzi. Wycinek, dla którego wykonano dwa okrągłe barwienie w wstrzykniętym organoidzie, wykazał małą kolonię satelitarną komórek EGFP plus daleko od miejsca wstrzyknięcia, które przyjęły fenotyp dojrzałych neuronów.Niektóre z tych kolonii wydają się znajdować w pobliżu astrocytów. Jednak brak komórek EGFP plus z całkowitym nałożeniem się na barwienie GFP sugerował, że sąsiadowały one ze sobą, a nie generowały same astrocyty. Podczas wstrzykiwania organoidu należy unikać stosowania zbyt dużej siły lub robienia tego zbyt szybko, ponieważ można całkowicie zniszczyć organoid.Tak więc, po śledzeniu życia, organoidy mogą być powiązane i wykorzystane do analizy cytometrii przepływowej lub podejść do sekwencjonowania pojedynczych komórek. Pozwoli nam to poznać stan molekularny komórek. Technika ta może być niezwykle przydatna w rozwoju terapii komórkowej chorób neurodegeneracyjnych, a także w modelowaniu guzów mózgu lub przerzutów.

a-human-cerebral-organoid-model-of-neural-cell-transplantation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Palma-Tortosa, S., et.al. Hodowle organotypowe dorosłej ludzkiej kory mózgowej jako model ex vivo do przeszczepiania i walidacji ludzkich komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje przeszczep neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych do wycinków ludzkiej tkanki korowej. Procedura polega na wyizolowaniu i ponownym zawieszeniu komórek progenitorowych w macierzy błony podstawnej, a następnie wstrzyknięciu ich do wycinka korowego...

Przeszczepianie progenitorów neuronalnych pochodzących z komórek macierzystych do ludzkich wycinków korowych

Źródło: Ibanez-Rios, M.I., et al., A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje wstrzyknięcie znakowanych fluorescencyjnie nerwowych komórek progenitorowych (NPC) do ludzkich organoidów mózgowych przy użyciu mieszaniny komórkowo-matrycowej. Metoda jest powtarzalna i nie wymaga użycia zwierząt, co umożliwia przeszczep przy minimalnym uszkodzeniu organoidów. Stanowi cenną platformę do modelowania przeszczepów neuronów i chorób ośrodkowego...

Wstrzykiwanie fluorescencyjnych nerwowych komórek progenitorowych do ludzkich organoidów mózgowych w celu modelowania transplantacji

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów mózgowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Aby uzyskać organoidy mózgowe w dużych ilościach i wysokiej jakości, używamy domowych mini bioreaktorów.

Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

W tym badaniu przedstawiamy szczegółową technikę prostego, ale solidnego systemu hodowli organoidów korowych przy użyciu standardowych kultur hPSC bez karmienia. Jest to szybki, wydajny i powtarzalny protokół generowania organoidów, które modelują aspekty starzenia się mózgu in vitro.

Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

Ten protokół opisuje długoterminowe hodowle organotypowe dorosłej ludzkiej kory mózgowej w połączeniu z dokorowym przeszczepem ex vivo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z komórek macierzystych, które prezentują nowatorską metodologię do dalszego testowania terapii opartych na komórkach macierzystych dla ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Hodowle organotypowe kory mózgowej dorosłego człowieka jako model ex vivo do przeszczepiania i walidacji ludzkich komórek macierzystych

Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych zapewnia precyzyjne i skuteczne podejście do wprowadzania przejściowych modyfikacji genetycznych do różnych typów progenitorów i neuronów w systemie modelowym zbliżonym do rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej naczelnych. Pozwala to na badanie procesów neurorozwojowych i ewolucyjnych, a także może być stosowane do modelowania chorób.

Ukierunkowana mikroiniekcja i elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych w celu modyfikacji genetycznej

Tutaj prezentujemy protokół do wszczepiania organoidów ludzkiego mózgu na wielu etapach dojrzewania do błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia (CAM). Organoidy mózgowe hodowano zgodnie z niekierowanymi standardowymi protokołami.

Wczesne niekierowane modelowanie niszy nerwowo-naczyniowej organoidu ludzkiego mózgu w permisywnej błonie moczowo-omoczniowej zarodka pisklęcia

Tutaj prezentujemy ostrą manipulację genetyczną pokrojonych ludzkich organoidów korowych za pomocą elektroporacji. Te korowe modele organoidów są szczególnie podatne na wstrzykiwanie, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu, co umożliwia funkcjonalne badanie rozwoju kory mózgowej człowieka, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji kory mózgowej.

Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Poznaj protokół przeszczepu i śledzenia komórek nerwowych w ludzkich organoidach mózgowych. Ta metoda umożliwia długoterminową ocenę wszczepienia komórek in vitro oraz testowanie różnych leków.

Ludzki model organoidowy przeszczepu komórek nerwowych

Przeglądaj więcej filmów