Name: Wykrywanie w czasie rzeczywistym produkcji reaktywnych form tlenu w odpowiedzi immunologicznej ryżu za pomocą testu chemiluminescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj metodę chemiluminescencyjną L-012 do wykrywania reaktywnych form tlenu w tkankach ryżu w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia badanie dynamiki ROS w odpowiedzi immunologicznej roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty od Shanghai Natural Science Foundation (numer grantu: 21ZR1429300/BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (program Agri-X, numer grantu:AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (numer grantu: ZXWH2150201/001) dla Jiangbo Fan oraz przez Medical-Engineering Collaboration Project Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju (numer grantu: 21X010301734) dla Can Li.

UWAGA: Protokół można zastosować do różnych tkanek roślinnych. W niniejszym protokole do wykrywania ROS po wywołaniu odpowiedzi na PAMP wykorzystano pochwy i wycinki liści ryżu. Ponieważ różnice wynikają głównie z metody pobierania próbek, poniżej opisano jedynie wspólne procedury, wspominając o specyficznych krokach w razie potrzeby.
1. Hodowla roślin
<ol>
	<li>Zesterylizować łuskane nasiona ryżu w 70% etanolu przez 1 min, a następnie w 40% podchlorynie sodu (NaClO) przez 1 h. Następnie wypłukać nasiona 5 razy sterylną wodą, aby usunąć pozostałości chloru.</li>
	<li>Wysiać nasiona aseptycznie na pożywkę 1/2 MS (2,37 g/L pożywki Murashige and Skoog (MS), 30 g/L sacharozy, 2,1 g/L phytagelu, pH 5,7, autoklawowana).
	<ol>
		<li>W metodzie pochwy ryżowej nasiona wysiać bezpośrednio do sterylnego naczynia szklanego z pożywką MS.</li>
		<li>W metodzie krążka liściowego wysiać nasiona na płytki z pożywką MS na 5-7 dni, a następnie przesadzić je do matrycy wzrostowej lub gleby (Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodować siewki w komorze wzrostowej z fotoperiodem 12 h światła/12 h ciemności.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i wstępna obróbka tkanek
<ol>
	<li>pochwa liścia ryżu
	<ol>
		<li>Przetnij pochwę 10-dniowych siewek ryżu na segmenty o długości 3 mm za pomocą ostrego żyletek lub skalpela chirurgicznego w ramach wstępnej obróbki na 1 dzień przed testem ROS (Rycina 1B).</li>
		<li>Umieść pięć segmentów pochwy w oddzielnej studzience płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej zawierającej 100 µL ddH2O na 10-12 h, w ciemności w temperaturze 25 °C, co pozwala na ustąpienie wycieku jonów związanego z uszkodzeniem tkanek oraz odpowiedzi obronnych (Rycina 2). 
		UWAGA: Dbałość o to, aby cięcia były pionowe w celu zapewnienia spójnej powierzchni cięcia eksponowanej na roztwór elicytujący, jest istotnym krokiem do uzyskania wysokiej powtarzalności wyników. Przesuwaj segmenty delikatnie. Nie wykonuj dodatkowych cięć ani nie uszkadzaj segmentów, ponieważ mogłoby to być źródłem zmienności danych. Co do zasady, każdy test musi zawierać co najmniej pięć powtórzeń, ponieważ zmienność wartości ROS jest duża. Im więcej wykonanych powtórzeń, tym bardziej wiarygodne są dane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wycinek liścia
	<ol>
		<li>Wytnij wycinki liści (o średnicy 4 mm) z 4-6-tygodniowych roślin ryżu za pomocą wycinaka biopsyjnego z tłoczkiem. Zawsze wycinaj wycinki z środkowej jednej trzeciej drugiego liścia (licząc od góry) głównego pędu, aby zmniejszyć zmienność danych (Rycina 1C).</li>
		<li>Umieść jeden wycinek liścia w oddzielnej studzience płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej zawierającej 100 µL ddH2O na 10-12 h w ramach wstępnej obróbki, co pozwala na ustąpienie odpowiedzi związanych z ranieniem, które mogłyby zakłócać indukcję ROS przez PAMPy (Rycina 2). 
		UWAGA: Operuj wycinkami liści delikatnie. Nie wykonuj dodatkowych cięć ani nie uszkadzaj wycinków podczas eksperymentu, ponieważ mogłoby to doprowadzić do zmienności danych. Indukcja ROS zachodzi głównie w komórkach krawędzi cięcia, ponieważ powierzchnie tkanek ryżu (liści lub pochw) są pokryte warstwami hydrofobowymi. Tylko komórki krawędzi cięcia są w kontakcie z roztworem elicytującym (patrz sekcja dyskusji).</li>
		<li>Utrzymuj wszystkie wycinki liści w stanie pływania, powierzchnią abaksjalną skierowaną do góry, w studzienkach płytki mikrotitracyjnej podczas wstępnej obróbki wodą, aby uniknąć zmienności związanej ze stroną liścia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rośliny w kulturze tkankowej, stadia wzrostu; schemat rozwoju rośliny i procesu tworzenia nasion." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Warunki wzrostu i stadia rozwoju siewek ryżu do pobierania próbek pochwy oraz części pochwy i liści ryżu wykorzystane w analizie. (A) Siewki ryżu hodowane na podłożu 1/2 MS w warunkach sterylnych przez 10 dni mogą być pobierane do analizy ROS. Sterylne nasiona ryżu hodowano na podłożu 1/2 MS w fotoperiodzie 12 h światła/12 h ciemności w przezroczystych szklanych fiolkach o średnicy 8,5 cm i wysokości 15 cm. (B) Schematyczna ilustracja pobieranych części pochwy liściowych. Pochwy liściowe wycinano z 10-dniowych siewek ryżu. Położenie pochw liściowych znajdowało się nad korzeniami i poniżej pierwszego liścia. (C) Schematyczna ilustracja miejsca pobierania krążków liściowych. Krążki liściowe można wycinać z środkowej jednej trzeciej drugiego liścia (licząc od góry) głównego pęda zdrowych roślin ryżu na dowolnym etapie wzrostu. Skróty: ROS = reaktywne formy tlenu; MS = Murashige i Skoog. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat płytki ELISA pokazujący PAMP w porównaniu z ddH2O dla materiałów A-H, wizualizujący analizę wiązania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat rozmieszczenia na płytce do pomiaru produkcji ROS w różnych liniach Oryza sativa. Obróbka wstępna i test tkanek ryżu z wykorzystaniem płytki 96-dołkowej. Linia 1, Linia 2 i Linia 3 (do ośmiu linii na jednej płytce) mogą być dowolnymi materiałami badawczymi, różnymi odmianami, mutantami lub liniami transgenicznymi. Tkanki stymulowano roztworami wyzwalającymi z PAMP (PAMP, kolor biały) lub bez PAMP (ddH2O, kolor szary) w celu pomiaru odpowiedzi ROS. Należy zauważyć, że im więcej próbek do przetestowania, tym dłuższy odstęp czasu między odczytami. Skróty: ROS = reaktywne formy tlenu; PAMP = wzorce molekularne związane z patogenami; ddH2O = woda dwukrotnie destylowana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Przygotowanie roztworu elicytującego
<ol>
	<li>Rozpuścić proszek L-012 w wodzie ddH2O, aby przygotować 20 mM (6,23 mg/mL) roztwór wodny stanowiący roztwór zapasowy. Następnie rozcieńczyć roztwór zapasowy w 50 mM buforze Tris HCl (pH 7,5), aby otrzymać roztwór roboczy o końcowym stężeniu 500 µM L-012. Roztwór zapasowy przechowywać w zamrożeniu i rozcieńczać do stężenia roboczego bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować roztwór elicytacyjny zawierający PAMP, L-012 oraz peroksydazę chrzanową (HRP; 10 mg/mL w ddH2O). Aby przygotować 10 mL roztworu elicytacyjnego, zmieszać 9,4 mL 50 mM roztworu Tris HCl (pH 7,5), 400 µL roztworu L-012, 100 µL HRP oraz 100 µL flg22 (PAMP; 10 mM w ddH2O). W przypadku kontroli negatywnej zamiast PAMP dodać 100 µL ddH2O. 
	UWAGA: Przygotowane roztwory elicytacyjne przechowywać w temperaturze pokojowej, aby uniknąć stresu termicznego tkanek ryżu. W zależności od potrzeb do traktowania można użyć innych PAMP, np. chityny (stężenie końcowe 20 ng/mL). Ponieważ L-012 jest światłoczuły, wszystkie probówki zawierające roztwór L-012 należy owinąć folią aluminiową.</li>
</ol>
4. Uruchomienie oprogramowania i konfiguracja protokołu dla wskazanego czytnika mikropłytek (patrz Tabela materiałów)
UWAGA: Konfiguracja parametrów oprogramowania czytnika mikropłytek zajmuje pewien czas. Zaleca się przygotowanie urządzenia i protokołu (jedno kliknięcie w celu kontynuacji) przed dodaniem roztworu wyzwalającego.
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie. Kliknij przycisk Experiments, aby utworzyć nowy protokół lub użyć istniejącego protokołu.</li>
	<li>W oknie wyskakującym kliknij Procedure, aby skonfigurować płytkę. Wybierz otwory na płytce, które mają być monitorowane.</li>
	<li>Kliknij Start Kinetic, aby ustawić całkowity czas trwania pomiaru (run time) oraz interwał odczytu (reading interval). Ustaw Run time na 35 min lub więcej, w zależności od wymagań eksperymentalnych. Aby uzyskać odczyty z jak największą częstotliwością, wybierz Minimum Interval. W przypadku czasu integracji wybierz 1 s lub więcej, w zależności od intensywności sygnału. 
	UWAGA: Interwał odczytu zależy od liczby próbek i czasu trwania integracji sygnału.</li>
	<li>Kliknij Validate | OK, aby potwierdzić ustawienia.</li>
	<li>W oknie wyskakującym kliknij Detect the new plate i poczekaj, aż oprogramowanie wyświetli okno dialogowe ładowania płytki. Umieść płytkę do badania na nośniku.</li>
	<li>Zatrzymaj się w tym miejscu i poczekaj na ustanowienie systemu stymulacji (w następnej sekcji). Gdy tylko system stymulacji będzie gotowy, kliknij Run, aby rozpocząć odczyt.</li>
</ol>
5. Ustanowienie systemu elicytacji i pomiar produkcji ROS w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń ddH2O z dołków zawierających wstępnie potraktowane tkanki, unikając ich uszkodzenia lub wysuszenia.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 200 µL roztworu elicytującego do dołków z tkankami.</li>
	<li>Delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać. Kliknij Run, aby rozpocząć detekcję. 
	UWAGA: W przypadku traktowania PAMP tkanki roślinne reagują i wytwarzają ROS bardzo szybko. Dlatego, przy zastosowaniu wielu traktowań, zaleca się, aby w pierwszej kolejności potraktować kontrolę negatywną bez PAMP w celu skrócenia czasu operacji. Postępuj jak najszybciej, aby zminimalizować opóźnienie elicytacji między traktowaniami. Im krótszy czas między dodaniem roztworu elicytującego a rozpoczęciem detekcji, tym dokładniej zostaną zarejestrowane istotne dane eksperymentalne.</li>
</ol>

<ol><li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li>
<li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+are+good%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li>
<li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+calcium%2C+and+electric+signals%3A+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li>
<li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+gene+network+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li>
<li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+burst+of+plant+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+burst+oxidases%3A+the+engines+of+ROS+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li>
<li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li>
<li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li>
<li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li>
<li>Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li>
<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li>
<li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Celem tego badania było opracowanie wysoce wydajnej metody ilościowego określania wczesnej produkcji ROS w odpowiedzi na PAMP w tkankach ryżu. Metoda ta zapewnia znormalizowaną procedurę oznaczania w czasie rzeczywistym ROS apoplastu wytwarzanego z poddanych działaniu substancji tkanek ryżu. Ta metoda jest prosta w obsłudze, tania, przejrzysta w składzie i niezależna od zestawów komercyjnych. Korzystając z tej metody, naukowcy mogą badać produkcję apoplastów ROS w czasie rzeczywistym, gdy rośliny są poddawane stresom bio...

Reaktywne formy tlenu (ROS) obejmują szereg chemicznie aktywnych pochodnych tlenu, w tym anionowe rodniki ponadtlenkowe (O2-) i ich pochodne, rodniki hydroksylowe (OH-), nadtlenek wodoru oraz produkty tlenu singletowego lub reakcji utleniania-redukcji, które są stale wytwarzane w plastydach i chloroplastach, mitochondriach, peroksysomach i innych miejscach subkomórkowych1. ROS odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych i są niezbędne dla wszystkich roślin2,3,4. Szerokie spektrum funkcji ROS waha się od regulacji wzrostu i rozwoju po percepcję stresów abiotycznych i biotycznych5,6,7,8.
W roślinnym układzie odpornościowym, receptory zlokalizowane w błonie komórkowej komórek roślinnych - tak zwane receptory rozpoznawania wzorców (PRR) - postrzegają substancje chemiczne pochodzące od patogenów - wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP). To rozpoznanie wyzwala serię szybkich odpowiedzi immunologicznych, w tym napływ wapnia, wybuch ROS i kaskadę MAPK; w związku z tym ta warstwa odporności nazywana jest odpornością wyzwalaną przez PAMP (PTI). ROS burst jest charakterystyczną odpowiedzią PTI, której określenie jest szeroko stosowane w badaniach związanych z PTI9,10. Produkcja ROS wyzwalana przez PAMP jest przypisywana oksydazie NADPH rezydującej w błonie plazmatycznej lub białkom z rodziny homologów oksydazy wybuchowej układu oddechowego (RBOH), które przenoszą elektrony z cytozolowego NADPH lub NADH do tlenu zewnątrzkomórkowego w celu wytworzenia ponadtlenku (O2-), który jest spontanicznie przekształcany w nadtlenek wodoru (H2O2) przez dysmutazę ponadtlenkową8. Impuls ROS wywołany przez PAMP jest dość szybki, pojawia się zaledwie kilka minut po leczeniu PAMP i osiąga szczyt po ~10-12 minutach. Zdecydowana większość cząsteczek ROS zawiera nadtlenek wodoru (H2O2), który można łatwo i stabilnie wykryć za pomocą testu chemiluminescencji.
W chemiluminescencji, odczynnik chemiluminescencji reaguje z aktywnym tlenem, pod działaniem katalizatora, tworząc produkty pośrednie w stanie wzbudzonym. Następnie elektrony w produkcie wracają do stanu podstawowego poprzez przejście nieradiacyjne i emitują fotony. Popularne odczynniki chemiluminescencyjne to luminol i L-012, przy czym luminol dominuje w zastosowaniu11,12,13. Jednak coraz więcej badaczy wybiera L-012 do wykrywania produkcji ROS, ponieważ L-012 ma znacznie wyższą wydajność emisji światła w warunkach neutralnego lub prawie neutralnego pH w porównaniu z luminolem.
Ten artykuł opisuje zoptymalizowaną metodę chemiluminescencji, opartą na L-012, do wykrywania w czasie rzeczywistym produkcji ROS po wywołaniu PAMP w tkankach ryżu (Oryza sativa) - krążki liściowe i pochewka. Przedstawiona tutaj metoda jest prosta, stabilna i ustandaryzowana oraz można ją w dużym stopniu dostosować do różnych potrzeb eksperymentalnych. Dane uzyskane tą metodą są wysoce powtarzalne w ściśle kontrolowanych warunkach.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania</td><td></td><td>WHB WHB-96-01</td><td></td></tr><tr><td>Absolut etanolu</td><td>Innochem</td><td>A43543</td><td></td></tr><tr><td>flg22</td><td>Sangon Biotech</td><td>p20973</td><td>PAMP</td></tr><tr><td>Gen5</td><td>Oprogramowanie BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-012</td><td>FUJIFILM</td><td>120-04891</td><td>8-amino-5-chloro-7-fenylo-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pirydazyno-1,4-dion, CAS #:143556-24-5</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>MS Medium</td><td>Solarbio</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCLO</td><td>Aladdin</td><td>S101636</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza z chrzanu (HRP)</td><td>Sigma</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Sampler</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>15110-40</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610195</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie w czasie rzeczywistym produkcji reaktywnych form tlenu w odpowiedzi immunologicznej ryżu za pomocą testu chemiluminescencyjnego

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają istotną rolę w różnych procesach biologicznych, w tym w wykrywaniu stresów abiotycznych i biotycznych. Po zakażeniu patogenem lub prowokacji substancjami chemicznymi związanymi z patogenami (wzorce molekularne związane z patogenem [PAMP]), w roślinach szybko indukowany jest szereg odpowiedzi immunologicznych, w tym wybuch ROS, co nazywa się odpornością wywołaną przez PAMP (PTI). Wybuch ROS jest charakterystyczną odpowiedzią PTI, która jest katalizowana przez grupę oksydaz NADPH zlokalizowanych w błonie plazmatycznej - białek z rodziny RBOH. Zdecydowana większość ROS składa się z nadtlenku wodoru (H2O2), który można łatwo i stabilnie wykryć metodą chemiluminescencji na bazie luminoli. Chemiluminescencja to reakcja wytwarzająca fotony, w której luminol lub jego pochodna (taka jak L-012) ulega reakcji redoks z ROS pod działaniem katalizatora. W artykule opisano zoptymalizowaną metodę chemiluminescencji opartą na L-012 do wykrywania produkcji ROS apoplastów w czasie rzeczywistym po wywołaniu PAMP w tkankach ryżu. Metoda jest łatwa, stabilna, ustandaryzowana i wysoce powtarzalna w ściśle kontrolowanych warunkach.

W niniejszej procedurze wykorzystujemy materiał z ryżu jako przykład do oznaczenia ROS wytwarzanych po traktowaniu flg22. Generowanie ROS po elicytacji ma charakter przejściowy. W przypadku ryżu wzrost produkcji ROS został po raz pierwszy wykryty w 1-2 min, osiągnął szczyt w 10-12 min i powrócił do poziomu bazowego w ~30-35 min (Rycina 3). W porównaniu z testem kontrolnym, w którym w roztworze elicytującym brakowało PAMP, co skutkowało brakiem wyraźnej indukcji ROS, specyficzny wyrzut ROS zo...

Tutaj opisujemy metodę wykrywania w czasie rzeczywistym produkcji apoplastycznych reaktywnych form tlenu (ROS) w tkankach ryżu w odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez patogen wywołany wzorcem molekularnym. Ta metoda jest prosta, ustandaryzowana i generuje wysoce powtarzalne wyniki w kontrolowanych warunkach.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym produkcji reaktywnych form tlenu w odpowiedzi immunologicznej ryżu za pomocą testu chemiluminescencyjnego

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę chemiluminescencji opartą na L-012 do wykrywania produkcji ROS w czasie rzeczywistym po wywołaniu PAMP w tkankach ryżu. Ta metoda jest łatwa, ustandaryzowana i wysoce powtarzalna w ściśle kontrolowanych warunkach. Tę procedurę zademonstruje On Ying, doktorantka z mojego laboratorium.Na początek sterylizuj łuskane nasiona ryżu 70% etanolem przez jedną minutę, a następnie 40% podchlorynem sodu przez godzinę. Opłucz nasiona pięć razy sterylną wodą, aby usunąć resztki chloru. W metodzie osłonki ryżowej nasiona należy bezpośrednio pokryć w sterylnym szklanym naczyniu za pomocą pożywki Murashige i Skoog lub MS.Aby pokryć nasiona metodą krążków liściowych, umieść je na płytkach MS przez pięć do siedmiu dni, a następnie przeszczep je do macierzy wzrostu lub gleby. Hoduj sadzonki w pomieszczeniu do wzrostu z 12-godzinnym światłem i 12-godzinnym ciemnym okresem zdjęciowym. Pochewkę z 10-dniowych sadzonek ryżu należy przeciąć na trzymilimetrowe segmenty za pomocą ostrej żyletki lub ostrza chirurgicznego w celu wstępnego leczenia na dzień przed testem ROS.Umieścić pięć segmentów osłonki w pojedynczym dołku na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania zawierającej 100 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody na 10 do 12 godzin. Odetnij krążki liściowe z cztero- i sześciotygodniowych roślin ryżu za pomocą stempla biopsyjnego z tłokiem. Zawsze przycinaj talerze liściowe od środkowej jednej trzeciej drugiego liścia glebogryzarki, aby zmniejszyć różnice w danych.Następnie umieść jeden krążek liściowy w pojedynczym dołku na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania zawierającej 100 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody na 10 do 12 godzin w celu wstępnej obróbki. Utrzymuj wszystkie krążki liściowe unoszące się i skierowane do góry w dołkach płytki do mikromiareczkowania w celu wstępnego uzdatniania wody, aby uniknąć zmian związanych z powierzchnią liścia. Przygotuj roztwór elicytacyjny, łącząc 9,4 mililitra 50 mikromolowych Tris Hcl, 400 mikrolitrów roztworu L012, 100 mikrolitrów peroksydazy chrzanowej i 100 mikrolitrów Flg22.Dodaj 200 mikrolitrów roztworu elicytacyjnego do studzienek. Uruchom oprogramowanie i kliknij przycisk eksperymentów, aby utworzyć nowy protokół lub użyć istniejącego protokołu. Kliknij procedurę w wyskakującym okienku, aby ustawić płytę i wybrać studzienki z płyty, które mają być monitorowane.Kliknij start kinetic i ustaw czas działania na 30 minut lub dłużej, w zależności od wymagań eksperymentalnych. Wybierz minimalny interwał, aby uzyskiwać odczyty tak często, jak to możliwe. A jeśli chodzi o czas integracji, wybierz jedną sekundę lub dłużej, w zależności od intensywności sygnału.Kliknij zatwierdź, a następnie OK, aby potwierdzić ustawienia, a następnie kliknij wykryj nową tabliczkę w wyskakującym okienku i poczekaj, aż oprogramowanie wyświetli okno dialogowe płyty obciążeniowej. Ostrożnie usuń podwójnie destylowaną wodę z dołków zawierających wstępnie poddane obróbce tkanki, unikając uszkodzenia lub wysuszenia tkanek. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 200 mikrolitrów roztworu elicytacyjnego do studzienek zawierających tkanki.Umieść płytkę, która ma być testowana, na nośniku i rozpocznij wykrywanie. Do indukcji ROS przez Flg22 użyto krążków liściowych i osłonek o długości trzech milimetrów. Generowanie ROS jest monitorowane przez 35 minut.Słupki wskazują średnie odchyleń standardowych obliczone na podstawie pięciu powtórzeń technicznych. W przypadku ryżu wzrost produkcji ROS został po raz pierwszy wykryty w ciągu jednej do dwóch minut, osiągnął szczyt w ciągu 10 do 12 minut i powrócił do wartości wyjściowej w ciągu około 30 do 35 minut. Całkowita kwota ROS została obliczona na podstawie krzywej.Aby uzyskać łączną ilość wartości ROS, zastosuj formułę do odpowiednich zestawów danych, aby obliczyć ROS wygenerowane w każdym przedziale czasu, które można połączyć, stosując sumę formuły w celu obliczenia całkowitej wygenerowanej kwoty. Pojedynczy otwór lub dwie połówki dysku liściowego umieszczono w studzienkach 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej poddanej wstępnej obróbce 100 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody przez 10 do 12 godzin, a następnie potraktowano Flg22 w celu indukcji ROS. Wartości odczytu z dwóch próbek połówkowych są znacznie wyższe niż z całej tarczy liściowej.Średnio łączne wartości z dwóch próbek połówkowych są prawie 1,6 razy większe niż z całej tarczy liściowej, co jest proporcjonalne do długości krawędzi, a nie do powierzchni próbek. Wynik ten potwierdza, że ROS są generowane głównie w komórkach w miejscu rany. Podczas próby wykonania tej procedury należy delikatnie operować tkankami i nie wykonywać dodatkowych nacięć, które mogłyby być źródłem zmian w danych.Metoda ta może być stosowana do wszelkich innych procesów fizjologicznych wytwarzających ROS w tkankach roślinnych.

real-time-detection-reactive-oxygen-species-production-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy proponujemy proste metody testowania i oceny obecności reaktywnych form tlenu w komórkach.

Produkcja i detekcja reaktywnych form tlenu (ROS) w nowotworach

Opisano wydajną metodę pozwalającą na wizualizację indukcji sygnalizacji Ca2+ w komórkach śródbłonka wywołanej przez pochodne parakrynne ROS. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2+ wyzwalanej przez pochodne parakrynne ROS w komórkach śródbłonka naczyniowego w modelu kokultury.

Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca2+ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Ten film pokazuje test do pomiaru wybuchu oksydacyjnego w liściach Arabidopsis po wywołaniu odporności. Krążki liściowe, wycięte z liści roślin, są inkubowane z peptydami bakteryjnymi działającymi jako wzorce molekularne związane z drobnoustrojami lub MAMP. Po wykryciu MAMP komórki roślinne indukują produkcję zewnątrzkomórkowego ROS, który jest wykrywany za pomocą testu chemiluminescencyjnego.

Test do wykrywania wybuchu oksydacyjnego w krążkach liści Arabidopsis po wywołaniu immunologicznym

Ten film demonstruje test do wykrywania w czasie rzeczywistym produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) w tkankach ryżu po wywołaniu wzorca molekularnego związanego z patogenem (PAMP). Przecięte segmenty pochwy i krążki liściowe są narażone na działanie peptydu pochodzącego z wici bakteryjnej, działającego jako PAMP. Po rozpoznaniu peptydu za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców (PRR) na komórkach roślinnych następuje szybka i przejściowa produkcja ROS, która jest wykrywana za pomocą testu...

Test do wykrywania produkcji reaktywnych form tlenu w tkankach ryżowych po wywołaniu immunologicznym

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Ten artykuł opisuje dwie metody ilościowego określania reakcji obronnych u Arabidopsis thaliana po ekspozycji na elicytory immunologiczne: przejściowy wybuch oksydacyjny i zahamowanie wzrostu siewki.

Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Escherichia coli jest główną przyczyną Gram-ujemnego bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Podczas infekcji bakteryjnej główną rolę bakteriobójczą odgrywają reaktywne formy tlenu wytwarzane przez neutrofile. Tutaj przedstawiamy metodę wykrywania reaktywnych form tlenu w neutrofilach w odpowiedzi na zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych E. coli.

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi Escherichia coli

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół testu chemotaksji. Celem tego protokołu jest zmniejszenie liczby etapów i kosztów tradycyjnych metod chemotaksji bakteryjnej oraz służenie jako cenne źródło informacji o interakcjach między roślinami a mikroorganizmami.

Ulepszony test chemotaksji do szybkiej identyfikacji chemoatraktantów ryzo bakteryjnych w wysiękach korzeniowych

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Poznaj metodę chemiluminescencyjną L-012 do wykrywania reaktywnych form tlenu w tkankach ryżu w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia badanie dynamiki ROS w odpowiedzi immunologicznej roślin.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym produkcji reaktywnych form tlenu w odpowiedzi immunologicznej ryżu za pomocą testu chemiluminescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie w czasie rzeczywistym produkcji reaktywnych form tlenu w odpowiedzi immunologicznej ryżu za pomocą testu chemiluminescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów