Name: Niewodna izolacja i wzbogacenie gruczołowych łodyg główkowatych i włosków siedzących z Cannabis sativa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj metodę niewodnej izolacji gruczołowych łodyg główkowatych i włosków siedzących z Cannabis sativa przy użyciu suchego lodu i ciekłego azotu. Technika umożliwia wysokoprzepustową ekstrakcję RNA do analiz transkryptomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony CannabiVar Ltd. Cały materiał roślinny został hojnie dostarczony przez profesora Hinanit Koltai z Centrum Volcani w Izraelu.

UWAGA: Materiał roślinny użyty w tym badaniu składał się z czterech szczepów C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 i CS-14), które były uprawiane w Volcani Center, Izrael, jak opisano w innym miejscu11. Trichomy gruczołowe główkowate wyizolowano z dojrzałych kwiatostanów kwitnących, a trichomy siedzące gruczołowe wyizolowano z dużych liści wachlarzowych dojrzałych, nie kwitnących roślin matecznych. Cały materiał roślinny został świeżo zebrany i natychmiast przechowywany w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Suchy lód i LN są używane w całym protokole. Substancje te są niezwykle niebezpieczne. Izolowane trichomy mogą zawierać cząsteczki suchego lodu, które mogą wytwarzać niebezpieczne ciśnienie gazu po włożeniu do szczelnych rurek; Dlatego wszystkie nakrętki powinny być nakłuwane igłą. Zdecydowanie zaleca się stosowanie okularów ochronnych, odpowiedniej odzieży laboratoryjnej i rękawic do pracy w ekstremalnie niskich temperaturach.
1. Ustawienie do początkowego oddzielania trichomów od materiału roślinnego
<ol>
	<li>Zmiażdż blok suchego lodu na małe drobne płatki za pomocą młotka i twardego płaskiego przedmiotu w plastikowym pojemniku o pojemności 5 litrów.</li>
	<li>Przesiać drobne płatki suchego lodu (mniejsze niż 5 mm) z nierozdrobnionego suchego lodu za pomocą dużego sitka (przez pory mniejsze niż 5 mm) do innego plastikowego pojemnika o pojemności 5 l. Wlać około 200cm3 (200 ml kreski) płatków suchego lodu do pionowej szklanej zlewki o pojemności 1 l.</li>
	<li>Na pierwszą warstwę rozdrobnionego suchego lodu dodać do 10 g mrożonych kwiatostanów C. sativa (zwanych dalej materiałem roślinnym) i przykryć dodatkową warstwą 200cm3 drobno pokruszonego suchego lodu.</li>
	<li>Zakryj otwór szklanej zlewki o pojemności 1 l dwiema lub trzema warstwami moskitiery o grubości 1 mm i przymocuj ją do zewnętrznych boków szklanego kubka za pomocą gumowych opasek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Wlać LN do dużego pojemnika ze stali nierdzewnej o okrągłym dnie (patrz Tabela Materiałów), w którym zostaną zebrane izolowane trichomy.</li>
	<li>Włóż siatkę o grubości 350 μm do sitka przesiewacza mąki/sitka, aby przykryć siatkę przesiewacza mąki od dołu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Jeśli dostępny jest przesiewacz mąki z odłączanym plastikowym pierścieniem, włóż siatkę 350 μm tak, aby była zabezpieczona pod siatką przesiewacza mąki. Jeśli nie, przymocuj siatkę 350 μm do obwodu przesiewacza mąki za pomocą gumek.</li>
	<li>Umieść przesiewacz mąki nad dużym okrągłodennym pojemnikiem ze stali nierdzewnej wypełnionym LN (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). Upewnij się, że szerokość pojemnika przekracza szerokość przesiewacza mąki, aby zminimalizować utratę przesianej masy poza okrągłodennym pojemnikiem ze stali nierdzewnej.</li>
</ol>
2. Oddzielenie trichomów od materiału roślinnego
<ol>
	<li>Potrząśnij szklanką o pojemności 1 l z otworem skierowanym w dół w kierunku przesiewacza mąki, tak jakby używał dużej solniczki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Odstawiaj szklaną zlewkę o pojemności 1 l co 2-3 minuty, aby umożliwić przesianie pokruszonego suchego lodu i materiału roślinnego zgromadzonego na sicie mąki.</li>
	<li>Przesiej sito mąki poziomo, aby ułatwić przejście materiału roślinnego do LN w okrągłodennym pojemniku ze stali nierdzewnej poniżej.</li>
	<li>Dodaj LN do pojemnika ze stali nierdzewnej, a pokruszony suchy lód do szklanej zlewki o pojemności 1 l, gdy ich poziom spadnie. Zużyty materiał roślinny w szklanej zlewce należy uzupełnić dodatkowymi 10 g świeżego materiału roślinnego, gdy materiał roślinny na sicie do mąki zostanie wyczerpany. Uzupełnianie zwykle nie musi być powtarzane więcej niż dwa razy.</li>
	<li>Powtarzać kroki 2.1-2.4, aż do momentu, gdy w okrągłodennym pojemniku ze stali nierdzewnej zostanie zebrana wystarczająca ilość wzbogaconych włosków. Ogólnie rzecz biorąc, 20 g świeżego materiału roślinnego wystarcza do ekstrakcji RNA i analizy transkryptomu.</li>
	<li>Sprawdź, czy na dnie pojemnika ze stali nierdzewnej zanurzonego w LN znajduje się biała substancja podobna do proszku (składająca się z resztek roślinnych, włosków gruczołowych i pokruszonego suchego lodu). Obserwacja mikroskopowa pomoże określić, czy zebrano wystarczającą ilość trichomów; Jednak ten krok może utrudnić przepływ protokołu. Zwykle 10-20 g początkowego materiału roślinnego wystarcza do większości izolacji; Mogą jednak występować różnice w gęstości trichomów roślin. 
	UWAGA: Od tego momentu eksperyment można wstrzymać i ponownie uruchomić później. W przypadku przerwy na krótki czas, należy dodać odpowiednią ilość LN, aby trichomy pozostały zanurzone. Alternatywnie, trichomy można zbierać i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 3 miesięcy w celu późniejszego wykorzystania, zgodnie z opisem w kroku 5.</li>
</ol>
3. Oddzielenie włosków gruczołowych główkowatych (szypułkowych i siedzących) od innych typów trichomów, takich jak trichomy bulwiaste i cystolitowe oraz szczątki
<ol>
	<li>Dodaj niewielką ilość LN do czystego, małego pojemnika ze stali nierdzewnej z okrągłym dnem.</li>
	<li>Złóż dwukrotnie mikrositko o wymiarach 40 cm x 40 cm o rozmiarze oczek 150 μm, aby uzyskać zagięcie o wymiarach 20 cm x 20 cm, i otwórz je. Upewnij się, że przypomina kształt przypominający stożek (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).</li>
	<li>Przymocuj stożek siatkowy do krawędzi okrągłodennego pojemnika ze stali nierdzewnej za pomocą jednego lub dwóch spinaczy do bielizny, tak aby otwarta część stożka była ustawiona pionowo, a jej spiczasta część była częściowo zanurzona w LN.</li>
	<li>Delikatnie wlać LN i białą substancję przypominającą proszek z kroku 2.6 do stożka mikrosita.</li>
	<li>Delikatnie nałóż szeroką szczotkę, aby zebrać i przenieść pozostały materiał roślinny z pierwszego pojemnika do stożka o oczkach 150 μm.</li>
	<li>Dodaj więcej LN do pierwszego pojemnika i powtarzaj ruch szczotkowania, aż cały materiał roślinny zostanie przeniesiony do stożka z mikrositkiem.</li>
	<li>Ostrożnie odłącz spinacz do bielizny od pokrywki pojemnika i otwórz stożek mikrositka tak, aby trichomy znajdowały się pośrodku otwartego mikrositka. Przytrzymaj wszystkie cztery rogi mikrositka razem, tak aby środkowa część zawierająca trichomy pozostała zanurzona w LN (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
	<li>Trzymając wszystkie cztery rogi mikrositka, delikatnie zanurz i potrząśnij mikrositkiem w LN w stalowym pojemniku, tak jakby zaparzał torebkę herbaty. Kontynuuj ten ruch zanurzania/potrząsania (pionowy i poziomy) przez 1 minutę. Istnieje kompromis między jakością a ilością izolacji. Dłuższe ruchy zanurzania mogą skutkować większymi ilościami włosków, ale ich stopień izolacji może być gorszy. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się 1 minutę jako odpowiednią zarówno dla jakości, jak i ilości. 
	UWAGA: Ten ruch przesiewania jest najbardziej krytyczną częścią protokołu i powinien być odpowiednio wykonany.</li>
	<li>Opcjonalnie: Zgarnij nieprzesiane resztki roślin i większe trichomy (nadal zanurzone w LN), które są owinięte w środku mikrositka, do probówki o pojemności 13 ml lub 50 ml i przechowuj w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: Aby uniknąć gromadzenia się gazu pod ciśnieniem (z suchego lodu i pozostałości LN), przebij otwór w nasadce probówki wysterylizowaną igłą. Nasadkę można wymienić po zmniejszeniu ciśnienia, co zwykle następuje po 24 godzinach.</li>
</ol>
4. Przepuszczanie trichomów przez mikro-sita o zmniejszającej się wielkości porów
<ol>
	<li>Przesiane trichomy zanurzone w LN na dnie małego okrągłodennego pojemnika ze stali nierdzewnej przenieść kolejno przez mikrosita o zmniejszających się rozmiarach porów (105 μm, 80 μm, 65 μm i 50 μm), w taki sam sposób, jak pokazano w kroku 3.</li>
</ol>
5. Zbiór pożądanych trichomów
<ol>
	<li>Usunąć pożądane trichomy zanurzone w LN i zawinięte w mikrosito 50 μm za pomocą wstępnie schłodzonej (w LN) łyżce. Ułóż je na czystym talerzu. 
	UWAGA: W tym ostatnim etapie izolacji pożądane trichomy są zbierane z sita.</li>
	<li>Szybko przenieś trichomy przypominające proszek do oznakowanej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą wstępnie schłodzonej szpatułki lub czerpaka włożonej do probówki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 7). Probówki należy natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszych badań. 
	UWAGA: Schematyczny schemat przepływu pracy przedstawiający cały protokół izolacji znajduje się w Rysunek 8.</li>
</ol>
6. Obserwacja i analiza oczyszczonych trichomów
<ol>
	<li>Umieścić niewielką ilość (10 mg) wyizolowanych włosków na szkiełku mikroskopowym za pomocą wstępnie schłodzonej (przez LN) szpatułki. Dodaj kroplę wody i obserwuj bezpośrednio pod mikroskopem świetlnym bez barwienia. Oceń ogólny stopień izolacji i zanieczyszczenia za pomocą małych (10x) i wysokich (40x) powiększeń. Wzbogacenie jest wizualnie szacowane na podstawie względnej ilości trichomów w stosunku do tkanki innej niż trichom, jak pokazano na Rysunek 9.</li>
	<li>Przeprowadzić ekstrakcję RNA i analizę jakości z 50 mg izolowanej C. sativa gruczołowej, główkowatej łodygi i siedzących trichomów. 
	UWAGA: Do ekstrakcji RNA użyto komercyjnego zestawu do ekstrakcji (patrz Tabela materiałów) wykorzystującego strategię oczyszczania mRNA na bazie poli-A.
	<ol>
		<li>Zawiesić ponownie 50 mg wyizolowanych trichomów w roztworze do lizy, wirować przez 30 s, poddać sonikacji w lodowato zimnym urządzeniu do czyszczenia ultradźwiękowego o częstotliwości 35 kHz przez 5 minut i wyekstrahować mRNA z próbek zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Aby oszacować integralność RNA wyekstrahowanego z trichomów, należy określić stężenie RNA, całkowitą ilość i wartości liczby integralności RNA (RIN) za pomocą systemu lab-on-a-chip (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Wykonaj analizę RNAseq frakcji trichomów (opcjonalnie). Analiza RNAseq i analizy bioinformatyczne sekwencyjnych odczytów mogą być wykonywane przez standardowe usługi outsourcingowe</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+plant+trichome+biochemistry+for+the+production+of+useful+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal+for+Cell+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds.</a> Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).</li>
<li>Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-volatile+natural+products+in+plant+glandular+trichomes%3A+chemistry%2C+biological+activities+and+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis.</a> Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).</li>
<li>Fairbairn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trichomes+and+glands+of+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22UN+Bulletin+on+Narcotics%22%5BJournal%5D)">The trichomes and glands of Cannabis sativa L.</a> UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).</li>
<li>Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terpene+synthases+from+Cannabis+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Terpene synthases from Cannabis sativa.</a> PLoS One. 12 (3), 0173911(2017).</li>
<li>Yerger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+isolating+glandular+trichomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method for isolating glandular trichomes.</a> Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).</li>
<li>Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+histochemical+localization+of+monoterpene+biosynthesis+in+the+glandular+trichomes+of+spearmint+%28Mentha+spicata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata).</a> Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).</li>
<li>Gershenzon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+secretory+cells+from+plant+glandular+trichomes+and+their+use+in+biosynthetic+studies+of+monoterpenes+and+other+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products.</a> Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).</li>
<li>Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Cannabis+sativa+glandular+trichome+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome.</a> PLoS One. 16 (4), 0242633(2021).</li>
<li>Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+novel+transcription+factors+involved+in+cannabinoid+biosynthesis+in+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L.</a> Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).</li>
<li>Slone, J. H., Kelsey, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+glandular+secretory+cells+from+Artemisia+tridentata+%28ssp.+vaseyana%29+by+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation.</a> American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).</li>
<li>Namdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terpenoids+and+Phytocannabinoids+Co-Produced+in+Cannabis+Sativa+Strains+Show+Specific+Interaction+for+Cell+Cytotoxic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity.</a> Molecules. 24 (17), 3031(2019).</li>
<li>McDowell, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+functional+genomic+analysis+of+Solanum+glandular+trichome+types%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types.</a> Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).</li>
<li>Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+as+a+signal+to+sort+developing+glandular+trichomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 949(2016).</li>
<li>Livingston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabis+glandular+trichomes+alter+morphology+and+metabolite+content+during+flower+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation.</a> The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).</li>
<li>Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gland+distribution+and+cannabinoid+content+in+clones+of+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L.</a> American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).</li>
<li>Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+cannabinoids+in+individual+glandular+trichomes+of+Cannabis+sativa+L.+%28Cannabaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae).</a> American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).</li>
<li>Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+glandular+hairs+of+Cannabis+sativa+from+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy.</a> American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).</li>
<li>Marks, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+isolating+large+quantities+of+Arabidopsis+trichomes+for+transcriptome%2C+cell+wall%2C+and+other+types+of+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses.</a> The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).</li>
<li>Huebbers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+method+for+the+release%2C+enrichment+and+purification+of+high-quality+Arabidopsis+thaliana+rosette+leaf+trichomes+enables+profound+insights+into+the+trichome+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome.</a> Plant Methods. 18 (1), 12(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

W porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami izolacji trichomów, w niniejszym protokole opisano dwie główne modyfikacje. Obejmują one oderwanie trichomów od materiału roślinnego za pomocą suchego lodu w początkowym etapie i zastąpienie LN powszechnie stosowaną płynną pożywką buforową. Pierwsza modyfikacja oczyszczania trichomów C. sativa opiera się na wcześniejszym protokole, który wprowadził użycie pokruszonego suchego lodu do oddzielenia trichomów od szypułek geranium5. Podczas gdy tra...

Trichomy gruczołowe to struktury przypominające włosy, obecne w roślinach, które zawierają wiele wtórnych metabolitów1 i stanowią cenny bank nowych genów i enzymów biosyntetycznych2. W konopiach indyjskich biosynteza ważnych metabolitów wtórnych, kannabinoidów3 i terpenów4, jest zlokalizowana we włoskach. Biorąc pod uwagę rolę trichomów w określaniu jakości konopi indyjskich zarówno do zastosowań leczniczych, jak i rekreacyjnych, interesujące jest badanie ekspresji genów trichomów. Aby scharakteryzować ekspresję genów specyficznych dla trichomów, należy najpierw wyizolować interesujące nas trichomy. Protokoły izolacji trichomów zostały po raz pierwszy opisane już w 1992 roku5, a ich najnowsze osiągnięcia zostały niedawno przejrzane2. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły ekstrakcji trichomów gruczołowych w celu charakterystyki transkryptomicznej można podzielić na dwa odrębne sekwencyjne etapy. Pierwszy krok polega na dokładnym fizycznym oddzieleniu trichomów od tkanki roślinnej. Ten krok można wykonać, używając suchego lodu5, szklanych koralików za pomocą komercyjnego urządzenia6,7, mieląc materiał roślinny na sicie siatkowym8, lub wirując tkankę roślinną w buforze izolacyjnym9. Drugi etap polega na bardziej wyrafinowanym oddzieleniu interesujących nas trichomów od mikroskopijnych pozostałości roślinnych i/lub innych rodzajów trichomów. Ten krok można wykonać za pomocą wirowania gradientu gęstości8,10 lub sita o różnych rozmiarach7,9. Ze względu na ekstremalną wrażliwość RNA w przetwarzanych tkankach na czynniki degradujące, te dwa sekwencyjne etapy są zwykle przeprowadzane w lodowatym podłożu izolacyjnym, często w obecności inhibitorów białek4.
Konwencjonalne protokoły izolacji trichomów wymagają, oprócz lodowatych temperatur, dużych ilości podłoża izolacyjnego, aby zapewnić efektywną procedurę ekstrakcji. Połączenie tych komponentów powoduje żmudny, czasochłonny proces izolacji, który utrudnia wysoką przepustowość. Przedstawienie prostego, przyjaznego dla użytkownika alternatywnego protokołu izolacji trichomów może być zatem korzystne dla różnych aspektów związanych z charakterystyką trichomów. Niniejsza praca ma na celu zaproponowanie alternatywnego protokołu izolowania włosków główkowatych gruczołów szypułkowych i siedzących od Cannabis sativa poprzez połączenie i integrację kilku elementów z konwencjonalnych protokołów. Do tych elementów należą: suchy lód5, przepuszczanie trichomów przez kilka mikrosit o zmniejszających się rozmiarach porów7,9, oraz zastąpienie medium izolacyjnego ciekłym azotem (LN)8.
Nowość obecnego protokołu izolacji trichomów, w porównaniu do konwencjonalnych protokołów, przejawia się na wiele sposobów. Ten protokół jest wygodny, ponieważ nie wymaga niebezpiecznych składników. Procedura może być przeprowadzana w laboratorium przy minimalnych środkach ostrożności i zapewnia wysoką przepustowość. Zastąpienie LN standardowym płynnym podłożem izolacyjnym zapewnia integralność trichomów w całym procesie izolacji, umożliwiając późniejszą analizę transkryptomiczną. Po sublimacji LN i suchego lodu izolowane trichomy pozostają wolne od szkodliwych pozostałości. Co więcej, skłonność LN do sublimacji w temperaturze pokojowej pozwala na jego szerokie stosowanie w całym protokole. Natomiast stosowanie dużych ilości konwencjonalnego podłoża izolacyjnego stwarza praktyczne trudności w jego obsłudze. Wreszcie, protokół zmniejsza separację komórki dysku od pozostałej delikatnej struktury głowy włoska gruczołowego, umożliwiając zachowanie zawartości przestrzeni nad głową.
Ten protokół jest przedstawiony szczegółowo, krok po kroku, aby pomóc w technicznej praktyce izolowania trichomów C. sativa gruczołowych główkowatych. Protokół zapewnia łatwy do opanowania przepływ pracy, który skutkuje izolowanymi włoskami o wysokim stężeniu i czystości, które są odpowiednie do dalszej analizy molekularnej.

<table><tbody><tr><td>Bioanalizator RNA Pico 6000 chip</td><td>Agilent, Niemcy</td><td>Numer zamówienia 5067-1513</td><td>System lab-on-a-chip&nbsp;</td></tr><tr><td>Transsonic-310</td><td>Elma, Niemcy</td><td>D-78224</td><td>Myjka ultradźwiękowa&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania próbki RNA TruSeq v2</td><td>Illumina, USA</td><td>RS-122-2001</td><td>Przygotowanie próbki do biblioteki sekwencjonowania RNA</td></tr><tr><td>Spectrum Plant Total RNA Kit&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH, USA</td><td>STRN50-1KT</td><td>Zestaw całkowitego RNA dla roślin&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrositko nylonowe o rozmiarze oczek 350 &mikro; m (40 x 40 cm lub większe niż obwód przesiewacza mąki)</td><td>Sinun Tech, Izrael</td><td>r0350n350210</td><td>Nylon&nbsp; apertura sita</td></tr><tr><td>Mikrosito nylonowe o wielkości oczek 150 &mikro; m (rozmiar 30 x 30 cm)</td><td>Sinun Tech, Izrael</td><td>r0150n360465</td><td>Nylon&nbsp; apertura sita</td></tr><tr><td>Mikrosito nylonowe o wielkości oczek ø 105 & mikro; m (rozmiar 30 x 30 cm)</td><td>Sinun Tech, Izrael</td><td>r0105n320718</td><td>Nylon&nbsp; otwór sita</td></tr><tr><td>Mikrosito nylonowe o wielkości oczek ø 80 & mikro; m (rozmiar 30 x 30 cm)</td><td>Sinun Tech, Izrael</td><td>r0080n370465</td><td>Nylon&nbsp; apertura sita</td></tr><tr><td>Mikrosito nylonowe o wielkości oczek ø 65 & mikro; m (rozmiar 30 x 30 cm)</td><td>Sinun Tech, Izrael</td><td>r0065n340715</td><td>Nylon&nbsp; apertura sita</td></tr><tr><td>Mikrosito nylonowe o wielkości oczek ø 50 & mikro; m (rozmiar 30 x 30 cm)</td><td>Sinun Tech, Izrael</td><td>r0080n370465</td><td>Nylon&nbsp; otwór ekranu</td></tr><tr><td>Do 10 g zamrożonego materiału roślinnego (przechowywanego w temperaturze -80 oC lub ciekłym azocie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odpowiednie rękawice do pracy w niskich temperaturach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gogle</td><td></td><td></td><td></td>ochronne</tr><tr><td>Siatka do drzwi (moskitiera) 1 mm (pasek 30 x 100 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duże sitko (durszlak) z otworami około 5 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklana zlewka</td><td></td><td></td><td></td>1 l</tr><tr><td>1 blok suchego lodu (0,5-1 kg)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Młotek i twardy płaski przedmiot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwa plastikowe pojemniki</td><td></td><td></td><td></td>o pojemności 5 l</tr><tr><td>Gumki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duże sitko do przesiewania mąki lub sitka - najlepiej z odpinanym plastikowym pierścieniem na obwodzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kilka dużych i małych pojemników ze stali nierdzewnej z okrągłym dnem. Jeden z nich powinien być większy niż obwód przesiewacza mąki (około 40 cm średnicy), aby zminimalizować utratę przesianej masy na zewnątrz okrągłego dna pojemnika</td><td></td><td></td><td></td>ze stali nierdzewnej</tr><tr><td>Wstępnie schłodzona (za pomocą ciekłego azotu) łyżka ze stali nierdzewnej, szpatułka i szufelka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyczyść talerz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kilka spinaczy do bielizny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wstępnie schłodzone (za pomocą ciekłego azotu) oznakowane probówki o pojemności 1,5 ml z otworami wbitymi w wieczko sterylną igłą</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwa pojemniki z ciekłym azotem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td><td></td> malarski o szerokości 1 cm</tr></tbody></table>

niewodna izolacja i wzbogacenie gruczołowych łodyg główkowatych i włosków siedzących z cannabis sativa

Non-Aqueous Isolation and Enrichment of Glandular Capitate Stalked and Sessile Trichomes from Cannabis sativa

Ten artykuł przedstawia protokół wygodnej i wysokoprzepustowej izolacji i wzbogacania gruczołowych łodyg główkowatych i siedzących trichomów z Cannabis sativa. Szlaki biosyntezy metabolizmu kannabinoidów i lotnych terpenów są zlokalizowane głównie we włoskach konopi, a izolowane trichomy są korzystne dla analizy transkryptomu. Istniejące protokoły izolowania trichomów gruczołowych w celu charakterystyki transkryptomicznej są niewygodne i powodują uszkodzenie główek trichomów oraz stosunkowo niewielką ilość izolowanych trichomów. Ponadto polegają na drogiej aparaturze i pożywkach izolacyjnych zawierających inhibitory białek, aby uniknąć degradacji RNA. Niniejszy protokół sugeruje połączenie trzech indywidualnych modyfikacji w celu uzyskania dużej ilości izolowanych gruczołowych łodyg główkowatych i siedzących trichomów odpowiednio z dojrzałych żeńskich kwiatostanów i liści wachlarzowych C. sativa. Pierwsza modyfikacja polega na zastąpieniu konwencjonalnego podłoża izolacyjnego ciekłym azotem w celu ułatwienia przejścia trichomów przez mikrosita. Druga modyfikacja polega na użyciu suchego lodu do odłączenia trichomów od źródła roślinnego. Trzecia modyfikacja polega na przepuszczeniu materiału roślinnego kolejno przez pięć mikrositek o zmniejszających się rozmiarach porów. Obrazowanie mikroskopowe wykazało skuteczność techniki izolacji dla obu typów trichomów. Ponadto jakość RNA wyekstrahowanego z izolowanych trichomów była odpowiednia do dalszej analizy transkryptomicznej.

Główną modyfikacją wprowadzoną w tym protokole w porównaniu do konwencjonalnych protokołów izolacji trichomów jest zastąpienie standardowego medium izolacyjnego LN. Zastosowanie LN jako medium izolacyjnego pozwala na bardziej swobodny przebieg prac, ponieważ dopóki próbki są zanurzone w LN, degradacja metaboliczna prawdopodobnie nie wystąpi. Ponadto, dzięki temu, że protokół eliminuje niebezpieczne składniki (tj. kwas auryntrykarboksylowy i β-merkaptoetanol) stosowane w tradycyjnym medium do izolacji trichomów, prace nie...

Przedstawiono protokół dla wygodnej i wysokoprzepustowej izolacji i wzbogacania gruczołowych łodyg główkowatych i siedzących trichomów z Cannabis sativa. Protokół opiera się na suchej, niebuforowej ekstrakcji trichomów przy użyciu wyłącznie ciekłego azotu, suchego lodu i sit nylonowych i nadaje się do ekstrakcji RNA i analizy transkryptomicznej.

Niewodna izolacja i wzbogacenie gruczołowych łodyg główkowatych i włosków siedzących z Cannabis sativa

This paper presents a protocol for the convenient and high-throughput isolation and enrichment of glandular capitate stalked and sessile trichomes from ...

Znaczenie protokołu polega na jego wygodzie i krótkim czasie potrzebnym na jego ukończenie. Umożliwia to wysoką przepustowość, wysokie stężenie i wysoki stopień izolacji włosków szypułkowych i siedzących. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota.Podczas tej techniki należy wziąć pod uwagę gęstość trichomów w źródle rośliny i sprawdzić stopień izolacji na każdym etapie za pomocą mikroskopu podczas wykonywania protokołu po raz pierwszy. Tę technikę zademonstruje Nurit Shalev, ekspert ds. konopi z Volcani Center. Zacznij od zmiażdżenia bloku suchego lodu na małe, drobne płatki za pomocą młotka i twardego, płaskiego przedmiotu w pięciolitrowym plastikowym pojemniku.Użyj dużego sitka i przesiej drobne płatki suchego lodu z niepokruszonego suchego lodu do innego pięciolitrowego plastikowego pojemnika. Wlej około 200 centymetrów sześciennych płatków suchego lodu do pionowej szklanej zlewki o pojemności jednego litra. Dodaj do 10 gramów mrożonych kwiatostanów cannabis sativa na pierwszą warstwę pokruszonego suchego lodu i przykryj ją dodatkową warstwą 200 centymetrów sześciennych drobno pokruszonego suchego lodu.Następnie przykryj otwór litrowej szklanej zlewki dwiema lub trzema warstw

non-aqueous-isolation-enrichment-glandular-capitate-stalked-sessile

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Nadziemne organy roślin są chronione przez kutykulę, która stanowi supramolekularny kompleks biopoliestru i wosków. Przedstawiamy protokoły monitorowania selektywnego usuwania wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykuli owoców pomidora w skalach molekularnej i mikro, odpowiednio za pomocą NMR w stanie stałym oraz mikroskopii sił atomowych, a także oceny zdolności do sieciowania zmodyfikowanych biopoliestrów kutykularnych.

Izolacja i badanie biofizyczne kutykuli owoców

Gruczoły roślinne to wyspecjalizowane struktury odpowiedzialne za biosyntezę i wydzielanie wielu związków biorących udział w interakcjach ze środowiskiem biotycznym. Aby umożliwić badania nad ich cechami molekularnymi i biochemicznymi, opracowano technikę mechanicznego mikroprzygotowania w celu wyizolowania pojedynczych gruczołów aktywnych metabolicznie, w tym przypadku z mięsożernej rośliny Nepenthes.

Izolacja żywotnych gruczołów wielokomórkowych z tkanki rośliny mięsożernej, Dzbanecznik

Poliestry lipidowe stanowią składniki strukturalne dwóch modyfikacji ściany komórkowej, naskórka roślinnego i barier dyfuzyjnych zawierających suberynę. W tym filmie opisujemy metodę depolimeryzacji kutyny z całych zdelipidowanych liści. Metoda ta może być stosowana do badania mutantów upośledzonych w biosyntezie kutyny lub suberyny.

Izolacja i analiza składu monomerów lipidowych poliestrowych naskórków roślin

Ten protokół/manuskrypt opisuje uproszczony proces produkcji kapsułek egzyny sporopolleniny (SEC) z zarodników Lycopodium clavatum oraz ładowania związków hydrofilowych do tych SEC.

Ekstrakcja kapsułek roślinnych do zastosowań w mikrokapsułkowaniu

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami (UAE) zwiększa efektywność ekstrakcji rozpuszczalników, a po zastosowaniu do biomasy Cannabis spp. skraca czas potrzebny na ekstrakcję. Zmniejsza to koszt i potencjalną utratę kannabinoidów w wyniku degradacji. Ponadto Zjednoczone Emiraty Arabskie są uważane za metodę ekologiczną ze względu na niskie zużycie rozpuszczalników.

Ultradźwiękowa ekstrakcja kwasu kannabidiolowego z biomasy konopi

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Opisujemy prostą, ale wysoce powtarzalną metodę izolowania zewnątrzkomórkowego RNA z powierzchni liści i apoplastu roślin Arabidopsis.

Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z liści Arabidopsis thaliana , wspierającą dalsze analizy molekularne i funkcjonalne.

Izolacja i oczyszczanie zewnętrznych pęcherzyków roślinnych z liści Arabidopsis przy użyciu zoptymalizowanej metody zbierania apoplastów

Poznaj metodę niewodnej izolacji gruczołowych łodyg główkowatych i włosków siedzących z Cannabis sativa przy użyciu suchego lodu i ciekłego azotu. Technika umożliwia wysokoprzepustową ekstrakcję RNA do analiz transkryptomicznych.

Niewodna izolacja i wzbogacenie gruczołowych łodyg główkowatych i włosków siedzących z Cannabis sativa

Przeglądaj więcej filmów