Name: Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym wpływu TnpB związanego z rodziną IS200/IS605 na aktywność transpozonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: Poznaj metodę obrazowania w czasie rzeczywistym do kwantyfikacji aktywności transpozonów w komórkach Escherichia coli. Technika ta pozwala mierzyć dynamikę ekscyzji na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe dla tych badań zostało zapewnione przez fundusze startowe z Uniwersytetu Kalifornijskiego.

1. Przygotowanie kultur bakteryjnych
<ol>
	<li>Hoduj szczep E. coli MG1655 z konstruktami transpozonów plazmidowych (wcześniej opisanymi w Kim et al.8) przez noc w LB z odpowiednimi antybiotykami (25 μg/ml kanamycyny, patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Sekwencje użytych konstrukcji i powiązane sekwencje są dostępne jako GenBank20 numerów dostępu OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 i OP717085.</li>
	<li>Aby osiągnąć wykładniczy wzrost w stanie ustalonym, należy rozcieńczyć kultury ≥100 razy do pożywki M63 (100 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,8 μM FeSO4, 15 mM [NH4]2SO4, 0,5 μg/ml tiaminy [witamina B1]) uzupełnione źródłem węgla (tutaj 0,5% w/v glukozy) i odpowiednimi antybiotykami (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Hodować kultury w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) osiągnie ~0,2. Kultury są gotowe do użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie slajdów
<ol>
	<li>Przygotuj szkiełko, gotując M63 z 0,5% w/v glukozy i 1,5% w/v agarozy w kuchence mikrofalowej, aby stopić agarozę i upewnić się, że jest całkowicie stopiona i dobrze wymieszana.</li>
	<li>Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do ~55 °C przed dodaniem antybiotyków i induktorów (25 μg/ml Kanamycyny i 10 ng/μL anhydrotetracykliny [aTc], patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść szkiełko mikroskopowe na stole warsztatowym. Ułóż dwie kolejne szkiełka prostopadle do pierwszej i umieść kolejną na górze, równolegle do dolnej prowadnicy. Upewnij się, że między dolną a górną prowadnicą jest szczelina równa jednej grubości prowadnicy. Powoli odpipetować ~1 ml mieszaniny agarozy M63 do tej szczeliny między szkiełkami, aby utworzyć mały żelowy kwadrat.</li>
	<li>Gdy żel zastygnie (~10-15 min), przesuń górny szkiełko, aby je usunąć. Przytnij podkładkę agarozową żyletką lub nożem. Następnie odpipetować pipetą 2,5 μl kultury (krok 1.3) i nałożyć szkiełko nakrywkowe na wierzch.</li>
	<li>Uszczelnij przestrzeń między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym żywicą epoksydową (patrz tabela materiałów). Pozostawić żywicę epoksydową do wyschnięcia, a komórki osiądą na poduszce agarozowej przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Timelapse mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Umieścić przygotowaną próbkę (krok 1.3) pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz tabela materiałów) w środowisku ogrzewanym i utrzymywanym w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Ustaw czasy naświetlania odpowiednie dla aparatu używanego do robienia zdjęć. Dostosuj intensywność oświetlenia, aby zminimalizować fotowybielanie. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano czas ekspozycji wynoszący 2 s dla każdej długości fali.</li>
		<li>Dla każdej długości fali znajdź pole widzenia (FOV) zawierające minimalną fluorescencję. Zdobądź obrazy do wykorzystania podczas analizy w celu odejmowania tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj protokół, aby rejestrować obrazy w siatce na różnych długościach fal i w regularnych odstępach czasu.
	<ol>
		<li>Zakoduj fotografię poklatkową w protokole. Ustaw częstotliwość akwizycji na żądany przedział czasu (tutaj 20 minut), a całkowity czas trwania timelapse na żądaną długość (24 h).</li>
		<li>Zakoduj odpowiednie długości fal w protokole (w zależności od użytej konstrukcji). 
		UWAGA: Szczyt wzbudzenia mCherry przypada na 587 nm, a pik emisji na 610 nm21; mVenus znajduje się w odległości 515 nm i 527 nm12, podczas gdy mCerulean3 jest w odległości 433 nm i 475 nm11.</li>
		<li>Ustaw rozmiar siatki, aby przechwycić żądaną liczbę FOV. 
		UWAGA: W przedstawionych tutaj reprezentatywnych danych użyto pól widzenia 8 x 8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Wykonaj odejmowanie tła na każdym kanale koloru, używając odpowiednich obrazów tła uzyskanych w kroku 3.1.2. Do wszystkich etapów analizy używamy standardowych modułów na platformie open-source Fiji22 (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przybliż całkowitą populację w każdym momencie, progując kanał mCerulean i dzieląc obszar progowy przez średni obszar komórki.</li>
	<li>Aby policzyć unikalne zdarzenia wycinania, weź pochodną czasu kanału mCerulean3. Wykonaj to poprzez odjęcie kolejnych obrazów w kanale mCerulean3. Zdarzenia wycinania zostaną wykryte w pochodnej czasowej jako jasny błysk fluorescencji.
	<ol>
		<li>Próg stosu zdarzeń wycinania w celu wyeliminowania niepożądanej fluorescencji. Należy pamiętać, że ten proces spowoduje wykluczenie części samych wycięć. Aby rozwiązać ten problem, rozszerz obrazy, aby przywrócić wycięcia do ich oryginalnych rozmiarów. 
		UWAGA: Analizy przy użyciu podobnych technik progowania i analizy obrazu można przeprowadzić również na innych kanałach fluorescencyjnych (np. skorelować zdarzenia wycinania z poziomami transpozazy TnpA [żółta fluorescencja Wenus] i TnpB [czerwona fluorescencja mCherry].</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li>
<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+in+tumors+and+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11(2014).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li>
<li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR%2FO%2C+the+TetR%2FO+and+AraC%2FI1-I2+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li>
<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
<li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896(2011).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li>
<li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori%3A+nonrandom+geographic+distribution%2C+functional+organization%2C+and+insertion+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).</li>
<li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+insertion+sequences%3A+their+genomic+impact+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li>
<li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+IS200%2FIS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li>
<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
<li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS200%2FIS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiona tutaj unikalna metoda obrazowania w czasie rzeczywistym aktywności pierwiastków transpozycyjnych w żywych komórkach jest czułym testem, który może bezpośrednio wykrywać transpozycję w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym oraz korelować tę aktywność z ekspresją białek pomocniczych. Chociaż przepustowość jest niższa niż można osiągnąć metodami masowymi, metoda ta pozwala na szczegółowe pomiary aktywności TE i ekspresji białek w poszczególnych żywych komórkach.
Różnorodne narzęd...

Elementy transpozycyjne (TE) to elementy genetyczne, które mobilizują się w genomach gospodarza poprzez wycinanie lub katalizowanie kopiowania, po którym następuje reintegracja genomu. TE występują we wszystkich dziedzinach życia, a transpozycja restrukturyzuje genom gospodarza, mutując regiony kodujące i kontrolne1. Generuje to mutacje i różnorodność, które odgrywają ważną rolę w ewolucji2,3, development4,5 i kilku chorobach ludzkich6, w tym cancer7.
Korzystając z nowatorskich konstruktów genetycznych, które łączą aspekty aktywności transpozycyjnej z fluorescencyjnymi reporterami, nasza poprzednia praca opisała rozwój eksperymentalnego systemu opartego na bakteryjnym TE IS608, przedstawicielu szeroko rozpowszechnionej rodziny TE IS200/IS605, który pozwala na wizualizację transpozycji w czasie rzeczywistym w pojedynczych żywych komórkach8 (Rysunek 1). System TE jest wyświetlany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. TE składa się z sekwencji kodującej transpozazę, tnpA, otoczonej niedoskonałymi powtórzeniami palindromicznymi (IP) lewego końca (LE) i prawego końca (RE), które są miejscami rozpoznawania i wycinania TnpA. tnpA ulega ekspresji za pomocą promotora PLTetO1, który jest tłumiony przez represor tet i jest indukowany za pomocą anhydrotetracykliny (aTc)9. TE rozdziela sekwencje -10 i -35 konstytutywnego promotora PlacIQ1 10 dla niebieskiego reportera mCerulean311. Jak pokazano w Rysunek 1C, gdy produkcja tnpA jest indukowana, TE może zostać wycięty, co prowadzi do rekonstytucji promotora. Wyprodukowana komórka ulega ekspresji mCerulean3 i fluoryzuje na niebiesko. N-koniec TnpA jest połączony z żółtym reporterem Venus12, co umożliwia pomiar poziomów TnpA za pomocą żółtej fluorescencji.
IS608 i inni członkowie rodziny transpozonów IS200/IS605 zazwyczaj kodują również drugi gen nieznanej dotąd funkcji, tnpB13. Białka TnpB są niezwykle liczną, ale niedoskonale scharakteryzowaną rodziną nukleaz kodowaną przez kilka bakteryjnych i archeonów TEs14,15, które często składają się tylko z tnpB16. Co więcej, ostatnie badania odnowiły zainteresowanie TnpB, stwierdzając, że TnpB działa jako programowalna endonukleaza sterowana RNA podobna do CRISPR/Cas, która w różnych warunkach spowoduje pęknięcia dsDNA lub ssDNA17,18. Nie jest jednak jasne, jaką rolę TnpB może odgrywać w regulowaniu transpozycji. Aby przeprowadzić wizualizację w czasie rzeczywistym wpływu TnpB na transpozycję IS608, stworzono wersję transpozonu, w tym region kodujący TnpB z N-końcową fuzją z czerwonym białkiem fluorescencyjnym mCherry.
Uzupełniając bardziej szczegółowe badania na poziomie masowym przeprowadzone przez klasę Kuhlman lab<sup="xref">19, pokazano tutaj, jak obrazowanie aktywności transpozonów w czasie rzeczywistym może ilościowo ujawnić wpływ TnpB lub innych białek pomocniczych na dynamikę transpozycji. Poprzez fuzję TnpB z mCherry, poszczególne zdarzenia transpozycyjne są identyfikowane za pomocą niebieskiej fluorescencji i korelowane z poziomami ekspresji TnpA (żółta fluorescencja) i TnpB (czerwona fluorescencja).

<table><tbody><tr><td>2 Ton Clear Epoxy</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek anhydrotetracykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>Argon Laser</td><td>Melles Griot</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska kostka filtracyjna</td><td>Chroma</td><td>Przykład: Z457/10X, EM: ET485/30M</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>wycofany</td></tr><tr><td>z produkcji Eppendorf epTIPS Pudełka i tacki uzupełniające, objętość: 0,1 do 10 i mikro; L, Długość: 3,4 cm, 1,33 cala, PP (polipropylen)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Pudełka i tacki uzupełniające, Pojemność: 50 do 1000 i mikro; L, Długość: 7,1 cm, 2,79 cala, PP (Polipropylen)</td><td>Eppendorf Ameryka Północna Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelaza Acs 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>706834</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td></td><td></td><td>Fidżi (imagej.net)</td></tr><tr><td>Odczynniki Fisher&nbsp;Rosół LB, Miller (granulowany)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnica szklana</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan Kanamycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu Cert Ac</td><td>Fisher Scientific</td><td>XXM63SP3KG</td><td></td></tr><tr><td>Grzałka mikroskopu</td><td>World Precision Instruments</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III Etap</td><td>Poprzedni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czerwona kostka filtra</td><td>Chroma</td><td>Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire 561 LP Laserowa</td><td>koherentna</td><td></td> szkiełko 1170412<td></td></tr><tr><td>, mikroskop</td><td>Fisher Scientific</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tiaminy</td><td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 Laser Launch</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>Przykład: Z514/10X, Em: ET535/30M</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja w czasie rzeczywistym wpływu tnpb związanego z rodziną is200/is605 na aktywność transpozonów

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania na żywo w czasie rzeczywistym obrazowania aktywności elementów transpozycyjnych w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą zestawu fluorescencyjnych reporterów sprzężonych z transpozycją. W szczególności pokazano, w jaki sposób obrazowanie w czasie rzeczywistym może być wykorzystane do oceny wpływu białka pomocniczego TnpB na aktywność elementu transpozycyjnego IS608, należącego do rodziny elementów transpozycyjnych IS200/IS605. Rodzina elementów transpozycyjnych IS200/IS605 to liczne elementy ruchome związane z jednym z najbardziej niezliczonych genów występujących w przyrodzie, tnpB. Homologie sekwencji sugerują, że białko TnpB może być ewolucyjnym prekursorem systemów CRISPR/Cas9. Ponadto TnpB spotkał się z ponownym zainteresowaniem, ponieważ wykazano, że działa jako endonukleaza DNA sterowana RNA podobna do Cas. Wpływ TnpB na szybkość transpozycji IS608 jest określony ilościowo i wykazano, że ekspresja TnpB IS608 powoduje ~5-krotnie zwiększoną aktywność transpozonów w porównaniu z komórkami pozbawionymi ekspresji TnpB.

Ta metoda wizualizacji aktywności transpozonów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, mimo niższej przepustowości niż w przypadku pomiarów fluorescencji zbiorczej, umożliwia bezpośrednią obserwację aktywności transpozonów w pojedynczych żywych komórkach. Zdarzenia wycięcia transpozonu prowadzą do rekonstytucji promotora dla mCerulean3 (Rysunek 1), co pozwala na identyfikację komórek wykazujących aktywność transpozonów poprzez jasną niebieską fluorescencję (<strong class="...

Protokół A jest opisany do wykonywania obrazowania na żywo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia, jak białko pomocnicze TnpB wpływa na dynamikę transpozycji w poszczególnych żywych komórkach Escherichia coli.

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym wpływu TnpB związanego z rodziną IS200/IS605 na aktywność transpozonów

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

Protokół ten pozwala nam określić ilościowo statystyki wycinania na podstawie pojedynczej komórki, w przeciwieństwie do patrzenia na zachowanie masowe. Na tym poziomie możemy śledzić zachowanie poszczególnych komórek w czasie, w tym ich poziomy TnpA i TnpB dla komórek, które wycinają się w porównaniu z komórkami, które tego nie robią, co może pozwolić nam, na przykład, zmierzyć wpływ zidentyfikowanych zdarzeń mutacyjnych na tempo wzrostu. Ta metoda jest prostym i tanim sposobem pomiaru dynamiki mutacji w żywych komórkach.Ogólne podejście ma zastosowanie do każdego systemu, który wymaga obrazowania fluorescencyjnego na żywych komórkach. Przygotuj szkiełko, gotując M63 z 0,5% glukozy i 1,5% agarozą w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę. Upewnij się, że podłoże jest całkowicie stopione i dobrze wymieszane.Pozostaw mieszaninę do ostygnięcia do 55 stopni Celsjusza przed dodaniem antybiotyków i induktorów. Umieść szkiełko mikroskopowe na stole warsztatowym. Ułóż jedną szkiełko prostopadle do pierwszej.Upewnij się, że między dolnym a górnym suwakiem jest szczelina równa jednej grubości prowadnicy. Powoli odpipetować jeden mililitr mieszaniny agarozy M63 do szczeliny między szkiełkiem, aby utworzyć mały żelowy kwadrat. Gdy żel stwardnieje, przesuń górny szkiełko, aby je wyjąć.Przytnij podkładkę agarozową żyletką lub nożem. Następnie odpipetować pipetą 2,5 mikrolitra kultury bakteryjnej i nałożyć szkiełko nakrywkowe na wierzch. Uszczelnij przestrzeń między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym żywicą epoksydową.Pozostaw żywicę epoksydową do wyschnięcia, a komórki osiądą na podkładce agarozowej na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotować próbkę umieścić pod mikroskopem fluorescencyjnym w środowisku nagrzanym i utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dla każdej długości fali znajdź pole widzenia zawierające minimalną fluorescencję.Skonfiguruj protokół, aby rejestrować obrazy w siatce na różnych długościach fal i w regularnych odstępach czasu. Zdarzenia wycinania transpozonów skutkują rekonstytucją promotora mCerulean3, co pozwala na identyfikację komórek poddanych aktywności transpozonów za pomocą jasnoniebieskiej fluorescencji. TnpB zwiększa szybkość wycinania transpozonów.Komórki wykazujące ekspresję białka pomocniczego TnpB doświadczają od czterech do pięciu razy wyższych poziomów aktywności transpozonów w porównaniu z komórkami TnpB-ujemnymi. W komórkach TnpB-dodatnich komórki poddawane wycięciu transpozonu mają wyższy poziom ekspresji mCherry TnpB niż w populacji ogólnej. Co więcej, w przypadku komórek poddawanych wycięciu, komórki TnpB-dodatnie wyrażają tylko nieznacznie wyższe poziomy transpozazy żylnej TnpA niż komórki TnpB-ujemne, co jest wyższe niż żółta fluorescencja populacji ogólnej.Najbardziej prawdopodobnym miejscem do zmagań jest przygotowanie kultury komórkowej do eksperymentu. Należy upewnić się, że komórki są hodowane do fazy wykładniczej i że szkiełko jest zaszczepione odpowiednią liczbą komórek. Pamiętaj, aby podczas uszczelniania szkiełka uważać na bąbelki, aby żel agarozowy nie wysechł.

real-time-quantification-effects-is200is605-family-associated-tnpb-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Kazi, M. I., et al., Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. J . Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje selekcję, kwantyfikację i zachowanie bakterii biorców Gram-ujemnych przenoszących inserpozycje transpozonów w oparciu o oporność na kanamycynę.

Izolacja bakterii Gram-ujemnych z insercją transpozonów genomowych

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mutagenezę za pośrednictwem transpozonu mini-himar1 mariner do generowania biblioteki mutantów insercyjnych o wysokiej gęstości do badania, izolacji i identyfikacji nowych regulatorów alginianu w prototypowym szczepie Pseudomonas aeruginosa PAO1.

Identyfikacja nowych genów związanych z produkcją alginianów u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu mutagenezy za pośrednictwem transpozonu Mini-himar1 Mariner

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Tutaj przedstawiamy proces korzystania z systemu TetON w celu osiągnięcia specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego.

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Opisujemy tutaj technikę, która łączy mutagenezę transpozonów z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji i ilościowego określenia transpozonów mutantów leptospiralnych w tkankach po wyzwaniu chomików. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych mutantów pod kątem przeżycia i rozprzestrzeniania się u zwierząt, a także może być stosowany w badaniach in vitro.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

To jest dostosowana metoda identyfikacji potencjalnych czynników kolonizacji owadów w korzystnym symbiontie Burkholderia. Gospodarz chrząszcza jest zainfekowany losową zmutowaną biblioteką wygenerowaną przez mutagenezę transpozonów, a złożoność biblioteki po kolonizacji jest porównywana z kontrolą wyhodowaną in vitro.

Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa

Poznaj metodę obrazowania w czasie rzeczywistym do kwantyfikacji aktywności transpozonów w komórkach Escherichia coli. Technika ta pozwala mierzyć dynamikę ekscyzji na poziomie pojedynczych komórek.

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym wpływu TnpB związanego z rodziną IS200/IS605 na aktywność transpozonów

Przeglądaj więcej filmów