Name: In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj technikę obrazowania wapniowego w zwojach korzenia grzbietowego myszy Pirt-GCaMP3. Metoda umożliwia monitorowanie do 1800 neuronów czuciowych w odpowiedzi na bodźce mechaniczne i termiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01DE026677 and R01DE031477 (do Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.), Rising STAR Award od University of Texas System (Y.S.K.), oraz Craniofacial Oral-biology Student Training in Academic Research (COSTAR) National Institute of Health Grant 5T32DE014318 (J.S.).

<ol><li>Rivero-Melián, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li>
<li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurology+and+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li>
<li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li>
<li>Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li>
<li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li>
<li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li>
<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li>
<li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233(2021).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651(2019).</li>
<li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li>
<li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990(2016).</li>
<li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li>
<li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li>
<li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+phosphoinositide-binding+protein%2C+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cytoNet%3A+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846(2022).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li>
<li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons%3A+modulation+by+capsaicin%2C+menthol+and+mustard+oil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171(2015).</li>
<li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li>
<li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li>
<li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca%282%2B%29+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li>
<li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+sensing+by+Na%28V%291.8-positive+and+Na%28V%291.8-negative+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li>
<li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225(2020).</li>
<li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa%3A+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810(2021).</li>
<li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li>
<li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca%282%2B%29+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li>
<li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li>
<li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li>
<li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li>
<li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Uporczywy ból występuje w szerokim zakresie zaburzeń, powodując osłabienie i/lub obniżenie jakości życia u około 8% osób29. Pierwotne neurony czuciowe wykrywają szkodliwe bodźce na skórze, a ich plastyczność przyczynia się do uporczywego bólu8. Podczas gdy neurony mogą być badane w hodowli komórkowej i eksplantatach, usuwa to je z ich normalnego kontekstu fizjologicznego. Chirurgiczne naświetlenie DRG, a następnie obrazowanie Pirt-GCaMP3 Ca2 +, pozwala na badanie...

Pierwotne neurony czuciowe bezpośrednio unerwiają skórę i przenoszą informacje somatosensoryczne z powrotem do ośrodkowego układu nerwowego1,2. Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to skupiska komórek składające się z 10 000-15 000 pierwotnych neuronów czuciowych3,4. Neurony DRG mają różną wielkość, poziomy mielinizacji oraz wzorce ekspresji genów i receptorów. Neurony o mniejszej średnicy obejmują neurony odczuwające ból, a neurony o większej średnicy zazwyczaj reagują na niebolesne bodźce mechaniczne5,6. Zaburzenia w pierwotnych neuronach czuciowych, takie jak urazy, przewlekłe stany zapalne i neuropatie obwodowe, mogą uwrażliwiać te neurony na różne bodźce i przyczyniać się do przewlekłego bólu, allodynii i nadwrażliwości na ból7,8. Dlatego badanie neuronów DRG jest ważne dla zrozumienia zarówno somatosensacji ogólnie, jak i wielu zaburzeń związanych z bólem i swędzeniem.
Neurony uruchamiane in vivo są niezbędne do somatosensacji, ale do niedawna narzędzia do badania nienaruszonych zwojów in vivo były ograniczone do stosunkowo małej liczby komórek9. W tym miejscu opisujemy potężną metodę badania potencjałów czynnościowych lub aktywności neuronów na poziomie populacji in vivo jako zespołu. Metoda wykorzystuje obrazowanie w oparciu o cytoplazmatyczną dynamikę Ca2+. Wskaźniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2 + są dobrymi wskaźnikami zastępczymi do pomiaru aktywności komórkowej ze względu na zwykle niskie stężenie cytoplazmatycznego Ca2 +. Wskaźniki te umożliwiły jednoczesne monitorowanie setek do kilku tysięcy pierwotnych neuronów czuciowych u myszy9,10,11,12,13,14,15,16 i rats17. Opisana w tym badaniu metoda obrazowania Ca2+ in vivo może być wykorzystana do bezpośredniej obserwacji reakcji na poziomie populacji na bodźce mechaniczne, zimne, termiczne i chemiczne.
Białko błonowe wiążące fosfoinozytyd, Pirt, ulega ekspresji na wysokim poziomie w prawie wszystkich (>95%) pierwotnych neuronach czuciowych18,19 i może być używane do sterowania ekspresją czujnika Ca2+, GCaMP3, do monitorowania aktywności neuronów in vivo20. W tym protokole opisano techniki wykonywania operacji DRG in vivo, obrazowania Ca2 + i analizy w prawym odcinku lędźwiowym 5 (L5) DRG myszy Pirt-GCaMP3 14 przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (LSM).

<table><tbody><tr><td>Anazed Injection (ksylazyna)</td><td>Covetrus, Akorn</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td><td>Cal Zeiss</td><td>422642-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>McKesson</td><td>24-106-1S Zakrzywiony</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13007-12</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury DC</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury DC Poduszka grzewcza</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze z powłoką ceramiczną Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury FHC DC</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso (izofluran)</td><td>MWI Zdrowie zwierząt, Grupa Piramal</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (Ketamina)</td><td>Zoetis</td><td>KET-00002R2</td><td></td></tr><tr><td>Luminescencyjna zielona taśma sceniczna</td><td>JSITON/ Amazon</td><td>B803YW8ZWL</td><td></td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000 Waporyzator izofluranowy</td><td>Midmark</td><td>91305430</td><td></td></tr><tr><td>Mikro nożyczki preparacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Mikro sprężyna preparcyjna nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr> Mikro sprężynowe <tr><td>nożyczki preparacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Mini sonda termistora doodbytniczego</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J myszy</td><td>Uniwersytet Johnsa Hopkinsa</td><td>N/A</td><td>Każda płeć może być równie dobrze zobrazowana. Myszy powinny mieć co najmniej 8 tygodni ze względu na słabą lub przerywaną ekspresję promotora Pirt u młodszych myszy.</td></tr><tr><td>Algometr dla małych zwierząt SMALGO</td><td>Bioseb Instrumenty badawcze In vivo</td><td>BIO-SMALGO</td><td></td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna</td><td>Kopf Model 923-B</td><td>923-B</td><td></td></tr><tr><td>td-Tomato C57BL/6J myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>Płyta górna, 6 cali x 10 cali</td><td>Newport</td><td>290-TP</td><td></td></tr><tr><td>TrpV1-CRE C57BL/6J myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>17769</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 800</td><td>Cal Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zeiss Zen 2.6 Blue Edition</td><td>Cal Zeiss</td><td>Zen (Blue Edition) 2.6</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Obrazowanie Ca2+ może być używane jako wskaźnik aktywności komórkowej, w tym potencjałów czynnościowych i różnych mechanizmów sygnalizacyjnych obejmujących wejście Ca2+ do cytoplazmy lub uwolnienie wewnątrzkomórkowych zapasów Ca2+. Obrazowanie Ca2+ oparte na Pirt-GCaMP3 pierwotnych neuronów czuciowych zwoju korzenia grzbietowego (DRG) u myszy ma tę zaletę, że umożliwia jednoczesny pomiar dużej liczby komórek. Można monitorować do 1800 neuronów, co pozwala na badanie sieci neuronalnych i procesów somatosensorycznych jako zespołu w ich normalnym kontekście fizjologicznym na poziomie populacji in vivo. Duża liczba monitorowanych neuronów pozwala na wykrycie wzorców aktywności, które byłyby trudne do wykrycia przy użyciu innych metod. Bodźce można stosować do tylnej łapy myszy, co pozwala na badanie bezpośredniego wpływu bodźców na zespół neuronów DRG. Liczba neuronów wytwarzających stany przejściowe Ca2+, a także amplituda stanów przejściowych Ca2+ wskazuje na wrażliwość na określone modalności sensoryczne. Średnica neuronów dostarcza dowodów na aktywowane typy włókien (nieszkodliwe włókna mechaniczne vs. szkodliwe włókna bólowe, włókna Aβ, Aδ i C). Neurony wyrażające określone receptory mogą być genetycznie znakowane td-Tomato i specyficznymi rekombinazami Cre razem z Pirt-GCaMP. W związku z tym obrazowanie Pirt-GCaMP3 Ca2+ DRG stanowi potężne narzędzie i model do analizy określonych modalności sensorycznych i podtypów neuronów działających jako zespół na poziomie populacji w celu badania bólu, swędzenia, dotyku i innych sygnałów somatosensorycznych.

<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy zwojów korzeni grzbietowych L5 myszy Pirt-GCaMP3. (A,D) Przedstawiono pojedyncze klatki skanów o wysokiej rozdzielczości zwojów korzeni grzbietowych L5 myszy Pirt-GCaMP3. (B,E). Projekcje średniej intensywności 15 klatek zwojów L5 DRG myszy Pirt-GCaMP3 odpowie...

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Liczba neuronów monitorowanych za pomocą tej metody pozwala na zbieranie danych o sieci neuronowej, które byłyby niemożliwe przy użyciu starszych lub innych metod. Główną zaletą tej techniki jest możliwość monitorowania jednocześnie prawie 2 000 pierwotnych neuronów czuciowych, reagujących bezpośrednio na bodźce przykładane do tylnej łapy. Procedura ta jest szczególnie przydatna do badania interwencji terapeutycznych w przypadku allodynii obwodowej i nadwrażliwości na ból.Metoda ta może być dostosowana do badania zwojów nerwu trójdzielnego lub kolankowatego lub stosowana z genetycznie kodowanymi czujnikami cząsteczek napięciowych lub sygnałów komórkowych, takich jak cykliczny AMP. Wykonanie tej operacji wymaga praktyki. Możesz ćwiczyć na maksymalnie sześciu zwojach korzenia grzbietowego na jednym zwierzęciu.Procedurę zademonstruję ja, z pomocą Johna Shannonhouse'a i pana Rubena Gomeza. Na początek umieść mysz na podgrzewanej podkładce, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza. Zlokalizuj powiększenie odcinka lędźwiowego, czując kość miednicy myszy.Następnie ogol grzbiet myszy powyżej obszaru powiększenia odcinka lędźwiowego. Za pomocą nożyczek wykonaj trójstro

in-vivo-calcium-imaging-neuronal-ensembles-networks-primary-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Obecny protokół opisuje obrazowanie wapnia in vivo do pomiaru odpowiedzi zespołów neuronów DRG lędźwiowych-6 na bodźce somatyczne i trzewne. Można dokonać dokładnych porównań między neuronami reagującymi na różne bodźce. Protokół ten jest cenny w badaniu mechanizmów bólu trzewnego i stymulacji somatycznej, takich jak akupunktura.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe reakcji neuronów zwojów korzenia grzbietowego na bodźce somatyczne i trzewne

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

To badanie przedstawia chirurgiczną manipulację polegającą na uwidocznieniu T-DRG u znieczulonych myszy do obrazowania wapnia in vivo, wraz z synchronicznymi zapisami EKG. Metoda ta stanowi najnowocześniejsze narzędzie do badania obwodowej stymulacji nerwów elektrycznych i danych wejściowych narządów trzewnych klatki piersiowej, a także ich interakcji na podstawowym poziomie sensorycznym.

Obrazowanie in vivo wapnia zwojów korzenia grzbietowego klatki piersiowej (DRG) i zapis EKG w celu badania stymulacji nerwów obwodowych

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

W tym artykule przedstawiamy szybką mikrojonoforezę neuroprzekaźników jako technikę badania integracji sygnałów postsynaptycznych z dużą precyzją przestrzenną i czasową.

Szybka mikrojonoforeza glutaminianu i GABA: przydatne narzędzie do badania integracji synaptycznej

Wszczepianie zorganizowanych układów mikroprzewodów do użycia w jednojednostkowych zapisach elektrofizjologicznych stanowi szereg wyzwań technicznych. Opisano również metody wykonywania tej techniki i niezbędny sprzęt. Omówiono również korzystne wykorzystanie zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrywania z różnych podregionów neuronowych o wysokiej selektywności przestrzennej.

Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt

Poznaj technikę obrazowania wapniowego w zwojach korzenia grzbietowego myszy Pirt-GCaMP3. Metoda umożliwia monitorowanie do 1800 neuronów czuciowych w odpowiedzi na bodźce mechaniczne i termiczne.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Przeglądaj więcej filmów