In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca²⁺; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca^{2 +} obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

Liczba neuronów monitorowanych za pomocą tej metody pozwala na zbieranie danych o sieci neuronowej, które byłyby niemożliwe przy użyciu starszych lub innych metod. Główną zaletą tej techniki jest możliwość monitorowania jednocześnie prawie 2 000 pierwotnych neuronów czuciowych, reagujących bezpośrednio na bodźce przykładane do tylnej łapy. Procedura ta jest szczególnie przydatna do badania interwencji terapeutycznych w przypadku allodynii obwodowej i nadwrażliwości na ból.

Metoda ta może być dostosowana do badania zwojów nerwu trójdzielnego lub kolankowatego lub stosowana z genetycznie kodowanymi czujnikami cząsteczek napięciowych lub sygnałów komórkowych, takich jak cykliczny AMP. Wykonanie tej operacji wymaga praktyki. Możesz ćwiczyć na maksymalnie sześciu zwojach korzenia grzbietowego na jednym zwierzęciu.

Procedurę zademonstruję ja, z pomocą Johna Shannonhouse'a i pana Rubena Gomeza. Na początek umieść mysz na podgrzewanej podkładce, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza. Zlokalizuj powiększenie odcinka lędźwiowego, czując kość miednicy myszy.

Następnie ogol grzbiet myszy powyżej obszaru powiększenia odcinka lędźwiowego. Za pomocą nożyczek wykonaj trójstronne prostokątne nacięcie nad powiększeniem odcinka lędźwiowego i odgiń skórę kleszczami. Użyj 13-milimetrowych sprężynowych nożyczek preparacyjnych, aby wykonać od trzech do czterech milimetrowych nacięć po prawej stronie kręgosłupa.

Użyj nożyczek, aby odciąć skórę i mięśnie na boki, aby odsłonić kręgosłup. Następnie za pomocą ośmiomilimetrowych nożyczek odetnij mięsień i tkankę łączną, aby oczyścić wyrostek poprzeczny prawej strony L5 DRG. Staraj się zminimalizować krwawienie, używając bawełny lub pianki żelowej do wchłaniania krwi.

Rozetnij prawą stronę wyrostka poprzecznego L5 za pomocą rongeurów Friedmana-Pearsona lub mocnych cienkich kleszczy, uważając, aby nie dotknąć DRG. Następnie przesuń mysz i poduszkę grzewczą na niestandardową scenę. Użyj taśmy scenicznej, aby zabezpieczyć zwierzę i poduszkę grzewczą na miejscu.

Umieść nos zwierzęcia w stożku nosowym w celu ciągłego znieczulenia izofluranem. Zabezpiecz prawą tylną łapę wystającą do pozycji poza sceną, aby ułatwić aplikację bodźców. Zabezpiecz kręgosłup na miejscu za pomocą zacisków etapowych na skórze kręgów lub kości miednicy, tylko rostralnie i ogonowo do L5 DRG.

Wyreguluj zaciski i stolik tak, aby powierzchnia DRG była jak najbardziej równa. Następnie umieść stolik pod mikroskopem tak, aby obiektyw znajdował się bezpośrednio osiem milimetrów nad DRG po opuszczeniu. Włóż termometr doodbytniczy.

Podłącz przewody zasilające do poduszki grzewczej i termometru doodbytniczego. Podłączyć stożek nosowy do przewodów gazowych izofluranu. Użyj pionowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 10x 0,4 DIC i odpowiednim oprogramowaniem do obrazowania.

Użyj ustawień zielonego filtra FITC: wzbudzenie przy 495 nanometrach, emisja przy 519 nanometrach i długość fali wykrywania od 500 do 580 nanometrów. Pod mikroskopem znajdź powierzchnię DRG. Wyreguluj zaciski na stoliku tak, aby powierzchnia DRG była jak najbardziej płaska, a maksymalna powierzchnia była wizualizowana w płaszczyźnie ogniskowej.

Monitorować zwierzę przez cały czas trwania zabiegu, aby utrzymać znieczulenie izofluranem bez przedawkowania. Aby załadować protokół szybkiego skanowania mikroskopu, użyj typowych ustawień rozmiaru woksela 2.496 na 2.496 na 16 mikronów, 512 na 512 pikseli, 10 optycznych plasterków Z-stack, jedną jednostkę Airy na 32 mikrometry, 1% moc lasera 488 nanometrów i pięć miliwatów, czas piksela 1.52 mikrosekundy, czas linii 0.91 milisekundy, czas klatki 465 milisekund, prędkość skanowania LSM wynosząca osiem, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora PMT 650 woltów i wzmocnienie cyfrowe jednego. Wykonaj krótkie, ośmiocyklowe skanowanie DRG, klikając Rozpocznij eksperyment w zakładce Akwizycja.

Utwórz film, wykonując ortogonalne rzutowanie skanów przy jednym skanie na klatkę w czasie. Ręcznie sprawdź klarowność obrazu i artefakty obrazu, takie jak fale jasności przechodzące przez DRG. Dostosuj pozycję zacisku i grubość przekroju optycznego, a następnie powtarzaj ten krok, aż do uzyskania wyraźnego filmu o wysokiej jakości.

Następnie załaduj protokół skanowania mikroskopu o wysokiej rozdzielczości przy użyciu typowych ustawień rozmiaru woksela 1,248 na 1,248 na 14 mikronów, 1024 na 1024 pikseli, sześciowarstwowy stos optyczny Z, 1,2 jednostki Airy lub 39 mikrometrów, 5% moc lasera 488 nanometrów i 25 miliwatów, czas piksela 2,06 mikrosekundy, czas linii 4,95 milisekundy, czas klatki 5,06 sekundy, prędkość skanowania LSM wynosząca sześć, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora PMT przy 650 woltach i wzmocnienie cyfrowe jednego. Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment na karcie Akwizycja, aby utworzyć obraz DRG w wysokiej rozdzielczości. Załaduj protokół szybkiego skanowania mikroskopu i rejestruj spontaniczną aktywność w DRG przez 80 cykli.

Wygeneruj film z projekcją ortogonalną i sprawdź, czy obraz jest wystarczającej jakości do analizy. Aby zastosować bodźce, ustaw mikroskop tak, aby wykonał od 15 do 20 skanów. Poczekaj na zakończenie skanów od jednego do pięciu, aby utworzyć linię bazową.

Zastosuj bodziec podczas skanów od sześciu do dziesięciu. Odczekaj co najmniej pięć minut po każdym bodźcu przed zastosowaniem następnego, aby zapobiec odczulaniu. W przypadku prasy mechanicznej przytrzymaj szczypce algometru łapą między łopatkami, nie dotykając łapy.

Ściśnij łapę, zaczynając natychmiast po zakończeniu skanowania piątego i zatrzymując natychmiast po skanowaniu 10. Monitoruj siłę nacisku za pomocą algometru i upewnij się, że nie przekracza ona 10 g powyżej żądanej siły. W przypadku bodźców termicznych podgrzej zlewkę z wodą do temperatury nieco powyżej żądanej.

Gdy woda osiągnie odpowiednią temperaturę, zastosuj bodziec natychmiast po skanowaniu piątym, zanurzając łapę w wodzie. Odciągnąć zlewkę natychmiast po skanowaniu 10. Chirurgiczna ekspozycja L5 DRG, a następnie mikroskopia konfokalna pozwoliła na jednoczesne zobrazowanie do 1800 neuronów przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3.

Pierwotne neurony czuciowe obserwowano w zespole na poziomie populacji dla spontanicznych stanów przejściowych wapnia przy braku bodźców i w odpowiedzi na bodźce w ich normalnym kontekście fizjologicznym. Silne bodźce lub szkodliwe ciepło zwiększały odpowiedź wapniową. W porównaniu z uciskaniem 100 g, wyciskanie 300 g zwiększało liczbę neuronów wytwarzających stany przejściowe wapnia i obszar delta F o F0 pod krzywą.

Ciepłe ciepło w nieszkodliwym zakresie temperatur od 21 do 45 stopni Celsjusza zwiększyło liczbę neuronów wytwarzających stany przejściowe wapnia i obszar delta F o F0 pod krzywą. Nieszkodliwe temperatury aktywowały mniejszą liczbę neuronów wytwarzających stany przejściowe w porównaniu ze szkodliwym bodźcem cieplnym o temperaturze 57 stopni Celsjusza. Co więcej, neurony o mniejszej i średniej średnicy wytwarzały przejściowy wapń spontanicznie i pod wpływem wszystkich bodźców, ale neurony o większej średnicy wytwarzały przejściowe wapń tylko w odpowiedzi na bodziec 300 g prasy.

DRG powinien być równy i mieć optymalną grubość warstwy optycznej. Powinien być taki, że można wykryć maksymalną liczbę komórek i nie ma falistości w filmie. Technika ta została wykorzystana do analizy modalności sensorycznych na poziomie populacji dla somatoczucia i smaku oraz do badania sąsiednich neuronów aktywujących się w parach lub w zsynchronizowanych klastrach przyczyniających się do przewlekłego i neuropatycznego bólu.