Name: Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Poznaj metodę Z-REX do analizy sygnalizacji małocząsteczkowej u larw Danio rerio. Technika ta pozwala precyzyjnie badać wpływ ligandów na odpowiedzi sygnalizacyjne w kontekście badań nad rakiem piersi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie: Novartis FreeNovation, NCCR i EPFL.

<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
<li>Parvez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REX+on-demand+redox+targeting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">T-REX on-demand redox targeting in live cells.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

Specyficzne dla izoform małocząsteczkowe inhibitory kinaz, których odkrycie umożliwiły technologie REX, zostały zgłoszone do wniosku patentowego

Z-REX opisany w tym protokole demonstruje solidną strategię badania par elektrofil-cel i dekonwolucji szlaków sygnałowych u żywych ryb. Podawanie ukierunkowane na odległość umożliwia dozowanie i kontrolę przestrzenną obróbki związkiem elektrofilowym. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod dozowania bolusa, w których suprafizjologiczne stężenia elektrofilu często prowadzą do problemów z niezamierzonym zapłonem, stosunkowo niewielka ilość elektrofilu uwalnianego do systemu sprawia, że Z-REX jest w dużej mierze nieinwazyjny. Użyliśmy 0,1-6 μM Ht-PreHNE (alkinu) w zarodkach danio pręgowanego, a wyniki wykazały, że leczenie nie jest szkodliwe dla rozwoju zarodka11.
Procedura Z-REX jest na ogół dłuższa niż T-REX, technika przesiewowa/badawcza białek wykrywających elektrofil w hodowanych komórkach. Załóżmy, że celem eksperymentu jest badanie przesiewowe pod kątem interakcji elektrofil-cel; sugerujemy najpierw przeprowadzenie szeroko zakrojonych badań przesiewowych za pomocą T-REX w hodowanych komórkach i użycie Z-REX do walidacji in vivo i analizy fenotypowej/szlaku. W porównaniu z hodowlą komórkową, wymagania dotyczące wykonania Z-REX to podstawowe techniki hodowli ryb, a także biochemiczne umiejętności eksperymentalne wymagane przez T-REX. Typowe ramy czasowe dla Z-REX (od skrzyżowania ryb do indukowanego światłem elektrofilu) to 2-3 dni, czyli nie więcej niż 1 dzień dłużej niż typowy czas eksperymentu T-REX na transfekowanych żywych komórkach. Obrazowanie na żywo do analizy fenotypowej można wykonać 2-10 godzin po oświetleniu światłem; sprzężenie zatrzaskowe z azydkiem biotyny do testu pull-down trwa 3 dni; qRT-PCR do oznaczania odpowiedzi transkrypcyjnej trwa 3 dni; Barwienie IF trwa 5 dni. Etapy te są z grubsza podobne do ich odpowiedników w hodowlach komórkowych, chociaż interpretacja danych wymaga zrozumienia fizjologii ryb i szczepów reporterowych.
Jako procedura wielu zmiennych12, kilka grup kontrolnych jest niezbędnych, aby Z-REX wykluczyć niepewności w wynikach (rysunek 1D). Wspólne grupy kontrolne to: (1) Tylko DMSO/leczenie nośnikiem; (2) obróbka sondą, ale bez oświetlenia świetlnego; (3) oświetlenie świetlne, ale bez obróbki sondą; (4) Konstrukcja P2A-split, w której Halo i POI są wyrażone oddzielnie, więc dostarczanie zbliżeniowe jest ablowane; oraz (5) mutanty hipomorficzne, których reszty elektrofilowe są zmutowane, takie jak Akt3 (C119S)6 i Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, których używaliśmy w poprzednich badaniach.
Jeśli dalsze testy obejmują analizę western blot, przed zbiorem należy przeprowadzić usuwanie żółtka. Białka żółtka zmniejszają wierność ocen stężenia lizatu i mogą wiązać się niespecyficznie z przeciwciałami. Podczas wykonywania obrazowania żywych ryb lub barwienia IF w całości zaobserwowaliśmy również niespecyficzne sygnały fluorescencyjne w woreczku żółtkowym, prawdopodobnie wynikające z białek autofluorescencyjnych w woreczku żółtkowym lub niespecyficznego wiązania samych przeciwciał. Jeśli sygnał autofluorescencji zakłóca sygnał, sugerujemy wykluczenie woreczka żółtkowego z kwantyfikacji lub osobne określenie ilościowe różnych regionów. Dechorynacja jest niezbędna do obrazowania żywych ryb i testu barwienia IF w całości. Kosmówka może zakłócać obrazowanie, a później kwantyfikację/liczenie komórek. Dechorynacja ma jednak zastosowanie tylko do zarodków starszych niż 1 dpf; Młodsze zarodki w stadium blastulacji/gastrulacji/segmentacji są zbyt delikatne, aby można je było zdechorionować.
Opisany tutaj protokół Z-REX opiera się na ektopowej ekspresji POI sterowanej mRNA. Procedura jest szybka w porównaniu z używaniem/generowaniem transgenicznych żyłek do ryb. Ekspresja sterowana mRNA jest wszechobecna i przejściowa i trwa co najmniej 2 dni w przypadku mRNA stosowanych w tym protokole. Jednak czas trwania odciągania może się różnić w innych przypadkach. W związku z tym podejście to zapewnia szybkie i bardziej globalne okno badawcze dotyczące skutków konkretnego zdarzenia znakowania elektrofilowego, kompatybilne z kilkoma testami o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości. Linie transgeniczne ze stabilną ekspresją Halo-POI w określonych tkankach są również kompatybilne z Z-REX11. Takie linie najlepiej sprawdzają się, gdy trzeba zadać bardziej precyzyjne pytanie, na przykład, gdy fenotyp w określonym narządzie jest przewidywany na podstawie danych z hodowli komórkowych lub gdy badania przesiewowe z eksperymentów z wstrzykiwaniem mRNA przewidują, że określony narząd jest wrażliwy na zdarzenie znakowania elektrofilowego. Specyficzną dla serca indukcję odpowiedzi antyoksydacyjnej za pomocą Z-REX wykazano przy użyciu Tg(gstp1:GFP; DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1) w naszej poprzedniej publikacji11. Możliwe jest również wykonanie Z-REX na transgenicznych rybach starszych niż 2 dpf.

Niezliczone zdarzenia sygnalizacji komórkowej obejmują reakcje między małymi cząsteczkami reaktywnymi (endogennie wytwarzanymi w komórce lub ksenobiotykami/ksenometabolitami, takimi jak leki) a ich celem białkowym. W wielu przypadkach substechiometryczny poziom takich zdarzeń wiązania kowalencyjnego może wywołać odpowiedzi komórkowe, prowadząc do zmian, na przykład, w rozwoju, metabolizmie, apoptozie i/lub odpowiedzi immunologicznej1. Jednak dekonstrukcja sposobu działania (MOA) poprzez powiązanie konkretnych zdarzeń wiązania z ich fenotypowymi konsekwencjami okazała się wyzwaniem. Tradycyjne metody dawkowania w bolusie, które polegają na wprowadzeniu wysokich stężeń reaktywnych gatunków, często skutkują modyfikacją wielu białek, a także nadmierną toksycznością dla organizmu modelowego2. Takie warunki są dalekie od ideału. Opracowano metodę rozwiązywania tych problemów w hodowli komórkowej przy użyciu precyzyjnego miejscowego dostarczania elektrofilu w natywnym kontekście komórkowym, o nazwie T-REX (targetable reactive electrophiles and oxidants)3. W kolejnych latach skupiono się na eksperymentach na całych organizmach, co daje możliwość badania białek w określonych kontekstach komórkowych w komórkach nieprzekształconych. W związku z tym rozszerzyliśmy technikę, aby była kompatybilna z kilkoma modelami, w tym z modelami zarodków Danio rerio. W niniejszym artykule przedstawiamy Z-REX (danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Aby zrozumieć Z-REX, ten artykuł najpierw przedstawia technologie REX i ich podstawowe koncepcje. Zasadniczo techniki te modelują endogenną fizjologiczną reaktywną sygnalizację form elektrofilowych (RES), naśladując sposób, w jaki naturalne elektrofile są wytwarzane lokalnie in vivo z precyzją czasoprzestrzenną. Białko będące przedmiotem zainteresowania (POI) jest wyrażane jako konstrukt fuzyjny do Halo; ten ostatni zakotwicza przepuszczalną tkankowo i obojętną sondę zawierającą fotoklatowany RES w stechiometrii 1:1. Jednym z takich endogennych RES jest 4-hydroksynonenal (HNE), który jest fotoklatowany w sondzie Ht-PreHNE. W wielu przypadkach używamy funkcjonalizowanej alkinami wersji HNE [tj. HNE(alkin)], która ma zasadniczo identyczne właściwości biologiczne jak HNE, ale może być oznaczona za pomocą chemii kliknięć. Sonda, która jest również funkcjonalizowana chloroalkanem w celu reaktywności z Halo, jest określana jako Ht-PreHNE (alkin). Kompleks fuzji Halo-POI i powstała w ten sposób sonda umożliwiają proksymalne dostarczanie OZE do stopionego punktu POI po naświetlaniu światłem UV. Jeśli POI reaguje szybko z uwolnionym RES, wynikowe kowalencyjne oznakowanie POI za pomocą OZE pozwala nam zidentyfikować kinetycznie uprzywilejowane cysteiny.
Z-REX wykorzystuje wyżej wymienione zalety technologii REX i stosuje je szeroko do badania specyficznych ścieżek sygnałowych u żywych ryb. Protokół ten został zoptymalizowany dla danio pręgowanego (D. rerio), ponieważ są to genetycznie podatne na kręgowce organizmy, które są przezroczyste podczas rozwoju, a zatem idealne dla technik optochemicznych/genetycznych, takich jak technologie REX. Niemniej jednak podobna strategia prawdopodobnie sprawdzi się również w przypadku innych genetycznie podatnych gatunków ryb, ponieważ szerokie zastosowanie metody wynika z pseudowewnątrzcząsteczkowego mechanizmu dostarczania elektrofilu pochodzenia lipidowego (LDE). Rzeczywiście, procedura jest wysoce biokompatybilna, ponieważ ryby mogą być leczone elektrofilem fotoklatkowym Z-REX [np. Ht-PreHNE (alkinem)] przez co najmniej 48 godzin bez zauważalnego wpływu na rozwój. Podobny protokół funkcjonuje w C. elegans4,5.
Protokół najpierw opisuje użycie iniekcji mRNA do wytworzenia przejściowej ekspresji nienatywnego konstruktu fuzji Halo-POI w embrionalnych modelach danio pręgowanego, 1-1,5 dnia po zapłodnieniu (dpf). Powoduje to ekspresję białka ektopowego w większości komórek ryb (zwanego dalej "wszechobecnym"), a nie w określonych tkankach lub lokalizacjach; Jednak dane pokazują, że w niektórych przypadkach można zaobserwować efekty specyficzne dla komórek. Po wstrzyknięciu zarodki są inkubowane z niskim stężeniem [0,3-5 μM Ht-PreHNE(alkin)] sondy do 30,5 godziny po zapłodnieniu (hpf). Następnie, w czasie określonym przez użytkownika, dostarczanie RES do punktu POI w rybach odbywa się poprzez fotoklatkę przez 2-5 minut. Po fotoklatowaniu RES, w ciągu najbliższych 2-10 godzin można przeprowadzić różne dalsze testy fenotypowe: 1) obrazowanie na żywo linii reporterowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A); 2) ocena oznaczania celów za pomocą analizy western blot (<silna klasa="xfig">Rysunek 3); 3) analiza transkryptomiczna (<silna klasa="xfig">Rysunek 4); lub 4) immunofluorescencja całej góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).
Jako przykład obrazowania na żywo linii reporterowych, Z-REX jest demonstrowany w połączeniu z obrazowaniem na żywo linii ryb, Tg(lyz:TagRFP) i Tg(mpeg1:eGFP), aby zmierzyć, jak modyfikacja RES konkretnego punktu POI czujnika elektrofilowego (mianowicie Keap1) obniża poziomy odpowiednio neutrofili i makrofagów, bez zauważalnego wpływu na inne komórki ryby. Jednak wykazaliśmy wcześniej, że znakowanie POI i wynikający z niego szlak sygnalizacji z badań T-REX można odtworzyć za pomocą Z-REX dla kilku białek: Akt36, Keap17 i Ube2v26. Ogólnie rzecz biorąc, dzięki Z-REX naukowcy mogą badać konsekwencje kowalencyjnej modyfikacji punktów POI przez OZE w kontekście kilku złożonych szlaków redoks. Technika ta ma na celu wskazanie celów i ich funkcjonalnych pozostałości w celu zaprojektowania leku kowalencyjnego i nowych mechanizmów działania leku w bardziej kontekstowym modelu całego zwierzęcia.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1,5-mililitrowa probówka do mikrowirówek</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>10-cm szalka Petriego</td><td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 2 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>30% roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GoldBio</td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>Wszystkie niebieskie wzorce białek barwionych</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-dPEG11-azydek</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Dye</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kapilarne</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmpete, Mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cu(TBTA)</td><td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Osioł anty-szczur-AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Podłoże ECL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże ECL-Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Rotator end-to-end</td><td>FinePCR</td><td>Rotator AG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Ściągacz</td> <td>do mikropipetInstrument Sutter Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze ()</td><td>samodzielnie wykonane</td><td></td><td>przez stępienie ostrych kleszczy (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)</td></tr><tr><td>Kleszcze (ostre)</td><td>Narzędzia do nauki</td> o wysokiej jakości <td>Dumont #5, 11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do ładowania żelu</td><td>Fisher</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Obrazownik żelowy/blot</td><td>Vilber</td><td>Fusion FX imager</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Sigma</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometr do szklanych scen</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana kąpiel ultradźwiękowa</td><td>VWR</td><td>89375-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza streptawidyny o dużej pojemności</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Sonda alkinowa Ht-PreHNE</td><td>własnej produkcji</td><td></td><td>Parvez, S. i wsp. Targetowanie redoks na żądanie T-REX w żywych komórkach. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Płytka obrazowa (10% bufor HBSS, dla żywych zarodków)</td><td></td><td></td><td>Wykonana z szalki Petriego i 2% agarozy w 10% buforze HBSS</td></tr><tr><td>Płytka obrazowa (PBS, dla zarodków utrwalonych formaldehydem)</td><td></td><td></td><td>Wykonana z szalki Petriego i 2% agarozy w PBS</td></tr><tr><td>Płytka</td><td></td><td></td> iniekcyjna <td>Wykonana z formy do mikroiniekcji, szalki Petriego i 2% agarozy w 10% buforze HBSS</td></tr><tr><td>LDS</td><td>Apollo APOBI3331</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>Forma do mikroiniekcji</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do mikroiniekcji</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopowe źródło światła</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty- &beta;-aktyna HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000 (WB)</td></tr><tr><td>Mysz anty-HaloTag</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500 (IF)</td></tr><tr><td>Czytnik wielomodowy</td><td>BioTek Instruments</td><td>Cytacja 5</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy w żelu agarozowym kwasu nukleinowego</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT Systems</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)20</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>dostosowane: (dT)20</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańczowy G</td><td>Sigma</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-keap1-2xHA&nbsp;</td><td>samoklonowanie-Dostępne</td><td></td> <td>w grupie prof. Yimona AYE w EPFL</td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA</td><td>samoklonowanie-Dostępne</td><td></td> <td>w grupie prof. Yimona AYE w EPFL</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>WPI</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt i materiały do elektroforezy białek</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra Pionowa elektroforeza</td><td></td></tr><tr><td>Królik antyaktywny Kaspaza-3</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>559565</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Anty-HA-HRP</td><td>Sigma</td><td>H3663</td><td>1:500 (IF i WB)</td></tr><tr><td>Anty-RFP</td><td>ChromoTek</td><td>5F8</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dekontaminacji RNA RnaseZap</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka kołysana</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS Teknova</td><td></td><td>S9974</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III odwrotna transkryptaza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>t-Butanol</td><td>Sigma</td><td>471712</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>TeV proteaza (S219V)</td> <td>wykonana samodzielnie</td> <td>-</td> <td>Parvez, S. i wsp. T-REX celowanie redoks na żądanie w żywych komórkach. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Tg(lyz:TagRFP)</td><td>Międzynarodowe Centrum Zasobów Zebra (ZIRC)</td><td>uwm11Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1:eGFP)</td><td>Międzynarodowe Centrum Zasobów Zebrafish (ZIRC)</td><td>gl22Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Analytik Jana</td><td>846-x-070-280</td><td></td></tr><tr><td>TMEDA</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Apollo</td><td>APOBI2888</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny z Glycine max (soybean)</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Lampa UV ze światłem 365-nm</td><td>Spectroline</td><td>ENF 240C</td><td></td></tr><tr><td>Miernik UV&nbsp;</td><td>Spectroline</td><td>XS-365</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting Sprzęt i materiały eksploatacyjne</td><td>Biorad</td><td>Mini Trans-Blot lub Criterion Blotter&nbsp;</td><td></td></tr><tr>Sprzęt <td></td><td></td><td>do hodowli i hodowli danio pręgowanego</td><td>w domu</td></tr><tr><td>Koraliki cyrkonowe</td><td>BioSpec</td><td>11079107zx</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - z-rex demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reaktywne metabolity i związane z nimi leki elektrofilowe należą do najtrudniejszych małych cząsteczek do zbadania. Konwencjonalne podejścia do dekonstrukcji sposobu działania (MOA) takich cząsteczek wykorzystują masowe traktowanie próbek eksperymentalnych nadmiarem określonych reaktywnych gatunków. W tym podejściu wysoka reaktywność elektrofilów sprawia, że znakowanie proteomu jest niedyskryminacyjne w sposób zależny od czasu i kontekstu; Białka i procesy wrażliwe na redoks mogą być również pośrednio i często nieodwracalnie dotknięte. Na takim tle niezliczonych potencjalnych celów i pośrednich efektów ubocznych, powiązanie fenotypu z konkretnym zaangażowaniem celu pozostaje złożonym zadaniem. Danio pręgowany ukierunkowany na reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) - platforma dostarczania reaktywno-elektrofilowej na żądanie, dostosowana do stosowania u larw danio pręgowanego - została zaprojektowana do dostarczania elektrofilów do określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) w niezakłóconych żywych zarodkach ryb. Kluczowe cechy tej techniki obejmują niski poziom inwazyjności, a także precyzyjne dostarczanie elektrofilu kontrolowane dawkowaniem, chemotypem i czasowo-przestrzennie. Tak więc, w połączeniu z unikalnym zestawem kontroli, technika ta pozwala uniknąć efektów niedocelowych i toksyczności ogólnoustrojowej, które w przeciwnym razie obserwuje się po niekontrolowanym masowym narażeniu zwierząt na reaktywne elektrofile i plejotropowe leki elektrofilowe. Wykorzystując Z-REX, naukowcy mogą ustanowić punkt zaczepienia w zrozumieniu, w jaki sposób indywidualne reakcje na stres i wyjścia sygnałowe są zmieniane w wyniku specyficznego reaktywnego zaangażowania ligandów w określone POI, w warunkach zbliżonych do fizjologicznych u nienaruszonych żywych zwierząt.

Obrazowanie na żywo transgenicznych ryb reporterowych dla neutrofili/makrofagów, Tg(lyz:TagRFP) oraz Tg(mpeg1:EGFP), poddanych działaniu Z-REX. Indukcja apoptozy neutrofili/makrofagów poprzez HNEylację Keap1. (Patrz również Rysunek 2). Wpływ znakowania elektrofilem białka Keap1 na poziom neutrofili i makrofagów oceniono poprzez wstrzyknięcie heterozygotycznym zarodkom transgenicznym pochodzącym z linii Tg(lyz:TagRFP) lub Tg(mpeg1:EGFP) mRNA kodującego Halo-Keap1, a następnie poddanie ich działaniu Ht-PreHNE(alkyne). Zgodnie z procedurami dla kroku 6.1-analiza następcza Opcja 1-uwolniono HNE(alkyne) i oznakowano Keap1. Poziomy neutrofili i makrofagów oceniono za pomocą obrazowania na żywo odpowiednio linii reporterowych Tg(lyz:TagRFP) i Tg(mpeg1:eGFP). Poziom obu typów komórek spadł o 30%-40% po zastosowaniu Z-REX, w wyniku którego HNE zostało dostarczone do Keap1. Przeciwnie, nie zaobserwowano utraty neutrofili ani makrofagów w grupach kontrolnych technicznych Z-REX [bez światła i Ht-PreHNE(alkyne), samo światło lub samo Ht-PreHNE(alkyne)] (Rysunek 1D oraz Rysunek 2A-D).
Indukcja apoptozy neutrofili/makrofagów wskazała na skuteczne dostarczenie HNE do Keap1 za pomocą Z-REX. Szczegółowe informacje dotyczące analizy szlaków i mechanizmu apoptozy zostały opublikowane5. Aby uwzględnić efekty pozacelowe HNE(alkyne), zastosowano kilka kontroli. (1) W tych samych warunkach eksperymentalnych, zamiast mRNA Halo-TeV-Keap1, do embrionów wstrzyknięto mRNA Halo-P2A-Keap1. Łącznik P2A pozwolił na niezależną ekspresję białek Halo i Keap1. W tym scenariuszu HNE(alkyne) uwalniany z Halo nie mógł znakować Keap1, ponieważ nie znajdował się już w jego sąsiedztwie (Ryc. 1D); w związku z tym szlak sygnalizacyjny apoptozy nie został aktywowany. W tej grupie nie zaobserwowano zmian w poziomach makrofagów ani neutrofili (Ryc. 2A,B). (2) Te same warunki eksperymentalne przeprowadzono z użyciem mRNA kodującego Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E), mutantu Keap1, który nie reaguje na HNE(alkyne) (Ryc. 1D). Nie zaobserwowano zmian w poziomach makrofagów ani neutrofili (Ryc. 2G,H).
Sprzęganie typu click biotyny z azydkiem i test pull-down biotyny. Ocena znakowania celu. (Patrz również Rycina 3). Ocenę znakowania celu przeprowadzono z użyciem embrionów WT, w które wstrzyknięto mRNA kodujące albo Halo-TeV-Keap1-2xHA (konstrukt fuzyjny Halo-POI), albo Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (konstrukt rozdzielony P2A, w którym Halo i Keap1 nie są połączone; Rycina 1D). Znakowane białko Keap1 zostało wyizolowane metodą pull-down wyłącznie w grupie wykazującej ekspresję białka fuzyjnego i poddanej działaniu Z-REX (druga ścieżka w górnym blotcie przeciwciałem anty-HA), natomiast nie w pozostałych grupach kontrolnych (brak wstrzyknięcia mRNA, konstrukt fuzyjny bez Z-REX lub konstrukt rozdzielony P2A). Wyniki wskazują, że HNE(alkyne) zostało skutecznie dostarczone do Keap1, a zmodyfikowane Keap1 zostało następnie sprzężone z biotyną w reakcji click, po czym znakowane biotyną Keap1 zostało wyizolowane przy użyciu żywicy z streptawidyną.
Analiza transkrypcyjna. RNA-seq i qRT-PCR. (Zobacz również Rysunek 4). Zmiany transkrypcyjne po zastosowaniu Z-REX oceniono za pomocą RNA-seq i qRT-PCR. W analizie RNA-seq stwierdzono obniżenie poziomu ekspresji kilku genów związanych z odpornością po podaniu Z-REX. Przeciwnie, wiele genów związanych z odpowiedzią antyoksydacyjną (AR) uległo nadekspresji po Z-REX, co było wynikiem indukcji szlaku Keap1-Nrf2-AR w następstwie HNEylacji białka Keap110 (Rysunek 4A). W analizie qRT-PCR uzyskano podobne wyniki podczas badania trzech genów związanych z odpornością (lyz, mpeg1.1 i coro1a) (Rysunek 4B). Nadekspresja i obniżenie ekspresji odpowiednich genów wykazały skuteczną indukcję szlaków pośredniczonych przez HNEylację Keap1.
Analiza kolokalizacji i test barwienia (ko-)immunofluorescencyjnego całego preparatu. (Zobacz również Rysunek 5). Ekspresję egzogennych Halo-TeV-Keap1-2xHA oraz Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (IF) całego preparatu (Rysunek 5A,B). Konstrukt P2A-split posiadał dwukrotnie więcej znaczników HA niż konstrukt TeV-fusion, co przełożyło się na dwukrotnie silniejszy sygnał anty-HA w grupie wstrzykniętej mRNA konstruktu P2A-split w porównaniu z drugą grupą, co wskazuje na podobny poziom ekspresji obu konstruktów (Rysunek 5C). Poziomy ekspresji Halo-TeV-Keap1 (wt) oraz Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E) okazały się również podobne podczas detekcji przeciwciałami anty-Halo (Rysunek 5D,E). Kolokalizację neutrofili i aktywnej kaspazy 3 w osobnikach Tg(lyz:TagRFP) traktowanych Z-REX zaobserwowano poprzez wspólne barwienie immunologiczne z użyciem przeciwciał anty-RFP i anty-aktywna-Kaspaza 3 (Rysunek 5F). Aktywna kaspaza 3 jest wskaźnikiem zdarzeń apoptotycznych.
<img alt="Schemat Zebrafish-REX; mikroiniekcja mRNA, znakowanie wyzwalane światłem, analiza transkryptomiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat działania Z-REX. (A,B) Do zarodka danio pręgowanego w stadium 1-4 komórek wstrzykuje się (morfolino oraz) mRNA kodujące Halo-POI (np. Halo-Keap1). Następnie wstrzyknięte zarodki traktuje się sondą składającą się z ligandu HaloTag i fotoklatki elektrofila z dołączoną grupą funkcyjną alkinową, taką jak Ht-PreHNE(alkyne) w części B. Po usunięciu nadmiaru sondy zarodek poddaje się działaniu światła w celu uwolnienia interesującego elektrofila [np. HNE lub jego analogu, HNE(alkyne)]. Analizy w kolejnych etapach przeprowadza się w wybranym/zdefiniowanym przez użytkownika punkcie czasowym. (C) Konstrukcja i mechanizm działania sondy Ht-PreLDE, która ma zastosowanie do różnych elektrofili pochodnych lipidów (LDE). (D) Grupy kontrolne ujemne/techniczne dla Z-REX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie na żywo neutrofili i makrofagów danio pręgowanego śledzonych za pomocą Z-REX, analiza wykresu ANOVA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obrazowanie na żywo transgenicznych ryb reporterowych dla neutrofili/makrofagów poddanych Z-REX. HNEylacja Keap1 zapośredniczona przez Z-REX indukuje apoptozę neutrofili/makrofagów. (A) Reprezentatywne obrazy ryb Tg(lyz:TagRFP) wykazujących ekspresję Halo-TeV-Keap1 (konstrukt fuzyjny) lub Halo-P2A-Keap1 (konstrukt rozdzielony), poddanych warunkom kontroli negatywnej [brak terapii, samo światło, sam Ht-PreHNE(alkyne) lub Z-REX]. Wiek embrionów: 36 hpf. (B) Ilościowe oznaczenie poziomu neutrofili w A. (C) Reprezentatywne obrazy ryb Tg(mpeg1:eGFP) wykazujących ekspresję Halo-TeV-Keap1 z zastosowaniem lub bez zastosowania Z-REX. Wiek embrionów: 34 hpf. (D) Ilościowe oznaczenie poziomu makrofagów w C. (E,F) Pomiary czasowe (E) poziomu neutrofili i (F) poziomu makrofagów po zastosowaniu Z-REX. (G) Eksperyment analogiczny do A u ryb wykazujących ekspresję Halo-TeV-Keap1 (WT) lub Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), mutantu pozbawionego zdolności wykrywania HNE. (H) Ilościowe oznaczenie poziomu neutrofili w G. Paski skali: 500 µm. Wszystkie wykresy przedstawiono jako średnia ± SEM. Wartości p obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (kolor niebieski) i dwustronnego testu t Studenta (kolor czarny). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyciąganie streptawidyną, schemat oddziaływań białkowych; test Keap1-Halo, analiza blot, cięcie TEV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Test wyciągania biotyną. Embriony WT wykazujące ekspresję Halo-TeV-Keap1-2XHA lub Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA poddano działaniu Z-REX lub odpowiednich warunków kontrolnych negatywnych (w tym przypadku brak traktowania sondą). Po zbiorze embriony poddano lizie i potraktowano proteazą TeV przed testem wyciągania biotyną. Wyniki przeanalizowano za pomocą western blottingu. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Huang et al. Z-REX: kierowanie reaktywnych elektrofilów do konkretnych białek wyrażanych albo specyficznie tkankowo, albo powszechnie, oraz rejestrowanie wynikających z tego odpowiedzi redoks indukowanych przez elektrofile u larw ryb. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres wulkaniczny i wykresy słupkowe przedstawiające zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi immunologicznej po zastosowaniu Z-REX." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza transkrypcyjna. (A) Wyniki RNA-seq zarodków traktowanych Z-REX w porównaniu z nietraktowanymi. Wyróżniono statystycznie istotne geny o różnej ekspresji (SDE). Geny SDE związane z odpornością zaznaczono kolorem czerwonym. Geny związane z odpowiedzią przeciwutleniającą (AR) zaznaczono kolorem zielonym. Pozostałe geny SDE zaznaczono kolorem niebieskim. Wszystkie wartości p obliczono za pomocą programu CuffDiff. (B-D) Trzy geny SDE związane z odpornością z punktu A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 oraz (D) coro1a poddano dalszej analizie metodą qRT-PCR; jedynie w zarodkach traktowanych Z-REX zaobserwowano supresję tych transkryptów. Wszystkie wykresy przedstawiono jako średnia ± SEM. Wartości p obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (kolor niebieski) oraz dwustronnego testu t Studenta (kolor czarny). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie immunofluorescencyjne całego preparatu; danio pręgowany; HaloTag; AlexaFluor; analiza ekspresji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza barwienia immunofluorescencyjnego całego preparatu. (A,B) Reprezentatywne obrazy embrionów wykazujących ekspresję (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA lub (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA, poddanych barwieniu przeciwciałem anty-HA i przeciwciałem wtórnym sprzężonym z AlexaFluor568. Ryby wstrzyknięte z mRNA porównano z rybami niewstrzykniętymi w tym samym wieku. (C) Ilościowe oznaczenie sygnału anty-HA w (A,B). (D) Reprezentatywne obrazy embrionów wykazujących ekspresję Halo-TeV-Keap1 (WT) lub Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), poddanych barwieniu przeciwciałem anty-Halo i przeciwciałem wtórnym sprzężonym z AlexaFluor647. Ryby wstrzyknięte z mRNA porównano z rybami niewstrzykniętymi w tym samym wieku. (E) Ilościowe oznaczenie sygnału anty-Halo w D. Wartości p obliczono za pomocą dwustronnego testu t Studenta. (F) Embriony Tg(lyz:TagRFP) poddane procedurze Z-REX poddano wspólnemu barwieniu immunofluorescencyjnemu przeciwciałami anty-RFP i anty-aktywna Kaspaza 3 oraz odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforami. Biała ramka oznacza obszar powiększony. Białe strzałki wskazują kolokalizację neutrofili i aktywnej Kaspazy 3. Paski skali: 500 µm. Wszystkie wykresy przedstawiono jako średnia ± SEM. Rycina została zmodyfikowana na podstawie prac Poganik et al.7 oraz Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Lista buforów użytych w niniejszym badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) to oparta na biologii chemicznej metoda badania reaktywnej sygnalizacji małocząsteczkowej. Technikę tę można zastosować do żywych ryb na różnych etapach rozwoju. Tutaj łączymy standardowe testy u danio pręgowanego z Z-REX do analizy szlaku sygnałowego.

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Wykorzystując Z-REX, naukowcy mogą badać, w jaki sposób poszczególne odpowiedzi sygnalizacyjne są zmieniane w odpowiedzi na określony reaktywny ligand angażujący się w określone białko będące przedmiotem zainteresowania w warunkach zbliżonych do fizjologicznych u larw danio pręgowanego. Konwencjonalne metody, takie jak małe cząsteczki reagujące na dawki masowe, powodujące cele i toksyczność, nie dają kontroli nad swoistością celu ligandowego. Z-REX może łączyć określone zaangażowanie docelowe liganda z określonym fenotypem z wysoką precyzją czasoprzestrzenną.Niedawno pokazaliśmy, w jaki sposób reaktywny metabolit HNE, powiązany cel i szlak odkryty przez Z-REX, umożliwia opracowanie precyzyjnych inhibitorów kinaz specyficznych dla izoformy przeciwko potrójnie ujemnym rakom piersi. Zacznij od wyrównania zarodków w rowkach płytki iniekcyjnej wypełnionej świeżym 10% zrównoważonym roztworem soli Hanka lub HBSS. Zanurz końcówkę igły w podłożu i w razie potrzeby zastosuj impulsy iniekcyjne w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z końcówki W celu wstrzyknięcia zarodka należy jednym ruchem przeniknąć przez kosmówkę i woreczek żółtkowy i zastosować impuls iniekcyjny.Po wstrzyknięciu pozostałych zarodków przepłucz je na nową szalkę Petriego zawierającą świeżą pożywkę HBSS za pomocą butelki ze spryskaczem. Zebrać zarodki, którym nie wstrzyknięto, na inną płytkę. Aby przeprowadzić analizę leczenia Z-REX, należy rozpocząć od rozprowadzenia wstrzykniętych zarodków w 10-centymetrowych szalkach.W ciemnym pomieszczeniu z czerwonym światłem zastąp pożywkę 30 mililitrami 10% HBSS z lub bez jednego mikromola sondy REX. Wysiaduj zarodki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza w ciemności. Po 30 godzinach od zapłodnienia wymień pożywkę w ciemności.Po powtórzeniu inkubacji i dwukrotnej wymianie pożywki, wystaw zarodki na działanie światła z podgrzanej lampy UV wirującej co 30 sekund. Aby wykonać test fenotypowy, należy usunąć niezapłodnione lub martwe zarodki z płytki zawierającej znieczulone zarodki. Za pomocą ostrych kleszczy usuń kosmówkę zarodków.Zamontuj zarodki na 2% agarozowej płytce przygotowanej z 10% pożywką HBSS i obserwuj pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj ImageJ, aby policzyć liczbę neutrofili i makrofagów każdej ryby. Wybierz zaznaczenie odręczne i zakreśl całą rybę, a następnie wybierz opcję Znajdź maksima, aby policzyć komórki fluorescencyjne W niniejszym badaniu zarodki traktowane Z-REX wykazały utratę neutrofili i makrofagów.Efekt ten nie był obecny w grupach nieleczonych. Szlak sygnałowy apoptozy nie został uruchomiony w grupie Halo-P2A-Keap1, co spowodowało niezmienione poziomy makrofagów i neutrofili. Podobne wyniki zaobserwowano również u mutanta Halo-TEV-Keap1, który nie reagował na HNE.Transkrypcja i ilościowe analizy PCR w czasie rzeczywistym wykazały regulację w dół genów związanych z odpornością i regulację w górę genów przeciwutleniających po Z-REX. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że konstrukt rozszczepiony P2A miał dwa razy więcej znaczników HA niż konstrukt fuzyjny TeV, co wskazuje na podobne poziomy ekspresji. Poziomy ekspresji typu dzikiego i zmutowanego typu Halo-TeV-Keap1 były również podobne.W linii reporterowej transgenicznych neutrofili traktowanych Z-REX zaobserwowano również kolokalizację neutrofili i aktywnej kaspazy 3. Najważniejszą rzeczą jest prawidłowe skonfigurowanie dokumentów. Ograniczenie naprawdę poprawi Twoje wyniki.Pomysł na Z-REX został zaadaptowany do platformy badań przesiewowych leków znanej jako Localis-REX. Żadna inna technika do tej pory nie była w stanie osiągnąć tak lokalnego specyficznego i reaktywnego mapowania ligandów lub celów. Pomogło nam to w opracowaniu kandydatów na leki elektrofilowe w leczeniu raka piersi.Biorąc pod uwagę rosnące znaczenie lokalnej sygnalizacji w wielu dziedzinach, nowotworach, immunologii, starzeniu się i tak dalej, Z-Rex, jedyne narzędzie zdolne do mapowania zlokalizowanych reaktywnych zdarzeń kierowanych przez ligandy, obiecuje pomóc w wielu dziedzinach.

monitoring-on-target-signaling-responses-larval-zebrafish-z-rex

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem doświadczalnym do badania procesów rozwojowych kręgowców i modelowania chorób ludzkich. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób przeprowadzić ręczne, wysokoprzepustowe badanie chemiczne na zarodkach danio pręgowanego z odczytem hybrydyzacji in situ (WISH) w całości.

Ręczne badanie przesiewowe małych cząsteczek zbliżające się do wysokiej przepustowości przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Prezentujemy metodę analizy elektroretinograficznej (ERG) larw danio pręgowanego z wykorzystaniem technik mikromanipulacji i elektroretinografii. Jest to prosta i nieskomplikowana metoda oznaczania funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego in vivo.

Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki epilepsji u danio pręgowanego, wynikającej z przejściowego zahamowania genu DEPDC5.

Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Tutaj opisujemy syntezę liposomów naładowanych lekiem i ich mikroiniekcję larwom danio pręgowanego w celu ukierunkowania dostarczania leków do komórek z linii makrofagów.

Kierowanie leków na larwy makrofagów danio pręgowanego poprzez wstrzykiwanie liposomów zawierających leki

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Poznaj metodę Z-REX do analizy sygnalizacji małocząsteczkowej u larw Danio rerio. Technika ta pozwala precyzyjnie badać wpływ ligandów na odpowiedzi sygnalizacyjne w kontekście badań nad rakiem piersi.

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Przeglądaj więcej filmów