Name: Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Poznaj model błony moczowo-omoczniowej kurcząt do badania przeszczepu tkanki jajnika. Technika umożliwia obserwację wczesnej rewaskularyzacji i przeżywalności pęcherzyków w kontrolowanych warunkach in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Mirze Hryniuk, BA, za przejrzenie angielskiego języka artykułu.

Użycie ludzkiej tkanki zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Katolickiego Uniwersytetu w Louvain. Pacjentki wyraziły pisemną świadomą zgodę na wykorzystanie ich tkanki jajnikowej do celów badawczych.
1. Zamawianie dnia 0 jaj, które z dużym prawdopodobieństwem zostaną zarodkowane
<ol>
	<li>Znajdź certyfikowanego, laboratoryjnego dostawcę białych jaj Leghorn, wybranego przez Lohmana, który zgłasza wysokie wskaźniki zarodków jajowych, co zależy przede wszystkim od wieku piskląt.</li>
</ol>
2. Przygotowanie jaj do inkubacji
<ol>
	<li>Przed przybyciem jaj należy zmontować i zrównoważyć inkubator do jaj do temperatury 37 °C przy wilgotności względnej powietrza 40%-60%. Monitoruj temperaturę i wilgotność powietrza, wkładając termometr i higrometr do inkubatora. Upewnij się, że pokrywa inkubatora jest wyposażona w szklane okienko, aby umożliwić sprawdzenie wewnętrznych parametrów inkubatora bez konieczności jego otwierania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Po otrzymaniu jaj dnia 0 od wyselekcjonowanych przez Lohmana białych piskląt Leghorn od certyfikowanego dostawcy jaj klasy laboratoryjnej, oczyść powierzchnię skorupek nawilżonym papierem i natychmiast je wysusz. 
	UWAGA: Ponieważ membrana skorupki jajka jest porowata, do czyszczenia powierzchni jaj i kontrolowania wilgotności w inkubatorze można używać wody autoklawowanej w celu zminimalizowania ryzyka zanieczyszczenia.</li>
	<li>Oznacz jajka za pomocą markera (np. daty i numeru jajka).</li>
	<li>Inkubuj jaja spiczastym końcem skierowanym w dół i obracaj je, aby umożliwić rozwój CAM. Ręcznie obracaj jaja o 180° dwa do trzech razy dziennie lub użyj automatycznego rotatora. 
	UWAGA: Aby upewnić się, że jaja są rzeczywiście obracane, skorupka jajka może być oznaczona literami "X" i "O" po dwóch przeciwległych bocznych stronach za pomocą ołówka lub markera. Szklane okienko w pokrywie inkubatora pozwala na sprawdzenie rotacji jaj bez otwierania urządzenia.</li>
</ol>
3. Otwarcie skorupki jajka w 3 dniu ED
UWAGA: Prostokątne okno jest tworzone w skorupce jajka w 3 dniu ED.
<ol>
	<li>Przygotuj okap z przepływem laminarnym do pracy w sterylnych warunkach. Umieść następujące narzędzia pod maską i zdezynfekuj je w 70% etanolu (jeśli nie zostały jeszcze wysterylizowane): 
	-Stojak na jajka 
	-Świecznik do jajek lub ogniskowe źródło zimnego światła 
	-Znacznik 
	-Sterylny prosty trzpień 
	-Sterylna igła 19 G 
	-5 ml sterylnej strzykawki 
	-Brzeszczot do przewijania 
	-Sterylne kleszcze 
	-Taśma klejąca</li>
	<li>Przenieś jedno jajo z inkubatora do stojaka na jajka umieszczonego pod maską i wyłącz rotator jaj.</li>
	<li>W ciemności zidentyfikuj kieszeń powietrzną jajka, umieszczając świecę do jajka (lub ogniskowe źródło zimnego światła) na skorupce jajka. Kieszeń powietrzna jest zlokalizowana na końcu jaja. Użyj markera, aby wskazać środek kieszeni powietrznej na skorupce jajka.</li>
	<li>Włącz światła. Zrób mały otwór w skorupce jajka, w którym jest zaznaczony, delikatnie obracając sterylną prostą szpilkę. Zwykle wystarcza mały otwór o średnicy około 1 mm. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie wepchnąć szpilki do końca przez jajko. Jeśli tak się stanie, wyrzuć jajko.</li>
	<li>Podłączyć sterylną igłę 19 G do sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml.</li>
	<li>W ciemności zlokalizuj woreczek żółtkowy za pomocą świecznika do jaj (lub ogniskowego źródła zimnego światła) i przebij jajko przez otwór wykonany w kroku 3.4 sterylną igłą 19 G ustawioną pod kątem 45° w kierunku dna jajka; należy zachować szczególną ostrożność, aby nie naruszyć woreczka żółtkowego. Odessać od 1,5 do 2 ml białka, aby odłączyć CAM od skorupy, a następnie zamknąć otwór kawałkiem taśmy klejącej. 
	UWAGA: Jeśli woreczek żółtkowy zostanie przerwany podczas aspiracji, zasysany płyn w strzykawce będzie miał kolor żółty, a nie przezroczysty (białko). W takim przypadku należy wymienić igłę i strzykawkę. Jeśli stosunkowo duża ilość żółtka jaja zostanie zassana, może to zagrozić żywotności zarodka.</li>
	<li>Włącz światła. Ułóż jajko poziomo i narysuj markerem prostokątne okienko o wymiarach 1 cm x 1,5 cm. Nie rób okna większego niż zwykła szerokość standardowej taśmy klejącej.</li>
	<li>Trzymaj jajko w jednej ręce i delikatnie wbij wcześniej narysowane okienko w skorupkę jajka za pomocą brzeszczotu do przewijania. Upewnij się, że skorupa nie pęka i nie przecina się aż do wciśniętej krzywki. regularnie, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia z muszli.</li>
	<li>Wsuń sterylne kleszcze pod prostokątny kawałek przetartej skorupy i zręcznie chwyć, aby usunąć je czysto, nie uszkadzając CAM. Dodatkowo wyrzuć białą błonę zewnętrznej powłoki, aby móc zobaczyć zarodek i jego CAM. 
	UWAGA: Jeśli na CAM spadnie trochę kurzu lub zanieczyszczeń ze skorupek jaj, można je usunąć za pomocą sterylnych kleszczy, bardzo uważając, aby nie rozerwać CAM.</li>
	<li>Zidentyfikuj zdolne do życia zarodki jajowe. Można je rozpoznać po przezroczystym białku i pierścieniu naczyniowym wokół zarodka, gdzie czasami można wykryć bijące serce nawet na tym etapie (3. dzień zaburzeń erekcji). Wyrzuć niezapłodnione lub martwe zarodki.</li>
	<li>Umieść taśmę klejącą na nowo utworzonym oknie, aby uniknąć odwodnienia. Pamiętaj, aby złożyć jeden koniec na sobie, aby ułatwić usunięcie.</li>
	<li>Włóż jajo z powrotem do inkubatora z otwartym oknem skierowanym do góry i taśmą nie dotykającą CAM. Użyj złożonego kawałka papieru lub części stojaka na jajka, aby zapobiec toczeniu się jajka. Upewnij się, że obrotowa taca jest wyłączona.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.12, aby otworzyć pozostałe jaja.</li>
</ol>
4. Przeszczepianie zamrożonej i rozmrożonej ludzkiej tkanki jajnikowej do CAM
UWAGA: Najlepiej byłoby, gdyby przeszczep do CAM rozpoczął się między 7 a 10 dniem zaburzeń erekcji.
<ol>
	<li>Rozmrozić kriokonserwowane paski korowe jajników pod okapem z przepływem laminarnym zgodnie z protokołem opisanym w innym miejscu30.</li>
	<li>Pokrój paski korowe na trzy fragmenty o wymiarach 4 mm x 2 mm x 1 mm. Użyj jednego kawałka jako nieszczepionej kontroli, a pozostałych dwóch do ksenoprzeszczepu przez 1 dzień lub 6 dni. 
	UWAGA: Jeśli dostępna jest wystarczająca ilość tkanki, pracuj dwukrotnie.</li>
	<li>Przenieś jedno jajo z inkubatora do stojaka na jajka umieszczonego pod maską, z oknem skierowanym do góry.</li>
	<li>Odklej taśmę od okna i upewnij się, że zarodek jest zdolny do życia. Na tym etapie zdolne do życia zarodki charakteryzują się rozległym unaczynieniem, czystym białkiem, widocznym biciem serca i pewnymi ruchami zarodka.</li>
	<li>Przygotuj miejsce szczepienia, delikatnie uszkadzając niewielki obszar CAM, kładąc na powierzchni nabłonka pasek o długości 1cm2 sterylnego bibuły do soczewek ekstrahowanych eterem i natychmiast go usuwając. 
	UWAGA: CAM jest barierą nieprzenikalną, chyba że błona została uszkodzona przez usunięcie górnej części okołoskórnej podwójnej warstwy nabłonkowej, pozostawiając nienaruszoną warstwę podstawną. Technika ta usprawnia również proces rewaskularyzacji poprzez aktywację gojenia się ran. Jeśli sterylny papier do soczewek ekstrahowany eterem pozostanie na CAM zbyt długo, membrana może przylgnąć do papieru soczewki i rozerwać się. Jeśli tak się stanie, wyrzuć jajko. </li>
	<li>Chwyć jeden zamrożony, rozmrożony pasek kory jajnika (4 mm x 2 mm x 1 mm) za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych i umieść go na uszkodzonej CAM stroną rdzeniową przy CAM. Przeszczep jeden kawałek tkanki na komórkę jajową.</li>
	<li>Zakryj okno taśmą klejącą i ostrożnie włóż jajo z powrotem do inkubatora. Upewnij się, że otwór skorupki jajka jest ustawiony pionowo, a jajko jest bezpieczne.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.7 dla przeszczepu wszystkich pozostałych tkanek. 
	UWAGA: Implanty powinny być sprawdzane w każdym dniu szczepienia w celu oceny żywotności zarodka i monitorowania zmian w układzie naczyniowym.</li>
</ol>
5. Pobieranie szczepów
UWAGA: Ksenografty powinny być pobrane najpóźniej do 17 dnia ED, ponieważ układ odpornościowy zarodka staje się dojrzały i kompetentny od 18 dnia.
<ol>
	<li>Umieść jajko na stojaku i powiększ okienko w skorupce jajka, aby umożliwić lepszą wizualizację przeszczepu i łatwiejszą manipulację.</li>
	<li>Oceń przeszczep makroskopowo i zwróć szczególną uwagę na reakcję naczyniową CAM w kierunku przeszczepu. Rób cyfrowe zdjęcia lub nagrywaj filmy do płyty.</li>
	<li>Chwyć tkankę lub otaczającą CAM kleszczami i ostrożnie wyciąć przeszczep z CAM nożyczkami lub skalpelem. 
	UWAGA: Przeszczepy pokrywają się drugą warstwą CAM około 3 dnia szczepienia i ostatecznie zostają otorbione. Mogły również przenieść się do wnętrza jaja do 6 dnia, co w niektórych przypadkach utrudnia ich odzyskanie.</li>
	<li>Przeanalizować wycięte tkanki dowolną metodą odpowiednią dla danego doświadczenia. W niniejszym badaniu fragmenty tkanek utrwalono w paraformaldehydzie, zatopiono w parafinie i wybarwiono hematoksyliną i eozyną, postępując zgodnie z krokami opisanymi poniżej:
	<ol>
		<li>Utrwal fragmenty w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny i zanurz je w parafinie za pomocą automatycznego urządzenia do zatapiania, wykonując czynności wymienione w Tabeli 1.</li>
		<li>Pozostaw bloki zatopione w parafinie na noc w temperaturze 4°C, a następnie pokrój je na odcinki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu.</li>
		<li>Rozprowadzić skrawki tkanek na szkiełku podstawowym umieszczonym na płycie grzejnej (30 °C) i pozostawić do wyschnięcia na 2 godziny, a następnie na 24 godziny w piecu w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Następnie wybarwić szkiełka hematoksyliną i eozyną zgodnie z protokołem opisanym w innym miejscu31. Następnie zdigitalizuj próbki za pomocą skanera do slajdów i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najtrudniejszą częścią opisanego tutaj protokołu jest wykonanie małego otworu wymaganego do zassania białka w celu odłączenia CAM od skorupki jajka przed utworzeniem okna. Wywieranie zbyt dużego nacisku może spowodować nadmierną penetrację, a nawet pęknięcie i zniszczenie jaja, powodując nieodwracalne uszkodzenie CAM i jego układu krwionośnego. Aby ograniczyć błędy do minimum podczas początkowych prób oddzielenia CAM, zdecydowanie zaleca się ćwiczenie robienia małych otworów w skorupce niezapłodnionych, kupionych w sklep...

Zapotrzebowanie na zachowanie płodności ze względu na onkologiczne i łagodne wskazania, jak również ze względów społecznych, dramatycznie wzrosło w ciągu ostatnich dziesięcioleci. Jednak różne metody leczenia chorób złośliwych i niezłośliwych są wysoce toksyczne dla gonad i mogą powodować jatrogenną przedwczesną niewydolność jajników, ostatecznie prowadząc do niepłodności1. Uznane techniki zachowania płodności obejmują krioprezerwację zarodków, witryfikację niedojrzałych lub dojrzałych oocytów oraz kriokonserwację tkanek jajników2,3,4. Zamrożenie tkanki jajnikowej jest jedyną dostępną opcją zachowania płodności u dziewcząt przed okresem dojrzewania lub kobiet, które wymagają natychmiastowej terapii przeciwnowotworowej. Przywrócenie funkcji hormonalnej po przeszczepieniu tkanki jajnika występuje u ponad 95% badanych, a wskaźnik żywych urodzeń waha się od 18% do 42%5,6,7,8,9.
Chociaż przeszczep zamrożonej i rozmrożonej tkanki jajnika okazał się sukcesem, wciąż jest miejsce na poprawę. Rzeczywiście, ponieważ fragmenty kory jajnikowej są przeszczepiane bez zespolenia naczyniowego, doświadczają one okresu niedotlenienia, podczas którego następuje rewaskularyzacja przeszczepu10,11,12. W zdecydowanej większości badań dotyczących przeszczepu ludzkiej tkanki jajnikowej wykorzystano model ksenoprzeszczepu, w którym tkanka jajnika jest przeszczepiana myszom z niedoborem odporności. Całkowita rewaskularyzacja ksenoprzeszczepów trwa około 10 dni, przy czym zarówno naczynia gospodarza, jak i przeszczepu przyczyniają się do tworzenia funkcjonalnych naczyń krwionośnych12,13,14. Około 50%-90% rezerwy pęcherzykowej jest tracone podczas tego okna hipoksyjnego przed zakończeniem rewaskularyzacji przeszczepu10,15,16. Zdecydowanie zasugerowano, że ta masowa utrata pęcherzyków następuje zarówno poprzez bezpośrednią śmierć pęcherzyka, o czym świadczy spadek bezwzględnej liczby pęcherzyków pozostałych po przeszczepie, jak i aktywacja pierwotnego wzrostu pęcherzyka, na co wskazują zmiany proporcji mieszków włosowych w kierunku zwiększonego tempa wzrostu mieszków włosowych17,18.
Interesujące, poprzednie prace badawcze z wykorzystaniem różnych tkanek jajników zwierzęcych przeszczepionych do błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) piskląt, której budowa naśladuje typowe miejsce szczepienia otrzewnej, wykazały zahamowanie spontanicznej aktywacji pęcherzyków, przy czym pierwotna rezerwa pęcherzyka pozostaje nienaruszona przez okres do 10 dni19,20,21,22. Nasz zespół wykazał wcześniej, że przeszczepienie zamrożonej i rozmrożonej ludzkiej tkanki jajnikowej do CAM stanowi wiarygodne podejście do badania przeszczepu ludzkiej tkanki jajnika w jego pierwszych stadiach niedokrwiennych23 i ostatnio wykazał, że ta metoda szczepienia była w stanie przeciwdziałać aktywacji pęcherzyków24.
Model CAM jest szczególnie atrakcyjny nie tylko dlatego, że jaja są znacznie tańsze niż myszy, ale także ze względu na wysoce unaczynioną naturę CAM, co pozwala na zbadanie związku między aktywacją pęcherzyków a rewaskularyzacją przeszczepu jajnika. System ptasi jest rzeczywiście jednym z najpowszechniejszych i najbardziej wszechstronnych sposobów badania angiogenezy25. Rozwój zarodka pisklęcia (ED) trwa 21 dni do wyklucia, a CAM powstaje w ciągu pierwszych 4-5 dni w wyniku fuzji allantois i kosmówki26. Warto zauważyć, że zarodek pisklęcia jest naturalnie żywicielem z niedoborem odporności do 17 dnia zaburzeń erekcji, więc eksperymenty ksenoprzeszczepu mogą być przeprowadzane bez ryzyka odrzucenia przeszczepu27,28. Co więcej, podejście oparte na modelu CAM nie budzi żadnych wątpliwości etycznych ani prawnych w świetle prawa europejskiego29, co czyni je atrakcyjną alternatywą dla innych modeli zwierzęcych. Jeśli chodzi o warunki hodowlane, zarodki piskląt wymagają jedynie inkubatora ustawionego na 37 °C przy wilgotności względnej powietrza 40%-60%. Te ograniczone wymagania dotyczące eksperymentów znacznie obniżają koszty badań w porównaniu z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności.
Protokół przedstawiony tutaj ma na celu opisanie rozwoju modelu ksenoprzeszczepu CAM dla ludzkiej tkanki jajnika i dostarczenie szczegółowych informacji na temat skuteczności techniki, ram czasowych rewaskularyzacji przeszczepu i żywotności tkanek w ciągu 6-dniowego okresu szczepienia. Protokół ten może być bardzo interesujący dla badania mechanizmów stojących za wczesną utratą mieszków włosowych po przeszczepieniu i badania wpływu kilku czynników (czynników wzrostu, hormonów itp.) na to zjawisko.

<table><tbody><tr><td>Igła podskórna Agani, 19 G</td><td>Terumo Europe</td><td>AN*1950R1</td><td>19 G igła do aspiracji białka</td></tr><tr><td>Strzykawka Terumo, 5 ml koncentryczna Luer lock</td><td>Terumo Europe</td><td>SS*05LE1</td><td>Sterylna strzykawka 5 ml</td></tr><tr><td>Caseviewer v2.2</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Merck Chemicals</td><td>603-022-00-4</td><td>Sterylny eter do traumatyzacji CAM</td></tr><tr><td>Eozyna Y roztwór wodny 0,5%</td> <td>Merck</td><td>1098441000</td><td>Roztwór barwiący</td></tr><tr><td>Formaldehyd 4% roztwór wodny buforowany (formalina 10%)</td><td>VWR</td><td>97139010</td><td>Formaldehyd stosowany do utrwalania tkanek</td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>Liebherr</td><td>7081260</td><td>Lodówka w temperaturze 4 &deg; C służy do zatapiania parafiny</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Schott</td><td>SLK2</td><td>Płyta grzewcza służąca do suszenia szkiełek</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Forma Scientific 3111</td><td>10365156</td><td>Piec do inkubacji szkiełek</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica CLS 150 XE źródło zimnego światła</td><td>Leica</td><td>CLS 150 XE</td><td>Ogniskowe źródło zimnego światła do świeczenia jaj</td></tr><tr><td>Chusteczka do czyszczenia soczewek, klasa 541</td><td>VWR</td><td>111-5003</td><td>Tkanka do namoczenia w sterylnym eterze w celu uszkodzenia CAM</td></tr><tr><td>Hematoksylina Mayera</td><td>MERCK</td><td>1092491000</td><td>Roztwór barwiący</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td>Metanol</td></tr><tr><td></td><td>Mikrotom ThermoScientific-MICROM</td><td>HM325-2</td><td>Mikrotom</td></tr><tr><td>Pannoramic P250 Flash III</td><td>3DHISTECH/</td><td></td><td>Skaner slajdów przy 20-krotnym powiększeniu</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1,04,00,51,000</td><td>Roztwór do zatapiania parafiny</td></tr><tr><td>Paraplast Plus R</td><td>Sigma</td><td>P3683-1KG</td><td>Parafinowa</td></tr><tr><td>szalka Petriego, 60x15 mm, sterylna</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>Sterylna szalka Petriego</td></tr><tr><td>Uchwyt na szpilkę</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Uchwyt na sworzeń</td></tr><tr><td>Polyhatch</td><td>Brinsea</td><td>CP01F</td><td>Inkubator do jaj z automatycznym rotatorem</td></tr><tr><td>Brzeszczot do przewijania, 132 mm</td><td>Sencys</td><td>/</td><td>Brzeszczot do tworzenia okna w skorupce jajka</td></tr><tr><td>Kołki wkładane ze stali nierdzewnej</td><td>Fine Science Tools</td><td>26007-02</td><td>Prosty trzpień do zrobienia otworu w skorupce jajka</td></tr><tr><td>Steril-Helios&nbsp;</td><td>Angelantoni Industrie</td><td>ST-00275400000</td><td>Okap z przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Superfrost Plus pręt bords i ostry; s 90&deg;</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>Prowadnice szklane&nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6Al</td><td>Sakura</td><td>60320417-0711 VID6E3-1</td><td>Automatyczne urządzenie do zatapiania</td></tr><tr><td>Kleszcze tytanowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11602-16</td><td>Kleszcze do usuwania skorupek jaj i manipulacji tkankami jajnikowymi</td></tr><tr><td>Toluen, pa</td><td>VWR</td><td>28701364</td><td>Roztwór do zatapiania parafiny</td></tr></tbody></table>

model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (cam) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika

The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

Kriokonserwacja i przeszczep tkanek jajnikowych to skuteczna strategia zachowania płodności, ale ma jedną główną wadę, a mianowicie masową utratę pęcherzyków występującą wkrótce po reimplantacji z powodu nieprawidłowej aktywacji i śmierci pęcherzyka. Gryzonie są wzorcowymi modelami do badania aktywacji mieszków włosowych, ale koszty, czas i względy etyczne stają się coraz bardziej zaporowe, co napędza rozwój alternatyw. Model błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jest szczególnie atrakcyjny, ponieważ jest niedrogi i utrzymuje naturalny niedobór odporności do 17 dnia po zapłodnieniu, co czyni go idealnym do badania krótkoterminowego ksenoprzeszczepu ludzkiej tkanki jajnika. CAM jest również wysoce unaczyniony i jest szeroko stosowany jako model do badania angiogenezy. Daje mu to niezwykłą przewagę nad modelami in vitro i pozwala na badanie mechanizmów wpływających na wczesny proces utraty mieszków włosowych po przeszczepie. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół ma na celu opisanie rozwoju modelu ksenoprzeszczepu CAM dla ludzkiej tkanki jajnika, ze szczegółowymi wglądami w skuteczność techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w 6-dniowym okresie przeszczepu.

Wskaźniki przeżywalności zarodków kurzych 
Wskaźnik przeżywalności zarodków od momentu wykonania okienka (3. dzień ED) do przeszczepienia tkanki jajnika (7. dzień ED) wyniósł 79% (33/42). Ponieważ odsetek jaj zapłodnionych w dniu 0 był nieznany, zamówiono nadmiarową liczbę jaj w dniu 0 od białych kur rasy Leghorn wyselekcjonowanych przez Lohman, aby zapewnić dostępność wystarczającej liczby zapłodnionych jaj do przeszczepienia. Do przeszczepiania wykorzystano łącznie 23 żywotne jaja w 7. dniu, z który...

Tutaj opisujemy protokół rozwoju modelu ksenoprzeszczepu błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) dla ludzkiej tkanki jajnika i demonstrujemy skuteczność tej techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w ciągu 6-dniowego okresu szczepienia.

Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle ...

Zastosowanie CAM do obserwacji wczesnych zmian po przeszczepieniu tkanki jajnikowej ma istotną przewagę nad modelami in vitro, ponieważ pozwala na zbadanie mechanizmu wpływającego na wczesny proces unaczynienia i utraty pęcherzyków. Technika ta jest niedroga i może być wykonywana bez ryzyka odrzucenia przeszczepu z powodu naturalnego niedoboru odporności zarodka przez pierwsze 17 dni. Co więcej, takie podejście nie budzi żadnych zastrzeżeń etycznych ani prawnych w świetle prawa europejskiego.Najlepszą strategią rozwijania umiejętności manualnych potrzebnych do manipulacji komórkami jajowymi może być trening z niezarodkowymi komórkami jajowymi przed właściwym eksperymentem. Na początek oznacz markerem jaja dnia zero otrzymane od wybranych przez Louvain białych piskląt leghorn. Wysiaduj jaja w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza, spiczastymi końcami skierowanymi w dół.Obróć jajka o 180 stopni, dwa do trzech razy dziennie ręcznie. W ciemności umieść świecę do jajka przy skorupce jajka i wskaż środek kieszeni powietrznej na skorupce jajka za pomocą markera. Włącz światła i obróć sterylną prostą szpilkę w zaznaczonej pozycji, aby uzyskać otwór o długości około jednego milimetra.Zlokalizuj worek z żółtkiem w ciemności za pomocą świecznika do jajek. Nakłuć jajko sterylną igłą o rozmiarze 19, ustawioną pod kątem 45 stopni w kierunku dna jajka, nie naruszając worka z żółtkiem. Odessać od 1,5 do dwóch mililitrów albuminy, aby odłączyć CAM od powłoki.Następnie zamknij otwór taśmą klejącą. Włącz światła i narysuj prostokątne okno o wymiarach 1 na 1,5 centymetra na poziomo umieszczonym jajku. Trzymaj jajko w jednej ręce i delikatnie wytnij okienko w skorupce jajka za pomocą brzeszczotu do przewijania, nie rozbijając skorupki.regularnie, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia z muszli. Wsuń sterylne kleszczyki pod prostokątny kawałek skorupy i wyjmij je czysto, nie uszkadzając CAM. Następnie wyrzuć białą zewnętrzną błonę skorupy, aby zobaczyć zarodek i CAM.W zdolnych do życia zarodkach jajowych w trzecim dniu rozwoju zarodka obserwuje się przezroczystą albuminę, pierścień naczyniowy wokół zarodka, a czasem bijące serce. Pod pokrywą z przepływem laminarnym umieść jajko na stojaku na jajka z okienkiem skierowanym do góry i odklej taśmę. Delikatnie umieść i natychmiast usuń jednocentymetrowy kwadratowy pasek sterylnego bibuły do soczewek ekstrahowanych eterem na powierzchnię nabłonka, aby uszkodzić niewielki obszar CAM.Następnie chwyć jeden zamrożony, rozmrożony pasek kory jajnika za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych i umieść go na uszkodzonym CAM stroną rdzeniową przy CAM. Oceń przeszczep makroskopowo i zwróć szczególną uwagę na reakcję naczyniową CAM w kierunku przeszczepu przed zrobieniem cyfrowych zdjęć lub filmów. Po zakończeniu zbierz przeszczep, chwytając tkankę lub otaczającą CAM kleszczami i ostrożnie wycinając przeszczep z CAM za pomocą nożyczek.Przeszczepy były żywotne w 100% przypadków po pierwszym dniu szczepienia. Były one już częściowo przylegające do CAM i wykazywały wzór szprych kół naczyń krwionośnych potrzebnych do ich unaczynienia. Po sześciu dniach od przeszczepu implanty zostały przyklejone do CAM.Około trzeciego dnia po przeszczepie przeszczepy zostały pokryte drugą warstwą CAM i zostały otorbione. Przeszczep wykazał dobre unaczynienie, przy czym 80% przeszczepów przenikało do komórki jajowej. Dwa przeszczepy nie przyczepiły się do CAM i przybrały martwiczy wygląd, co spowodowało, że wskaźnik przeżycia przeszczepionej tkanki wyniósł 83% po sześciu dniach.W ocenie histologicznej przeszczepu obserwowano zdrowe pęcherzyki we wszystkich punktach czasowych. Po przeszczepie zaobserwowano nieznaczny spadek gęstości mieszków włosowych. Wskaźniki przeżywalności pęcherzyków utrzymywały się w okresie szczepienia na poziomie 95% w pierwszym dniu i 83% w szóstym dniu.Najtrudniejszą częścią jest wykonanie małego otworu wymaganego do zassania albuminy, aby odłączyć CAM od skorupki jajka, przed utworzeniem okienka. Zbyt duży nacisk może spowodować nadmierną stymulację, a nawet pęknięcie i zniszczenie jaja, powodując nieodwracalne uszkodzenie CAM lub jego układu naczyniowego. Model ten jest idealny do testowania kilku aspektów wczesnego okresu po przeszczepie tkanki jajnikowej, w tym wpływu czynników proangiogennych, ochronnych środków przeciwutleniających, cytokin, hormonów i innych czynników kontrolujących aktywację pęcherzyków jajnikowych i wczesny wzrost.Model ten wskazał na związek między wczesnym unaczynieniem a modulacją aktywacji pęcherzyków, które są dwoma głównymi zdarzeniami powodującymi spadek rezerwy jajnikowej po przeszczepieniu tkanki jajnikowej.

the-chick-chorioallantoic-membrane-cam-model-as-tool-to-study-ovarian

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Błona chorioallantoiczna (CAM) zarodka kurczaka stanowi unikalne, naturalnie immunodeficyjne środowisko hodowlane do badania angiogenezy i tumorigenzy. Niniejszy artykuł wideo prezentuje poszczególne etapy hodowli kurczaka ex ovo, aplikację substancji potencjalnie angiogennych oraz skuteczną inokulację komórek i tkanek nowotworowych na powierzchni CAM.

Hodowla kurcząt ex ovo oraz test CAM ex ovo: jak to naprawdę działa

W tym filmie opisujemy technikę otwierania skorupki zapłodnionego jaja kurzego w celu odsłonięcia jego błony kosmówkowo-omoczniowej lub CAM niosącego sieć rozgałęzionych naczyń krwionośnych. Odsłonięty CAM może być stosowany do modelowania guza w ovo.

Okienkowanie jaj: metoda otwierania zapłodnionej skorupki jaja kurzego w celu odsłonięcia naczyń naczyniowych błony moczowo-omoczniowej

W tym filmie opisujemy wszczepianie komórek rakowych na błonę kosmówkowo-omoczniową kurczaka w celu wygenerowania modelu in ovo. Model z powodzeniem wszczepia komórki raka jajnika w celu zbadania progresji raka ginekologicznego.

Modelowanie raka błony moczowo-omoczniowej kurczaka: model in ovo do badania nowotworzenia i przerzutów komórek rakowych

W tym filmie opisujemy metodę wspólnego hodowania zwojów korzenia grzbietowego i komórek rakowych na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurcząt lub CAM w celu zbadania inwazji okołonerwowej.

Błona kosmówkowo-omocznaniowa piskląt lub model guza CAM: metoda in ovo do symulacji okołonerwowej inwazji komórek nowotworowych

Ten film pokazuje izolację błony kosmówkowo-omoczniowej zawierającej guz od zarodka kurczaka. Pozyskany CAM może być wykorzystany do dalszych zastosowań.

Zbiór błony chorioallantoicznej piskląt: metoda izolowania błony chorioomocznowej zawierającej przeszczep guza z jaja kurzego

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) in ovo jest przeszczepiona świeżymi tkankami nowotworowymi pochodzącymi z mięsaka, ich pojedynczymi zawieszeniami komórkowymi oraz stałymi i przejściowymi fluorescencyjnie znakowanymi liniami komórkowymi mięsaka. Model służy do badania zachowań przeszczepu (żywotność, wskaźnik proliferacji Ki67, martwica, infiltracja) i gospodarza (naciekanie fibroblastów, wrastanie naczyń).

Test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) jest niedoszczepiona immunologicznie i wysoce unaczyniona, co czyni ją naturalnym modelem in vivo wzrostu guza i angiogenezy. W tym protokole opisujemy wiarygodną metodę hodowli trójwymiarowych, unaczynionych guzów raka wątrobowokomórkowego (HCC) za pomocą testu CAM.

Test błony chorioomoczniowej piskląt in ovo (CAM) jako skuteczny model ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego

Inwazja okołonerwowa jest agresywnym fenotypem dla raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz innych nowotworów. Model błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia został wykorzystany do badania angiogenezy, inwazji raka i przerzutów. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ten model można wykorzystać do oceny inwazji okołonerwowej in vivo.

Błona naczyniówkowo-omocznaniowa piskląt w modelu in vivo do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

Ten protokół opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurczaków w wieku od 5 do 8 dni oraz ich błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) ptasiego zarodka jest bardzo użytecznym i przydatnym narzędziem w różnych dziedzinach badań. Specjalny model ex ovo przepiórki japońskiej CAM nadaje się do badań nad leczeniem fotodynamicznym.

Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej

Poznaj model błony moczowo-omoczniowej kurcząt do badania przeszczepu tkanki jajnika. Technika umożliwia obserwację wczesnej rewaskularyzacji i przeżywalności pęcherzyków w kontrolowanych warunkach in vivo.

Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika

Przeglądaj więcej filmów