Name: Zakażenie pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz w celu scharakteryzowania interakcji między człowiekiem a koronawirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj metodę infekcji pierwotnych komórek nabłonka nosa w kulturze ALI do badania interakcji człowiek-koronawirus. Ta technika umożliwia analizę kinetyki replikacji, tropizmu komórkowego i odpowiedzi immunologicznej w fizjologicznym mikrośrodowisku nabłonka oddechowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie ma następujące źródła finansowania: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. i N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. i N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. i N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

Wykorzystanie próbek z nosa zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Pensylwanii (protokół nr 800614) oraz Institutional Review Board VA w Filadelfii (protokół nr 00781).
1. Zakażanie kultur ALI z nosa
UWAGA: Pozyskiwanie próbek klinicznych, a także hodowla i różnicowanie kultur nosowych ALI, wykraczają poza zakres niniejszej pracy. Szczegółowe metody hodowli pierwotnych komórek nabłonka nosowego można znaleźć w niedawno opublikowanych pracach wykorzystujących te kultury18,22,23. Poniższe protokoły mogą zostać dodatkowo zastosowane do komercyjnie dostępnych kultur ALI nabłonka nosowego, jeśli jest taka potrzeba. Protokoły i objętości opisane poniżej odnoszą się do wkładów transwell w płytkach 24-dołkowych (średnica 6,5 mm, powierzchnia membrany 0,33 cm2). W przypadku stosowania kultur ALI hodowanych na większych wkładach transwell (np. płytki 12-dołkowe, średnica 12 mm, powierzchnia 1,12 cm2), należy proporcjonalnie dostosować objętości do rozmiaru wkładu transwell.
<ol>
	<li>Dzień przed infekcją:
	<ol>
		<li>Przemyć kultury ALI 3x od strony apikalnej roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (dodać ~200 μL podgrzanego PBS, umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 min, odessać PBS i powtórzyć).</li>
		<li>Wymienić pożywkę bazalną (500 μL).</li>
		<li>Pozostawić kultury na noc w celu wyrównania temperatury do tej, w której będą przeprowadzane infekcje (np. jeśli infekcja ma odbywać się w 33 °C, umieścić kultury w inkubatorze 33 °C po przemyciu PBS). 
		UWAGA: Doniesiono, że HCoVs związane z przeziębieniem, takie jak HCoV-229E i HCoV-NL63, replikują się wydajniej w 33 °C. Ponadto temperatura nabłonka nosowego in vivo wynosi 33 °C (różni się ona od temperatury płuc, która wynosi 37 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć wirusa w zależności od potrzeb w bezserowej pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), aby uzyskać pożądaną wielokrotność infekcji (MOI) w całkowitej objętości inokulum wynoszącej 50 μL. 
	UWAGA: Infekcje zazwyczaj przeprowadzano przy MOI = 5 (wysokie MOI); jednak w przypadku SARS-CoV-2 oraz HCoVs związanych z przeziębieniem stosowano również infekcje przy MOI = 0,5 (niskie MOI), co prowadzi do porównywalnych szczytowych mian wirusa, ale z różną kinetyką (oba poziomy MOI są dopuszczalne).</li>
	<li>Dodać inokulum apikalnie i umieścić kultury z powrotem w inkubatorze na 1 h.</li>
	<li>Delikatnie kołysać płytkami co 15 min podczas infekcji (trzymając płytkę mocno obiema rękami, kołysać przód-tył oraz na boki, aby zapewnić równomierną adsorpcję inokulum wirusowego).</li>
	<li>Po 1 h inkubacji odessać inokulum wirusowe i przemyć każdą zainfekowaną kulturę 3x PBS, aby zapewnić usunięcie inokulum wirusowego (przy każdym przemywaniu dodać 200 μL PBS, inkubować przez 5 min, a następnie odessać lub usunąć pipetą).</li>
	<li>W razie potrzeby zebrać trzecie przemycie PBS, aby potwierdzić odpowiednie usunięcie wirusa wejściowego.</li>
	<li>Wymieniać pożywkę bazalną na świeżą w zainfekowanych kulturach ALI co 72 h podczas trwania infekcji.</li>
</ol>
2. Pobieranie płynu powierzchniowego nabłonka (ASL) i miareczkowanie uwolnionego wirusa
<ol>
	<li>W określonych punktach czasowych po zakażeniu, dodaj 200 μL PBS do komory apikalnej każdego zakażonego transwellu. 
	UWAGA: Odpowiednie punkty czasowe różnią się w zależności od badanego HCoV i wynoszą od 24 h do 192 h po zakażeniu (patrz sekcja z reprezentatywnymi wynikami w celu uzyskania danych dotyczących replikacji wirusowej dla różnych HCoVs).</li>
	<li>Pipetuj PBS w górę i w dół 5x, aby zapewnić maksymalne zebranie wirusa wydzielanego apikalnie, a następnie zbierz całą objętość do probówki do mikrocentryfugi (jest to próbka ASL). 
	UWAGA: ASL zawiera wydzielone cząsteczki wirusa oprócz śluzu i innych produktów wydzielanych apikalnie z kultur ALI.</li>
	<li>Ilościowo określ zawartość wirusa zakaźnego w ASL poprzez standardowy test plackowy (przeprowadź rozcieńczenia seryjne próbek zawierających wirusa w celu określenia stężenia cząsteczek wirusa). 
	UWAGA: Typy komórek i okres inkubacji stosowane w teście plackowym będą zależeć od użytego wirusa: SARS-CoV-2 (komórki VeroE6); MERS-CoV (komórki VeroCCL81); HCoV-NL63 (komórki LLC-MK2); HCoV-229E (komórki Huh7). Szczegóły dotyczące przeprowadzania testów plackowych wykraczają poza zakres niniejszego opracowania, ale zostały szczegółowo opisane wcześniej w publikacji Journal of Visualized Experiments (JoVE)24.</li>
	<li>W razie potrzeby zbierz medium bazalne w różnych odstępach czasu po zakażeniu, aby potwierdzić brak wirusa uwalnianego bazalnie. HCoVs są zazwyczaj uwalniane apikalnie z komórek nabłonka nosowego, ale należy to potwierdzić poprzez test plackowy nierozcieńczonego medium bazalnego.</li>
	<li>Próbki ASL przechowuj w temperaturze −80 °C, jeśli oznaczanie ilościowe za pomocą testu plackowego nie zostanie przeprowadzone w dniu pobrania.</li>
</ol>
3. Ilościowe oznaczenie wirusa wewnątrzkomórkowego
<ol>
	<li>Po pobraniu próbki ASL, przenieś każdy insert transwell do czystej płytki 24-dołkowej, w której uprzednio umieszczono 500 μL DMEM zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w części bazalnej. 
	UWAGA: DMEM z 2% FBS jest stosowany w celu stabilizacji wirusa podczas następnych cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Przemyj każdy insert transwell 3x od strony apikalnej PBS, aby zapewnić całkowite usunięcie wirusa wydzielonego apikalnie.</li>
	<li>Po odessaniu ostatniej porcji PBS użytej do płukania, dodaj 100 μL DMEM z 2% FBS do komory apikalnej.</li>
	<li>Przenieś płytkę zawierającą inserty transwell z mediami w częściach apikalnej i bazalnej do zamrażarki o temperaturze −80 °C i przeprowadź trzy kolejne cykle zamrażania i rozmrażania, aby zlizować komórki.</li>
	<li>Po ostatnim cyklu zamrażania i rozmrażania, połącz media apikalne (100 μL) i bazalne (500 μL) w czystej probówce.</li>
	<li>Wiruj przy 500 × g przez 10 min w 4 °C, aby osadzić resztki komórkowe.</li>
	<li>Zabierz nadsącz. Jest to próbka wirusa wewnątrzkomórkowego do miareczkowania via standardowy test plackowy. 
	UWAGA: Podczas procesu pobierania dochodzi do trzykrotnego rozcieńczenia w stosunku do pobierania ASL; próbki ASL są pobierane w 200 μL PBS, podczas gdy próbka wirusa wewnątrzkomórkowego jest pobierana do całkowitej objętości 600 μL.</li>
</ol>
4. Pomiar transepitelialnej oporności elektrycznej (TEER)
UWAGA: Do pomiaru TEER należy stosować PBS uzupełniony o wapń i magnez (PBS + Ca2+/Mg2+). Należy użyć epiteliowego woltomierza/omomierza ustawionego na pomiar w omach (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Oczyścić, zrównoważyć i skalibrować urządzenie EVOM zgodnie z instrukcjami producenta; do kalibracji (blankingu) należy użyć „pustego” transwellu bez dodanych komórek nosa. Zapisać pomiar TEER dla próbki kontrolnej. 
	UWAGA: W przypadku użycia wielu wirusów, urządzenie EVOM musi być rygorystycznie czyszczone pomiędzy poszczególnymi warunkami, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych (wystarczające jest płukanie 70% etanolem, a następnie wodą dejonizowaną).</li>
	<li>Przenieść każdy zainfekowany transwell do wcześniej oznakowanej, czystej płytki 24-dołkowej zawierającej 500 μL PBS + Ca2+/Mg2+ w części bazalnej, aby wypłukać pozostałości pożywki bazalnej z transwelli.</li>
	<li>Dodać 200 μL PBS + Ca2+/Mg2+ do komory apikalnej każdego transwellu.</li>
	<li>Dodać 1 mL PBS + Ca2+/Mg2+ do komory pomiarowej Endohm-6.</li>
	<li>Przenieść każdy transwell do komory pomiarowej Endohm-6 i założyć pokrywę komory w taki sposób, aby elektroda apikalna spoczywała w 200 μL PBS w komorze apikalnej; elektroda bazalna jest wbudowana w dno komory Endohm-6.</li>
	<li>Odczekać do ustabilizowania się odczytu EVOM i zapisać surową wartość pomiaru TEER.</li>
	<li>Jeśli planowane jest miareczkowanie, po wykonaniu pomiaru TEER pobrać próbkę ASL zgodnie z powyższym opisem (pobrać z 200 μL PBS + Ca2+/Mg2+ dodanego do pomiaru TEER). 
	UWAGA: Pobieranie próbek ASL może powodować mikrouszkodzenia bariery nabłonkowej, co może zaburzyć odczyty TEER, dlatego ASL należy pobierać po pomiarze TEER. Ponadto nie wolno wymieniać pożywki bazalnej bezpośrednio przed pomiarami TEER, ponieważ może to również wpłynąć na wartości TEER.</li>
	<li>Aby przeliczyć surowe odczyty TEER na końcowe pomiary w Ohms/cm2, odjąć wartość TEER dla próbki kontrolnej, a następnie pomnożyć otrzymany wynik przez powierzchnię membrany transwellu, korzystając z równania (1): 
	TEER = [odczyt TEER - wartość TEER próbki kontrolnej] × (powierzchnia transwellu)    (1)</li>
	<li>W przypadku HCoVs oceniać TEER co 24 h lub 48 h po infekcji; kinetyka zmian TEER często różni się w zależności od wirusa i wymaga weryfikacji w różnych punktach czasowych.</li>
	<li>Podczas pomiaru TEER zawsze należy uwzględnić hodowle mock-zainfekowane i oceniać je w każdym punkcie czasowym (kontrola negatywna). 
	UWAGA: Dla hodowli mock pomiary TEER powinny pozostać stabilne lub mogą nieznacznie wzrosnąć względem poziomu bazowego po zakończeniu różnicowania hodowli. Powierzchnia nośników membranowych różni się w zależności od rozmiaru i producenta transwelli; transwelle do płytek 24-dołkowych mają zazwyczaj powierzchnię 0.33 cm2.</li>
</ol>
5. Pomiar cytotoksyczności podczas infekcji za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH)
UWAGA: W niniejszej pracy zawartość LDH w próbkach ASL została ilościowo określona przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu do wykrywania cytotoksyczności. Sygnał LDH w pożywce podstawowej często znajdował się poniżej granicy wykrywalności i był zazwyczaj mniej powtarzalny niż LDH oznaczone ilościowo w próbkach ASL z kultur zakażonych HCoV.
<ol>
	<li>Przygotować dodatkowe kontrole niezbędne do oznaczenia LDH.
	<ol>
		<li>Kontrola tła: użyć PBS (użyć PBS zawierającego wapń i magnez, jeśli próbki ASL były pobierane w ten sposób).</li>
		<li>Kontrola pozytywna (wartość maksymalna): potraktować ALIs apikalnie Tritonem X-100. Zebrać próbki z dołków kontrolnych z Tritonem (zazwyczaj wykorzystuje się do tego trzy kultury ALI dla każdego punktu czasowego).
		<ol>
			<li>Dodać 200 μL 2% Triton X-100 w PBS bezpośrednio do komory apikalnej transwellu.</li>
			<li>Inkubować przez 10-15 min, aby umożliwić całkowną lizę komórek.</li>
			<li>Zebrać całą objętość jako próbkę maksymalną z Tritonem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kontrola negatywna (kontrola niskiego poziomu/bazowe uwalnianie LDH): zebrać ASL z kultur ALI w grupie mock, pochodzących od tego samego dawcy co kultury zainfekowane.
		<ol>
			<li>Zebrać ASL z kontroli negatywnej (mock) zgodnie z powyższą procedurą pobierania ASL. 
			UWAGA: Te same transwelle mogą być użyte do tej kontroli negatywnej dla wszystkich punktów czasowych, natomiast dla kontroli z Tritonem niezbędne będą świeże transwelle dla każdego punktu czasowego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby umożliwić kwantyfikację wydzielonego wirusa oprócz odczytów LDH z każdej próbki ASL, napełnić optycznie przezroczystą czarną płytkę 96-dołkową z płaskim dnem w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć wszystkie próbki w PBS, używając 45 μL próbki i 55 μL PBS (całkowita objętość 100 μL).</li>
		<li>Próbki kontroli pozytywnej z Tritonem oraz kontroli tła (mock) potraktować w ten sam sposób. 
		UWAGA: Rozcieńczenie to pozwala na trzykrotne naniesienie każdej próbki eksperymentalnej (45 μL x 3) i pozostawienie wystarczającej objętości ASL do miareczkowania za pomocą testu plackowego.</li>
		<li>Nanieść na płytkę LDH w trzech powtórzeniach: próbkę maksymalną z Tritonem, kontrolę tła (mock), kontrolę PBS oraz próbki eksperymentalne.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną zgodnie z instrukcją producenta (roztwór barwnika + katalizator).
		<ol>
			<li>Dodać 100 μL mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 min, chroniąc ją przed światłem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po 20 min zmierzyć absorbancję przy 492 nm.</li>
		<li>Obliczyć procent cytotoksyczności w stosunku do wartości maksymalnej z Tritonem, korzystając z równania (2). 
		Cytotoksyczność (%) <img alt="równanie pokazujące obliczanie procentowe dla analizy eksperymentalnej, obejmujące kontrolę Tritonem i wartości mock" src="/files/ftp_upload/64868/64868eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">    (2)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przygotowanie hodowli nosowych ALI do obrazowania immunofluorescencyjnego (IF)
<ol>
	<li>Przenieś wkład transwell do nowej płytki 24-dołkowej i przemyj 3x od strony apikalnej roztworem PBS (pierwszy płukanie PBS zbierz jako ASL w przypadku miareczkowania; następnie wykonaj dwa dodatkowe płukania PBS, aby usunąć nadmiar uwolnionego wirusa, który mógłby pogorszyć jakość IF)</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu PBS zakryj wkład transwell od strony apikalnej i bazalnej 4% PFA.</li>
	<li>Inkubuj przez 30 min w celu utrwalenia w 4% PFA, a następnie usuń i przemyj 3x roztworem PBS.</li>
	<li>Wytnij wspornik transwell zawierający komórki, używając naostrzonego ostrza do golenia lub nożyczek.</li>
	<li>Aby zwiększyć liczbę celów IF dla każdego wkładu transwell, przetnij każdą membranę na pół i barw każdą połowę za pomocą różnych kombinacji przeciwciał.</li>
	<li>Przeprowadź permeabilizację roztworem 0,2% Triton X-100 w PBS przez 10 min.</li>
	<li>Blokuj 10% normalnym surowicą osła i 1% BSA w PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) przez 60 min w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Od tego etapu włącznie chroń próbki przed ekspozycją na światło.</li>
	<li>Inkubuj w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C. Wszystkie przeciwciała rozcieńcz 1:1 000 w buforze blokującym. 
	UWAGA: Reprezentatywne przeciwciała do barwienia nukleokapsydu HCoV, a także markery typów komórek nabłonkowych i barwienia cytoszkieletu są wymienione poniżej (informacje o producentach i numery katalogowe znajdują się w Tabeli materiałów).
	<ol>
		<li>Do barwienia antygenów HCoV użyj przeciwciał skierowanych przeciwko nukleokapsydowi SARS-CoV-2, nukleokapsydowi MERS-CoV i nukleokapsydowi HCoV-NL63.</li>
		<li>Aby zidentyfikować typy komórek nabłonkowych, użyj przeciwciał skierowanych przeciwko markerowi komórek kubkowych MUC5AC oraz markerowi komórek rzęskowych β-tubulinie typu IV.</li>
		<li>Jako markerów cytoszkieletu użyj przeciwciał skierowanych przeciwko faloidynie (wiąże F-aktynę) oraz markera adhezji komórek nabłonkowych: EpCAM (CD326).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubuj w roztworze przeciwciał wtórnych przez 60 min w temperaturze pokojowej; użyj barwników przeciwciał wtórnych rozcieńczonych 1:1 000 w buforze blokującym.</li>
	<li>Po zakończeniu barwienia przenieś membranę na szkiełko przedmiotowe za pomocą szpatułki, ustaw wkład transwell stroną apikalną w stronę szkiełka i dodaj medium montażowe. Pozostaw do osadzenia na 15-30 min przed nałożeniem bezbarwnego laku do paznokci wokół krawędzi.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego (skok w osi Z: 0,5 μm; skanowanie sekwencyjne)1,16,17. 
	​UWAGA: Po utrwaleniu kultur w 4% PFA i przemyciu PBS, utrwalone kultury można przechowywać w temperaturze 4 °C od kilku tygodni do kilku miesięcy przed barwieniem i przygotowaniem do obrazowania. Po zabarwieniu i zamontowaniu membran próbki można przechowywać długoterminowo (&gt;2 lata) w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
</ol>
7. Pobieranie białek wewnątrzkomórkowych do western blotu lub RNA do analizy RT-qPCR
<ol>
	<li>Pobrać ASL zgodnie z powyższym opisem w przypadku oznaczania miana wirusa (sekcja 2 protokołu).</li>
	<li>Przenieść transwell do czystej płytki 24-dołkowej, ponieważ skrobanie membrany może doprowadzić do uszkodzenia wkładki.</li>
	<li>Do analizy western blot pobrać całkowity lizat białkowy w 125 μL buforu RIPA (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% dejksykolanu, 0,1% SDS, 1% NP40) uzupełnionego o inhibitory proteaz i fosfataz.</li>
	<li>Dodać 125 μL buforu RIPA do komory apikalnej i inkubować przez 5-10 min.</li>
	<li>Zeskrobać membranę za pomocą końcówki pipety P200, aby usunąć wszystkie pozostałe przytwierdzone komórki, a następnie zebrać całą objętość (skrobać energicznie całą powierzchnię membrany, a następnie kilkakrotnie pipetować próbkę w górę i w dół, aby zebrać ją w całości).</li>
	<li>Inkubować próbki lizatu białkowego na lodzie przez 10 min, a następnie wirować z maksymalną prędkością (20 000 × g) przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wymieszać nadsącz z 4x buforem do próbek Laemmli z β-merkaptoetanolem (środkiem redukującym) zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Gotować próbki białek w temperaturze 95 °C przez 5 min, a następnie przeprowadzić analizę zgodnie z tradycyjnymi protokołami western blotting1,16,17.</li>
	<li>W celu wyizolowania całkowitego RNA należy użyć dowolnego dostępnego komercyjnie zestawu do ekstrakcji RNA. 
	UWAGA: Komora apikalna wkładek transwell 24-dołkowych ma maksymalną objętość ok. 200 μL; dlatego w każdej hodowli wykonujemy dwa następujące po sobie przemycia, aby osiągnąć całkowitą zalecaną objętość. Poniższe szczegóły odpowiadają zalecanemu pobraniu próbek RNA w całkowitej objętości 350 μL.</li>
	<li>Dodać 200 μL buforu do lizy do komory apikalnej zainfekowanego transwellu.</li>
	<li>Pozostawić na 5-10 min, zeskrobać pozostałe komórki z membrany za pomocą końcówki pipety i zebrać całą objętość do opisanej probówki do mikrowirowania.</li>
	<li>Dodać dodatkowe 150 μL buforu do lizy do komory apikalnej transwellu i pipetować w górę i w dół przed zebraniem do tej samej probówki do mikrowirowania.</li>
	<li>Wyekstrahować RNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+primary+nasal+epithelial+cells+differentiates+among+lethal+and+seasonal+human+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120(2023).</li>
<li>Fehr, A., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronaviruses%3A+An+overview+of+their+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).</li>
<li>Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+clinical+presentations+of+the+four+human+coronaviruses+229E%2C+HKU1%2C+NL63%2C+and+OC43+detected+over+3+years+using+a+novel+multiplex+real-time+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).</li>
<li>Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+on+the+seven+pathogenic+human+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">An overview on the seven pathogenic human coronaviruses.</a> Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282(2022).</li>
<li>MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update">https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update</a> (2022).</li>
<li>MERS Situation Update. World Health Organization Regional Office for the Eastern Mediterranean. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.emro.who.int/health-topics/mers-cov/mers-outbreaks.html">http://www.emro.who.int/health-topics/mers-cov/mers-outbreaks.html</a> (2022).</li>
<li>Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+clinical+features+of+patients+with+2019+novel+coronavirus+SARS-CoV-2%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).</li>
<li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+Soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).</li>
<li>Farzal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+simulated+nebulized+and+spray+particle+deposition+in+chronic+rhinosinusitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Forum+of+Allergy+and+Rhinology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients.</a> International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).</li>
<li>Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral-lung+axis%3A+The+impact+of+oral+health+on+lung+health%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Care%22%5BJournal%5D)">The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health.</a> Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+reverse+genetics+reveals+a+variable+infection+gradient+in+the+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract.</a> Cell. 182, 429-446 (2020).</li>
<li>Hariri, B. M., Cohen, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+upper+airway+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Rhinology+and+Allergy%22%5BJournal%5D)">New insights into upper airway innate immunity.</a> American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).</li>
<li>Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+function+of+airway+epithelial+cells+in+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease.</a> European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).</li>
<li>Hatton, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+induction+of+type+I+and+III+interferons+mediates+nasal+epithelial+cell+permissiveness+to+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2.</a> Nature Communications. 12 (1), 7092(2021).</li>
<li>Sungnak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+factors+are+highly+expressed+in+nasal+epithelial+cells+together+with+innate+immune+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes.</a> Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+induces+double-stranded+RNA-mediated+innate+immune+responses+in+respiratory+epithelial-derived+cells+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118(2021).</li>
<li>Comar, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MERS-CoV+endoribonuclease+and+accessory+proteins+jointly+evade+host+innate+immunity+during+infection+of+lung+and+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119(2022).</li>
<li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+D-amino+acids+suppress+sinonasal+innate+immunity+through+sweet+taste+receptors+in+solitary+chemosensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells.</a> Science Signaling. 10 (495), (2017).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385(2018).</li>
<li>Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+obtained+from+patients+with+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD.</a> PLoS One. 7 (3), e32924(2012).</li>
<li>Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+epithelial+cells+to+assess+in+vitro+immune+responses+to+respiratory+virus+infection+in+pregnant+women+with+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma.</a> Respiratory Research. 20 (1), 259(2019).</li>
<li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+aflatoxins+reduce+respiratory+mucosal+ciliary+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function.</a> Scientific Reports. 6, 33221(2016).</li>
<li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+extracts+stimulate+solitary+chemosensory+cell+expansion+in+noninvasive+fungal+rhinosinusitis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Forum+of+Allergy+and+Rhinology%22%5BJournal%5D)">Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis.</a> International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+Using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065(2014).</li>
<li>Robinot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+induces+the+dedifferentiation+of+multiciliated+cells+and+impairs+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance.</a> Nature Communications. 12 (1), 4354(2021).</li>
<li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).</li>
<li>Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+disrupts+the+airway+epithelial+barrier+by+decreasing+cortactin+and+destabilizing+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin.</a> Journal of Cell Science. 135 (16), 259871(2022).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-13+impairs+tight+junctions+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222(2019).</li>
<li>Huang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-13+alters+tight+junction+proteins+expression+thereby+compromising+barrier+function+and+dampens+rhinovirus+induced+immune+responses+in+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749(2020).</li>
<li>Saatian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+and+interleukin-13+cause+barrier+dysfunction+in+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e24333(2013).</li>
<li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753(2020).</li>
<li>Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air%E2%88%92liquid+interface+cultures+of+the+healthy+and+diseased+human+respiratory+tract%3A+Promises%2C+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+NanoBiomed+Research%22%5BJournal%5D)">Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions.</a> Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111(2021).</li>
<li>Seibold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-13+stimulation+reveals+the+cellular+and+functional+plasticity+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).</li>
<li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+of+airway+cells+causes+intense+viral+and+cell+shedding%2C+two+spreading+mechanisms+affected+by+IL-13%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119(2022).</li>
</ol>

Susan Weiss jest członkiem Naukowych Rad Doradczych firmy Ocugen. Noam A. Cohen jest konsultantem GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron i Oyster Point Pharmaceuticals oraz posiada amerykański patent "Terapia i diagnostyka infekcji dróg oddechowych" (10 881 698 B2, WO20913112865) oraz umowę licencyjną z GeneOne Life Sciences.

Opisane tutaj metody opisują pierwotny system hodowli nabłonka, w którym komórki nabłonka nosa pochodzące od pacjenta są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz i stosowane do badania interakcji HCoV-gospodarz. Po różnicowaniu, te nosowe hodowle ALI podsumowują wiele cech nabłonka nosa in vivo , w tym heterogeniczną populację komórkową z reprezentowanymi komórkami rzęskowymi, kielichowymi i podstawnymi, a także nienaruszoną funkcją śluzowo-rzęskową z silnie bijącymi rzęskami i wydzielaniem śluzu. Ta heterogenicz...

Do tej pory zidentyfikowano siedem ludzkich koronawirusów (HCoV), które powodują szereg chorób układu oddechowego2. Powszechne lub sezonowe HCoV (HCoV-NL63, -229E, -OC43 i -HKU1) są zwykle związane z patologią górnych dróg oddechowych i powodują około 10%-30% przypadków przeziębienia rocznie. Chociaż jest to typowy fenotyp kliniczny związany z powszechnymi HCoV, wirusy te mogą powodować poważniejsze choroby dolnych dróg oddechowych w populacjach zagrożonych, w tym u dzieci, osób starszych i osób z obniżoną odpornością3,4. W ciągu ostatnich 20 lat pojawiły się trzy patogenne HCoV, które spowodowały poważne zagrożenia zdrowia publicznego, w tym zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS)-CoV, bliskowschodni zespół oddechowy (MERS)-CoV i SARS-CoV-2. Śmiertelne HCoV są związane z cięższą patologią dróg oddechowych, co wyraźnie ilustruje wskaźnik śmiertelności >34% związany z przypadkami MERS-CoV (894 zgony z ponad 2500 przypadków od czasu jego pojawienia się w 2012 roku)5,6. Należy zauważyć, że śmiertelne HCoV powodują również szereg chorób dróg oddechowych, od bezobjawowych infekcji po śmiertelne zapalenie płuc, co widać w przypadku trwającej pandemii COVID-197.
HCoV, podobnie jak inne patogeny układu oddechowego, dostają się do dróg oddechowych i wywołują produktywną infekcję w nabłonku nosa8. Uważa się, że rozprzestrzenianie się do dolnych dróg oddechowych jest związane z aspiracją z jamy ustnej/nosowej do płuc, gdzie HCoV powodują bardziej znaczącą patologię dolnych dróg oddechowych9,10,11. W ten sposób nos służy jako początkowy portal dla wnikania wirusa i jest główną barierą dla infekcji dzięki solidnej maszynerii usuwania śluzowo-rzęskowego i unikalnym wrodzonym mechanizmom immunologicznym mającym na celu zapobieganie dalszemu rozprzestrzenianiu się wirusa do dolnych dróg oddechowych12,13. Na przykład doniesiono, że komórki nabłonka nosa wyrażają wyższe niż przeciętne podstawowe poziomy interferonów przeciwwirusowych i genów stymulowanych interferonem, co wskazuje, że komórki nosa mogą być przygotowane do wczesnych odpowiedzi na wirusy układu oddechowego14,15,16.
Wcześniej wykorzystywaliśmy pierwotne komórki nabłonka nosa pochodzące od pacjentów, hodowane na granicy powietrze-ciecz (ALI) do modelowania interakcji HCoV-gospodarz w nosie, gdzie zaczynają się infekcje HCoV. Posiewy ALI w nosie są permisywne zarówno dla patogennych (SARS-CoV-2 i MERS-CoV), jak i powszechnych HCoV (HCoV-NL63 i HCoV-229E) i oferują różne zalety w porównaniu z tradycyjnymi liniami komórkowymi nabłonka dróg oddechowych, takimi jak A549 (linia komórkowa gruczolakoraka płuc)16,17. Po różnicowaniu, nosowe hodowle ALI zawierają niejednorodną populację komórkową i wykazują wiele funkcji oczekiwanych od nabłonka nosa in vivo, takich jak maszyneria do usuwania śluzowo-rzęskowego18. Komórki nosa mają również przewagę nad systemami hodowli dolnych dróg oddechowych (takimi jak ludzkie komórki nabłonka oskrzeli, HBEC), ponieważ pozyskiwanie komórek nabłonka nosa za pomocą szczotkowania cytologicznego jest znacznie mniej inwazyjne w porównaniu z technikami takimi jak bronchoskopia w celu uzyskania HBECs19,20,21.
Ten artykuł opisuje metody wykorzystania tego systemu hodowli ALI do scharakteryzowania interakcji HCoV-gospodarz w nabłonku nosa. Zastosowaliśmy te metody w niedawno opublikowanych pracach w celu porównania SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 i HCoV-229E1,16,17. Chociaż te metody i reprezentatywne wyniki kładą nacisk na badanie HCoV w tym modelu komórek nosa, system jest wysoce elastyczny do innych HCoV, a także innych patogenów układu oddechowego. Co więcej, metody te mogą być szerzej stosowane do innych systemów hodowli ALI w celu zbadania replikacji wirusa i tropizmu komórkowego, a także cytotoksyczności i wrodzonej indukcji immunologicznej po zakażeniu.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe Alexa Fluor (488, 594, 647)</td><td>Invitrogen</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini inhibitor proteazy wolny od EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania cytotoksyczności</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>DPBS + wapń + magnez</td><td>Gibco</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Komora pomiarowa Endohm-6G</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-6G</td><td></td></tr><tr><td>Marker adhezji komórek nabłonkowych (EpCAM; CD326)</td><td>eBiosciences</td><td>14-9326-82</td><td></td></tr><tr><td>Nabłonkowy miernik napięcia/oma (TEER) (EVOM)</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW oprogramowanie do obrazowania</td><td>Olympus</td><td>w wersji 4.02</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 (ludzki koronawirus, NL63)</td><td>Zasoby BEI</td><td>NR-470</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 przeciwciało nukleokapsydowe</td><td>Sino Biological</td><td>40641-V07E</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie Hoeschta</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek Laemmli (4x)</td> <td>Komórki BIO-RAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>LLC-MK2</td><td>ATCC</td><td>CCL-7</td><td>Do miareczkowania HCoV-NL63</td></tr><tr><td>MERS-CoV (ludzki koronawirus, koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS-CoV), EMC/2012)</td><td>Zasoby BEI&nbsp;</td><td>NR-44260</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało nukleokapsydu MERS-CoV</td><td>Sino Biological</td><td>40068-MM10</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało MUC5AC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMAB91539</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Olympus Fluoview</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 barwnik</td><td>Abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop easy pack (inhibitory fosfatazy)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH34000000</td><td>Wystarczy dowolny czytnik płytek lub czytnik ELISA; musi być w stanie odczytać absorbancję przy buforze RIPA 492 nm</td></tr><tr><td>(50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% deoksycholanu; 0,1% SDS; 1% NP40)</td><td>Thermo Fisher</td><td>89990</td><td>Można przygotować we własnym zakresie lub kupić</td></tr><tr><td>zestaw RNeasy Plus</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (koronawirus związany z SARS 2, izolat USA-WA1/2020)</td><td>Zasoby BEI</td><td>NR-52281</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało nukleokapsydu SARS-CoV-2</td><td>Genetex</td><td>GTX135357</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific BP151100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało &beta-tubulinowe typu IV Abcam</td><td></td><td>ab11315</td><td></td></tr><tr><td>Komórki VeroCCL81</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>Do miareczkowania komórek MERS-CoV</td></tr><tr><td>VeroE6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td>Do miareczkowania SARS-CoV-2</td></tr></tbody></table>

zakażenie pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz w celu scharakteryzowania interakcji między człowiekiem a koronawirusem

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

Trzy wysoce zjadliwe ludzkie koronawirusy (HCoV) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) i SARS-CoV-2 (2019) - pojawiły się i spowodowały poważne kryzysy zdrowia publicznego w ciągu ostatnich 20 lat. Cztery dodatkowe HCoV powodują znaczną część przypadków przeziębienia każdego roku (HCoV-NL63, -229E, -OC43 i -HKU1), co podkreśla znaczenie badania tych wirusów w fizjologicznie istotnych systemach. HCoV dostają się do dróg oddechowych i powodują infekcję w nabłonku nosa, głównym miejscu, z którym spotykają się wszystkie patogeny układu oddechowego. Używamy pierwotnego systemu hodowli nabłonka nosa, w którym próbki nosa pochodzące od pacjenta są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen w tym ważnym miejscu wartowniczym. Hodowle te podsumowują wiele cech dróg oddechowych in vivo, w tym obecne typy komórek, funkcję rzęsek i produkcję śluzu. Opisujemy metody charakteryzowania replikacji wirusa, tropizmu komórek gospodarza, cytotoksyczności indukowanej wirusem i wrodzonej indukcji immunologicznej w nosowych hodowlach ALI po zakażeniu HCoV, używając ostatnich prac porównujących śmiertelne i sezonowe HCoV jako przykład1. Lepsze zrozumienie interakcji gospodarz-patogen w nosie może potencjalnie dostarczyć nowych celów dla terapii przeciwwirusowych przeciwko HCoV i innym wirusom układu oddechowego, które prawdopodobnie pojawią się w przyszłości.

Reprezentatywne rysunki zostały częściowo zaadaptowane z danych zawartych w manuskrypcie Otter et al.1. Nosowe kultury ALI pochodzące od czterech lub sześciu dawców zainfekowano jednym z czterech HCoV (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 oraz HCoV-229E) zgodnie z opisanymi powyżej protokołami, a średnie miana wirusów wydzielanych apikalnie dla każdego wirusa przedstawiono na Rysunku 1A. Choć wszystkie cztery wymienione HCoV replikują się produktywnie w nosowych kulturach ...

Nabłonek nosa jest główną barierą, z którą spotykają się wszystkie patogeny układu oddechowego. W tym miejscu przedstawiamy metody wykorzystania pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych jako kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) w celu scharakteryzowania interakcji człowieka między koronawirusem a gospodarzem w fizjologicznie istotnym systemie.

Zakażenie pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz w celu scharakteryzowania interakcji między człowiekiem a koronawirusem

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

Opisane tutaj protokoły odpowiadają na kluczowe pytania, takie jak kinetyka replikacji, tropizm komórek gospodarza, wrodzona indukcja immunologiczna i indukcja cytotoksyczności w nabłonku nosa podczas infekcji ludzkimi koronawirusami. Protokół ten umożliwia badanie interakcji ludzkiego koronawirusa z gospodarzem w mikrośrodowisku organoidowym, które ściśle odzwierciedla cechy nabłonka nosa in vivo, w tym jego heterogeniczną populację komórkową i funkcje śluzowo-rzęskowe. Technika ta może być stosowana do innych systemów hodowli ALI, takich jak te pochodzące z dolnych dróg oddechowych.Dodatkowo system może być używany do naśladowania klinicznych stanów chorobowych, takich jak astma lub mukowiscydoza. Hoduj i różnicuj granicę faz powietrze-ciecz nosa lub kultury ALI w transwellach z komorą podstawową i wierzchołkową. Rozpręż zdysocjowane ludzkie komórki zatok przynosowych w stanie zanurzenia, po czym usuń pożywkę z komory wierzchołkowej, aby umożliwić różnicowanie kultur na granicy faz powietrze-ciecz.W dniu poprzedzającym zakażenie należy przemyć kultury ALI wierzchołkowo solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS. W tym celu dodaj 200 mikrolitrów podgrzanego PBS do komory wi

infection-primary-nasal-epithelial-cells-grown-at-an-air-liquid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda ta umożliwia charakteryzację rozszerzonej kokultury bakteryjnej z EpiAirways, czyli pierwotną ludzką tkanką nabłonkową dróg oddechowych hodowaną na granicy faz powietrze-ciecz, która stanowi biologicznie istotny model in vitro. Podejście to można zastosować w przypadku każdego mikroorganizmu nadającego się do długotrwałej kokultury.

Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzacji długotrwałych interakcji gospodarz-patogen

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Źródło: Otter, C. J., et al. Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions. J. Vis. Exp. (2023)Niniejszy film prezentuje wzrost koronawirusa w ludzkich komórkach nabłonka nosowego hodowanych na granicy fazy powietrze-ciecz (ALI), co odwzorowuje proces infekcji i replikacji wirusa w ludzkiej jamie nosowej.

Wzrost wirusa w ludzkich komórkach nabłonka nosa hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz

Wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

Ustanowienie pokrytej cieczą hodowli spolaryzowanych ludzkich komórek nabłonka nabłonka dróg oddechowych Calu-3 w celu zbadania odpowiedzi komórek gospodarza na patogeny układu oddechowego in vitro

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Ludzki syncytialny wirus oddechowy (HRSV) może powodować ciężkie zapalenie oskrzelików u małych niemowląt. Część patogenezy ciężkiej choroby HRSV jest spowodowana odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Stymulacja pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych za pomocą HRSV zapewnia szybki i powtarzalny system modelowy do badania aktywacji szlaków zapalnych i infekcji.

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

Ten protokół szczegółowo opisuje badanie wczesnych interakcji między wirusowo zakażonymi komórkami nabłonka nosa a aktywacją komórek wrodzonych. Poszczególne podzbiory komórek odpornościowych można rozróżnić na podstawie ich aktywacji w odpowiedzi na infekcje wirusowe. Następnie można je dalej badać w celu określenia ich wpływu na wczesne odpowiedzi przeciwwirusowe.

Bezkontaktowy model kohodowli do badania aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych podczas infekcji wirusem układu oddechowego

Tutaj opisujemy izolację, amplifikację i różnicowanie pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka nosa (HNE) na granicy powietrze-ciecz oraz protokół biobankowania pozwalający na skuteczne zamrażanie, a następnie rozmrażanie amplifikowanego HNE. W protokole analizowane są właściwości elektrofizjologiczne zróżnicowanych komórek HNE i korekcja wydzielania chlorków związanych z CFTR po różnych zabiegach modulatorowych.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa: biobankowanie w kontekście medycyny precyzyjnej

Ten artykuł opisuje generowanie złożonego, wielokomórkowego modelu bariery dróg oddechowych, składającego się z nabłonka płuc pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), mezenchymów, komórek śródbłonka i makrofagów w hodowli na granicy powietrza i cieczy.

Hodowla komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i odpornościowych pochodzących z iPSC w celu modelowania integralności bariery dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie płuc

Poznaj metodę infekcji pierwotnych komórek nabłonka nosa w kulturze ALI do badania interakcji człowiek-koronawirus. Ta technika umożliwia analizę kinetyki replikacji, tropizmu komórkowego i odpowiedzi immunologicznej w fizjologicznym mikrośrodowisku nabłonka oddechowego.

Zakażenie pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz w celu scharakteryzowania interakcji między człowiekiem a koronawirusem (Wideo) | JoVE Journal

Zakażenie pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz w celu scharakteryzowania interakcji między człowiekiem a koronawirusem

Przeglądaj więcej filmów