Zakażenie pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz w celu scharakteryzowania interakcji między człowiekiem a koronawirusem

Opisane tutaj protokoły odpowiadają na kluczowe pytania, takie jak kinetyka replikacji, tropizm komórek gospodarza, wrodzona indukcja immunologiczna i indukcja cytotoksyczności w nabłonku nosa podczas infekcji ludzkimi koronawirusami. Protokół ten umożliwia badanie interakcji ludzkiego koronawirusa z gospodarzem w mikrośrodowisku organoidowym, które ściśle odzwierciedla cechy nabłonka nosa in vivo, w tym jego heterogeniczną populację komórkową i funkcje śluzowo-rzęskowe. Technika ta może być stosowana do innych systemów hodowli ALI, takich jak te pochodzące z dolnych dróg oddechowych.

Dodatkowo system może być używany do naśladowania klinicznych stanów chorobowych, takich jak astma lub mukowiscydoza. Hoduj i różnicuj granicę faz powietrze-ciecz nosa lub kultury ALI w transwellach z komorą podstawową i wierzchołkową. Rozpręż zdysocjowane ludzkie komórki zatok przynosowych w stanie zanurzenia, po czym usuń pożywkę z komory wierzchołkowej, aby umożliwić różnicowanie kultur na granicy faz powietrze-ciecz.

W dniu poprzedzającym zakażenie należy przemyć kultury ALI wierzchołkowo solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS. W tym celu dodaj 200 mikrolitrów podgrzanego PBS do komory wierzchołkowej każdej transwell i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Zassać PBS i powtórzyć proces mycia dwukrotnie.

Następnie zastąp podłoże podstawowe 500 mikrolitrami świeżej pożywki na studzienkę i zrównoważ kulturę przez noc w zamierzonej temperaturze infekcji. Następnego dnia rozcieńczyć wirusa w DMEM bez surowicy, aby osiągnąć pożądaną wielokrotność infekcji w całkowitej objętości inokulum wynoszącej 50 mikrolitrów. Dodaj inokulum wirusowe wierzchołkowo do kultury i umieść je z powrotem w inkubatorze na jedną godzinę.

Co 15 minut podczas inkubacji delikatnie kołysz płytką do przodu i do tyłu, a także na boki, trzymając ją mocno obiema rękami, aby zapewnić równomierną adsorpcję inokulum wirusa. Po inkubacji należy odessać inokulum wirusa i zapewnić jego całkowite usunięcie, myjąc każdą zakażoną kulturę trzykrotnie PBS, jak opisano wcześniej. W razie potrzeby należy pobrać trzecie płukanie PBS, aby potwierdzić odpowiednie usunięcie wirusa wejściowego.

Wymieniaj podłoże podstawowe na zakażonych ALI co 72 godziny. W określonych punktach czasowych po infekcji dodaj 200 mikrolitrów PBS do komory wierzchołkowej każdego zakażonego transwella. Odpipetować PBS w górę i w dół pięć razy, aby zapewnić maksymalne pobranie wirusa z wierzchołka, i przenieść całą objętość do probówki mikrowirówkowej, aby zebrać wierzchołkową ciecz powierzchniową lub próbkę ASL.

Następnie należy seryjnie rozcieńczyć próbkę, aby określić ilościowo stężenie cząstek wirusa w ASL za pomocą standardowego testu płytki wirusowej. Jak pokazano na ekranie, wybierz typ komórki w zależności od ludzkiego koronawirusa lub HCoV, który jest miareczkowany. W razie potrzeby należy potwierdzić brak wirusa uwolnionego w postaci płytki nazębnej nierozcieńczonego podłoża podstawowego pobranego w różnych punktach czasowych po zakażeniu.

Aby zmierzyć TEER na donosowych posiewach ALI, wyczyść, zrównoważyć i wyzerować instrument EVOM zgodnie z instrukcjami producenta. Do wygaszenia należy użyć pustej osłony bez komórek nosowych i zapisać ślepą próbę. Aby przepłukać resztki podłoża podstawowego, przenieś każdą zakażoną pożywkę na wstępnie oznakowaną, czystą, 24-dołkową płytkę zawierającą 500 mikrolitrów PBS z wapniem i magnezem w każdym dołku.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów PBS zawierających wapń i magnez do komory wierzchołkowej każdego transwella. Dodaj jeden mililitr PBS zawierającego wapń i magnez do komory pomiarowej Endohm-6. Umieść każdy transwell w komorze pomiarowej Endohm-6 za pomocą kleszczy i zamknij komorę, zakładając pokrywę.

Upewnij się, że elektroda wierzchołkowa jest zanurzona w 200 mikrolitrach PBS w komorze wierzchołkowej. Elektroda podstawowa pozostaje na dnie komory. Gdy odczyt EVOM ustabilizuje się, zapisz surowy pomiar TEER.

Jeśli pożądane jest miareczkowanie, należy pobrać próbkę ASL po pomiarze TEER. Przelicz surowe odczyty TEER na końcowe pomiary w omach na centymetr do kwadratu, korzystając z równania pokazanego na ekranie. W przypadku koronawirusów ludzkich (HCoV) należy ocenić TEER w odstępach 24 lub 48 godzin po zakażeniu.

Upewnij się, że w każdym punkcie czasowym uwzględniono kontrolę ujemną. Do kontroli na podłożu lub w tle należy użyć PBS o takim samym składzie, jak ten, który został użyty do pobrania próbki ASL. W celu kontroli pozytywnej należy potraktować kontrolne kultury ALA wierzchołkowo 200 mikrolitrami 2% Triton X-100.

Po inkubacji przez 10 do 15 minut zebrać całą objętość jako próbkę uszczelniającą Triton, zgodnie z układem płytki składającym się z próbek kontrolnych Triton dodatnich, prób kontrolnych z imitacją tła, próbek kontrolnych PBS i próbek eksperymentalnych. Załaduj dehydrogenazę mleczanową lub płytkę LDH w trzech egzemplarzach. Na koniec oblicz procentową cytotoksyczność w stosunku do wartości uszczelnienia Triton, korzystając z wyświetlonego równania, Średnie miana wirusa wydalane wierzchołkowo z nosowych kultur ALI zakażonych czterema HCoV ujawniły, że każdy z wirusów replikował się produktywnie, chociaż SARS-CoV-2 i HCoV-229E replikowały się najbardziej efektywnie.

Wewnątrzkomórkowe i wierzchołkowo wysiewane miana wirusa MERS-CoV były w przybliżeniu takie same po 48 godzinach od infekcji lub HPI. Współbarwienie zakażonych kultur przeciwciałami specyficznymi dla antygenów wirusowych i markerami dla komórek rzęskowych lub kubkowych wykazało, że SARS-CoV-2 i HCoV-NL63 infekowały głównie komórki rzęskowe, ale MERS-CoV infekowały głównie nierzęskowe komórki kubkowe. Różnica w TEER od wartości początkowej do danego punktu czasowego po zakażeniu lub delta-TEER zarówno dla zakażeń SARS-CoV-2, jak i HCoV-NL63 była ujemna przy 192 HPI, w przeciwieństwie do infekcji MERS-CoV, która nie spowodowała istotnej zmiany TEER.

Ujemne wartości delta-TEER wskazują na uszkodzenie integralności bariery nabłonkowej. HCoV-229E spowodował dysfunkcję bariery nabłonkowej we wcześniejszym punkcie czasowym 96 HPI, ale powrócił do pozorowanych poziomów w późniejszym okresie infekcji. Ślady TEER przedstawiające surowe dane TEER dla każdej zakażonej transwelli w czasie pozwoliły na wizualizację trendów TEER w trakcie infekcji.

Kwantyfikacja wierzchołkowo uwalnianego LDH podczas infekcji wykazała, że SARS-CoV-2, HCoV-NL63 i HCoV-229E powodowały znaczną cytotoksyczność w posiewach nosowych, podczas gdy MERS-CoV nie. Kluczowe znaczenie ma zrozumienie kinetyki replikacji wirusa w posiewach nosowych, ponieważ określają one optymalne punkty czasowe dla innych dalszych analiz, takich jak cytotoksyczność i wrodzona indukcja immunologiczna. Pomiary TEER są najbardziej pouczające, jeśli są wykonywane sekwencyjnie na tych samych kulturach, zarówno przed zakażeniem, jak i następnie w różnych momentach po zakażeniu, w celu monitorowania zmian TEER w trakcie infekcji.

W naszych obecnych badaniach stosujemy metody sekwencjonowania RNA do opisanego systemu, aby zrozumieć zmiany transkrypcyjne podczas zakażeń koronawirusem u ludzi, a także techniki ELISA do pomiaru produkcji cytokin i innych białek.