Name: Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Naucz się izolować i hodować neurony przedsionkowe i spiralne zwoju zwojowego od noworodków myszy. Ta metoda patch-clamp umożliwia badanie kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźnikowych kluczowych dla słuchu i równowagi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Jing Bing Xue i Ruth Anne Eatock za ich wczesny wkład w te metody. Prace te były wspierane przez NIH NIDCD R03 DC012652 i NIH NIDCD DC012653S oraz R01 DC0155512 do RK i T32 DC009975 do DB, NN i KR.

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+diversity+and+the+organization+of+central+vestibular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways.</a> Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).</li>
<li>Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+set+spike+timing+regularity+of+mammalian+vestibular+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).</li>
<li>Smith, C. E., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stochastic+afterhyperpolarizaton+model+of+repetitive+activity+in+vestibular+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents.</a> Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).</li>
<li>Berglund, A. M., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+innervation+by+spiral+ganglion+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse.</a> The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).</li>
<li>Jagger, D. J., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+type+II+spiral+ganglion+neurones+identified+in+a+neonatal+rat+cochlear+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice.</a> Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).</li>
<li>Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+patterns+of+type+II+spiral+ganglion+neurons+in+vitro%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro).</a> The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).</li>
<li>Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv7-type+channel+currents+in+spiral+ganglion+neurons%3A+involvement+in+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).</li>
<li>Mo, Z. L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+firing+patterns+of+murine+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).</li>
<li>Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity%2C+ontogeny%2C+and+cAMP+modulation+of+the+hyperpolarization-activated+current+in+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+recordings+at+afferent+dendrites+contacting+cochlear+inner+hair+cells%3A+Monitoring+multivesicular+release+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2442(2010).</li>
<li>Bronson, D., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+acetylcholine+receptors+modulate+HCN+channel+properties+in+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+components+of+membrane+conductance+in+the+giant+axon+of+Loligo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo.</a> The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).</li>
<li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+sodium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+ganglion+17eurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons.</a> Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).</li>
<li>Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential+in+mammalian+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The action potential in mammalian central neurons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).</li>
<li>Izhikevich, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIzhikevich%2C+EM+%22Dynamical+Systems+in+Neuroscience%22">Dynamical Systems in Neuroscience</a>. , MIT Press. (2018).</li>
<li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+depolarization-activated+potassium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).</li>
<li>Risner, J. R., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+potassium+conductances+contribute+to+the+diverse+firing+properties+of+postnatal+mouse+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).</li>
<li>Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-voltage-activated+potassium+channels+underlie+the+regulation+of+intrinsic+firing+properties+of+rat+vestibular+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).</li>
<li>Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity%2C+expression+and+functional+role+of+the+sodium-activated+potassium+current+in+vestibular+ganglion+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons.</a> Neuroscience. 240, 163-175 (2013).</li>
<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+cation+channels%3A+From+genes+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function.</a> Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).</li>
<li>Davis, R. L., Crozier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+firing+properties+of+type+I+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+signaling+complex%3A+Regulation+of+type+I+spiral+ganglion+neuron+responses+in+the+auditory+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery.</a> Hearing Research. 336, 1-16 (2016).</li>
<li>Eatock, R. A., Christov, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEatock%2C+RA+%22Ionic+Conductances+of+Vestibular+Afferent+Neurons%3A+Shaping+Head+Motion+Signals+From+the+Inner+Ear%22">Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear</a>. , Elsevier. (2020).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+in+the+biophysical+properties+of+spiral-ganglion+and+vestibular-ganglion+neurons+in+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 710275(2021).</li>
<li>Armstrong, C. E., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+frog+saccular+hair+cells%3A+distortion+by+enzymatic+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).</li>
<li>Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+Kcnq4+in+vestibular+neurons+and+neurosensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia.</a> Brain Research. 1139, 117-125 (2007).</li>
<li>Meredith, F. L., Rennie, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+variations+in+K%2B+currents+in+vestibular+crista+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Cai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+activity+of+primary+auditory+neurons+in+the+presence+of+neurotrophins+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics.</a> Hearing Research. 350, 122-132 (2017).</li>
<li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+actions+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+on+firing+features+and+ion+channel+composition+of+murine+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).</li>
<li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li>
<li>Liu, X. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion%3A+NaV1.5%2C+NaV1.8%2C+and+tetrodotoxin-sensitive+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Przedstawione tutaj metody są specyficzne dla nagrań z izolowanych neuronów; Wcześniejsze badania koncentrowały się na nagraniach z terminali Axon w półnienaruszonym preparacie. W porównaniu z istniejącymi technikami nagrywania terminalowego, izolowane nagrania oferują lepsze zachowanie w zakresie zacisku przestrzennego i potencjału izo. Ponadto protokół ten zapewnia dostęp do szerszej próbki neuronów, ponieważ tylko subpopulacje zawierające kielich są dostępne w częściowo nienaruszonych nagraniach nabłonka przedsionkowe...

Dwubiegunowe neurony nerwu przedsionkowo-ślimakowego łączą czuciowe komórki rzęsate ucha wewnętrznego z pniem mózgu. Są głównymi nośnikami informacji o dźwięku i ruchach głowy; Uszkodzenie tych ważnych komórek prowadzi do głuchoty i zaburzeń równowagi. Przedsionkowa i słuchowa część nerwu składa się z odrębnych typów komórek, które są zróżnicowane morfologicznie i funkcjonalnie1,2. W układzie przedsionkowym dwie subpopulacje aferentne wystrzeliwują spontanicznie w regularnych lub nieregularnych odstępach czasu2. Uważa się, że czas aferentnego skoku odzwierciedla podstawową różnorodność w składzie kanałów jonowych3,4. W układzie słuchowym istnieją dwie główne subpopulacje neuronów zwojowych spiralnych (SGN); podczas gdy SGN typu I kontaktują się z pojedynczymi wewnętrznymi komórkami rzęsatymi5, SGN typu II kontaktują się z wieloma zewnętrznymi komórkami rzęsatymi5. Zapisy in vitro z kultur częściowo nienaruszonych i organotypowych sugerują różnice we właściwościach błon SGNs typu I i typu II6,7.
Wiele kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźników znajdujących się na końcach tych neuronów znajduje się również w ich ciałach komórkowych. W związku z tym hodowle izolowanych somatów przedsionkowych i spiralnych zwojów mogą być badane in vitro, aby zrozumieć, w jaki sposób kanały jonowe i receptory neuroprzekaźników przyczyniają się do odpowiedzi tych neuronów. Zwarta morfologia izolowanych ciał komórkowych pozwala na uzyskanie wysokiej jakości zapisów elektrycznych, odpowiednich do szczegółowej charakterystyki kanałów jonowych bramkowanych napięciem i receptorów neuroprzekaźników. Łatwy dostęp do reprezentatywnej różnorodności podtypów neuronów pozwala na wysokoprzepustową analizę różnorodności komórek.
Ten artykuł przedstawia metodę izolowania i hodowli zdysocjowanych komórek zwojowych z górnej części zwoju przedsionkowego u szczurów w dniu pourodzeniowym (P)9 do P20. Podano również sugestie dotyczące rozszerzenia tych metod na zwój spiralny, oprócz kroków wymaganych do pomyślnego wyodrębnienia, dysocjacji i posiewu komórek zwojowych. Metody te są ewolucją metod opracowanych w publikacjach z różnych laboratoriów8,9,10. W tym artykule zawarto również wskazówki dotyczące wyboru zdrowych komórek do zapisów patch-clamp.
Na koniec, protokół przedstawia procedurę nagrywania patch-clamp przy użyciu konfiguracji perforowanej-patch11. Chociaż konfiguracja z perforowaną łatą jest bardziej czasochłonna i bardziej wymagająca technicznie niż bardziej powszechna konfiguracja z pękniętą łatą, jest lepsza do utrzymania środowiska cytoplazmatycznego, które pozwala na długie i stabilne sesje nagraniowe. Korzyści płynące z tej konfiguracji zapisu są zilustrowane tutaj poprzez poprawioną stabilność prądów kationowych aktywowanych hiperpolaryzacją w nagraniach z perforowaną łatą w porównaniu z nagraniami z pękniętą łatą.
Ten protokół jest podzielony na pięć sekcji. Sekcje 1-3 opisują rozwiązania i narzędzia, które można przygotować i przechowywać z wyprzedzeniem. Sekcja 4 opisuje etapy preparowania i powlekania przedsionka i SGN. Sekcja 5 opisuje etapy zapisu z neuronów po okresie w hodowli. W naszych rękach sekcja 4 i sekcja 5 są wykonywane przez okres 2 kolejnych dni.

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4888-100MG</td><td>Do perforowanych nagrań łatek.</td></tr><tr><td>ATP dis-sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>Dodatek do roztworu wewnętrznego</td></tr><tr><td>B27 Suplement (50x), bez surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>dodatek do pożywki hodowlanej, do</td></tr><tr><td>zlewek SGN (1000, 100, 10) mililitrowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wirówka stołowa</td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Palnik</td><td></td><td></td><td></td> Bunsena</tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td>Dodatek do roztworu wewnętrznego</td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5318</td><td>jeden z trzech enzymów do trawienia tkanek</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe, prostokątne, grubość #1, 22x40&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0707</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biotium</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza I, z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>jeden z trzech enzymów do trawienia tkanek</td></tr><tr><td>Dumont #3 Kleszcze ()</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze (Fine)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Kleszcze ( Fine)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>Dodatek do roztworu wewnętrznego</td></tr><tr><td>Ściągacz elektrod</td><td>Narashige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Epi-illumination źródło światła&nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>CL 1500 ECO</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>do czyszczenia głowicy i wokół stołu sekcyjnego</td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemianowe z włókna do elektrod</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF140-117-10</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze preparacyjne o drobnych krawędziach</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>do wyciągania pipet trójnikowych</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td>dodatek do podłoża</td></tr><tr><td>hodowlanego HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>do buforowania pH wszystkich roztworów w protokole</td></tr><tr><td>Mieszadła z płytą grzejną / magnetyczne&nbsp;</td><td>VWR</td><td>76549-914</td><td></td></tr><tr><td>Izolowane wiadro wypełnione lodem</td><td></td><td></td><td>, aby wszystkie próbki i roztwory były chłodne</td></tr><tr><td>K2SO4, siarczan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9458-250G</td><td>Dodatek do roztworu wewnętrznego</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P93333</td><td>Dodatek do roztworu wewnętrznego</td></tr><tr><td>KOH (1 M)</td><td>Honeywell</td><td>319376-500ML</td><td>Aby doprowadzić wewnętrzne rozwiązanie do pożądane pH.</td></tr><tr><td>Duże nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>14133-13</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz medium&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td>roztwory do preparacji i kąpieli&nbsp;</td></tr><tr><td>Niskoprofilowa komora rejestracyjna kąpielowa do naczyń hodowlanych</td> Strzykawki <td>Luer-lok Warner Instruments</td><td>64-0236</td><td></td></tr><tr><td>, 30 ml</td><td>302832 BD</td><td></td><td>do pobierania roztworu L-15/HEPES/HEPES.</td></tr><tr><td>MEM + Glutamax Suplement</td><td>Fisher Scientific</td><td>41-090-101</td><td>baza pożywki</td></tr><tr><td>hodowlanej MgCl2-Hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Dodatek do roztworu wewnętrznego</td></tr><tr><td>Igła microFil do napełniania mikropipet - 34 gauge&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narashige</td><td>MF-90</td><td>Do polerowania elektrod.</td></tr><tr><td>Suplement N2 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>dodatek do pożywki hodowlanej, do SGN</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Dodatek do roztworu wewnętrznego</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>Thomas Scientific</td><td>319511-500ML</td><td>do miareczkowania</td></tr><tr><td>Osmometr</td> pH <td>Advanced Instruments Inc.</td><td>3320</td><td></td></tr><tr><td>Tlen, klasy medycznej, z odpowiednim regulatorem i rurką</td><td>USC Material Management</td><td>MEDOX200 (Identyfikator: 00015)</td><td>do rozpuszczania w roztworach preparacyjnych i kąpielowych</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Żarówka do pipet Pasteura (3 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td>do pipet do pipet do trituracji</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td> dodatek <td>15140122</td><td>zapobiegający zanieczyszczeniu pożywki hodowlanej</td></tr>, <tr><td>roztwór do eutanazji na bazie pentobarbitalu (np. Fatal Plus. 50 &ndash; 60 mg/kg dawkowania)&nbsp;</td><td>MWI Animal Health</td><td>15199</td><td>do eutanazji</td></tr><tr><td>Filtry membranowe PES ,&nbsp; 0,2 mikrometra&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>566-0020</td><td>do roztworów filtrujących</td></tr><tr><td>Sterylne filtry strzykawkowe z membraną PES, 0,22 um, 30 mm&nbsp;</td><td>CELLTREAT</td><td>229747</td><td>do filtrowania roztworów pobieranych do strzykawek</td></tr> szalki <tr><td>Petriego, 35 x 10 mm</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-103</td><td>do mikropreparacji i do przechowywania Końcówka roztworu do zanurzania w konfiguracji z perforowaną łatą</td></tr><tr><td>Szalki Petriego, 60 x 15 mm</td><td>Midland Scientific</td><td>P7455</td><td>do rozwarstwienia</td></tr><tr><td>ogólnego pH-metr</td><td>Mettler Toledo</td><td>Model S20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetory (1000, 200, 10) mikrolitr</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane ze szklanym dnem pokrytym poli-d-lizyną</td><td>Mattek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>do płytki neuronów do hodowli</td></tr><tr><td>Platforma szybkiej wymiany, podgrzewana podstawa, do naczyń hodowlanych 35 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>Reference</td><td>Cell World Precision Instruments</td><td>RC1T</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Miltex</td><td>4-315</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Waga naukowa Pipety</td> serologiczne <td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>(10, 25) mililitrów</td><td>Zestaw</td> smarów silikonowych Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>(do uszczelniania szkła nakrywkowego i komory)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0378</td><td></td></tr><tr><td>Gilotyna do małych zwierząt</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>Gilotyna dla małych zwierząt</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td>do dekapitacji w przypadku preparacji szczurów starszych niż P15.</td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop preparacyjny&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Proste nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (3, 10, 30) mililitrów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td>jeden z trzech enzymów do trawienia tkanek</td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881500105</td><td>do dostarczania roztworu eutanazyjnego przez wstrzyknięcie dootrzewnowe</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas, 2,5 mm Krawędź tnąca</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Kolba miarowa, 1000 mililitrów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>945300</td><td></td></tr><tr><td>Woda, sterylna u ltrapure, R>18,18 megaOhm cm (np. przefiltrowana przez oczyszczanie wody Millipore-Sigma system)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CDUFBI001</td><td></td></tr></tbody></table>

izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

Zwarta morfologia izolowanych i hodowanych neuronów zwojowych ucha wewnętrznego pozwala na szczegółową charakterystykę kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźników, które przyczyniają się do różnorodności komórek w tej populacji. Protokół ten określa kroki niezbędne do pomyślnego wypreparowania, dysocjacji i krótkoterminowego wyhodowania somatów neuronów dwubiegunowych ucha wewnętrznego w celu nagrań typu patch-clamp. Szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania neuronów zwoju przedsionkowego są dostarczane z niezbędnymi modyfikacjami potrzebnymi do poszycia neuronów zwojowych spiralnych. Protokół zawiera instrukcje dotyczące wykonywania nagrań z użyciem zacisku krosowego całej komórki w konfiguracji z perforowaną łatą. Przykładowe wyniki charakteryzujące zapisy cęgów napięciowych cyklicznych prądów bramkowanych nukleotydami aktywowanymi hiperpolaryzacją (HCN) podkreślają stabilność konfiguracji zapisu z perforowaną łatą w porównaniu z bardziej standardową konfiguracją z pękniętą łatą. Połączenie tych metod, izolowanych somatów i nagrań z perforowanym zaciskiem, może być wykorzystane do badania procesów komórkowych, które wymagają długich, stabilnych zapisów i zachowania środowiska wewnątrzkomórkowego, takiego jak sygnalizacja przez receptory sprzężone z białkiem G.

Przeprowadzenie protokołów zaciskowych napięcia (voltage-clamp) poprzez zastosowanie serii skoków napięcia pozwala ujawnić zależną od napięcia aktywację różnych rodzin prądów. Reprezentatywne przykłady prądów całokomórkowych wywołanych w VGN i zaadaptowane z opublikowanych pomiarów13 przedstawiono na Ryc. 1A,B. Zastosowanie napięć depolaryzujących (Ryc. 1B) aktywuje prąd wewnątrzkomórkowy (przyjęty jako ujemny), który akt...

Przedstawione tutaj są metody dostarczające szczegółowych instrukcji do preparowania, dysocjacji, hodowli i rejestracji patch-clamp z neuronów zwojów przedsionkowych i spiralnych ucha wewnętrznego.

Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Wiele kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźników, które znajdują się na końcach neuronów słuchowych i przedsionkowych, znajduje się również w ich ciałach komórkowych. Hodowle izolowanych ciał komórkowych można badać in vitro, aby zrozumieć, w jaki sposób te kanały jonowe i receptory wpływają na odpowiedzi neuronów. Zwarta morfologia ciał komórkowych pozwala na uzyskanie wysokiej jakości zapisów elektrycznych w celu scharakteryzowania zależnych od napięcia właściwości kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźników.Co więcej, łatwy dostęp do szerokiej gamy typów komórek pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości dzięki fizycznej analizie różnorodności komórek. Procedury zostaną zademonstrowane przez doktorantkę Katherine Regalado wraz ze stypendystami podoktoranckimi, dr Danielem Bronsonem i Nathanielem Nowakiem z mojego laboratorium. Na początek przyłóż szklaną pipetę pastwiskową do płomienia palnika Bunsena, aby przygotować pipety tritracyjne do dysocjacji komórek.Gdy szklana końcówka zacznie się topić, rozciągnij szklankę do żądanej średnicy końcówki. Odciągnij jeden koniec pipety od płomienia, aby utworzyć małe zagięcie. Umieść wygiętą pipetę pod mikroskopem.Za pomocą pły

isolating-culturing-vestibular-spiral-ganglion-somata-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje proces izolowania eksplantatów spiralnych zwojów z ucha wewnętrznego i ich wspólnej hodowli z organem Cortiego na matrycy wieloelektrodowej. Spiralne zwoje są ostrożnie ekstrahowane i dzielone na mniejsze skrawki tkanek lub eksplantaty. Te eksplantaty są hodowane w obszarze aktywnym matrycy wieloelektrodowej, aby promować wzrost procesów neuronalnych.

Hodowla eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych

Ten film prezentuje metodę izolowania neuronów przedsionkowych od wewnętrznego ucha szczeniaka myszy. Skrupulatnie przedstawia etapy związane z preparacją ucha wewnętrznego, pobraniem zwoju przedsionkowego, a następnie dysocjacją zwoju na pojedyncze komórki. Komórki te są następnie hodowane na szalkach ze szklanym dnem w celu ustanowienia hodowli neuronów przedsionkowych.

Izolowanie neuronów zwoju przedsionkowego od ucha wewnętrznego myszy

Ten film demonstruje technikę całokomórkowego patch-clamp do elektrofizjologicznego zapisu z płaskiej siatkówki myszy. Cienka szklana pipeta z elektrodą służy do zbliżania się do gwiazdotwórczych komórek amakrynowych (SAC) w siatkówce. Po uformowaniu uszczelki stosuje się ssanie w celu pęknięcia membrany i utworzenia konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. Na koniec mierzy się przepływ jonów przez receptory synaptyczne SAC za pomocą konfiguracji.

Ustanawianie opaski krosowej całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z siatkówki myszy z płaskim mocowaniem

Ten film demonstruje technikę patch-clamp do pomiaru prądów jonowych w ciałach komórek neuronów czuciowych ucha wewnętrznego. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie i użycie polerowanej pipety z zaciskiem krosowym wypełnionej wewnętrznym roztworem zawierającym amfoterycynę B, która perforuje błonę, aby umożliwić ruch jonów przy jednoczesnym zachowaniu warunków wewnątrzkomórkowych. Impulsy napięciowe są stosowane do wyzwalania i rejestrowania aktywności kanałów jonowych, zapewniając wgląd w ich...

Perforowane nagrania patch-clamp ciał komórek neuronów czuciowych ucha wewnętrznego

Stymulacja nerwów w podczerwieni została zaproponowana jako alternatywa dla stymulacji elektrycznej w wielu typach nerwów, w tym związanych z układem słuchowym. Protokół ten opisuje metodę patch clamp do badania mechanizmu stymulacji nerwów w podczerwieni w kulturze pierwotnych neuronów słuchowych.

Klamra krosowa całej komórki do badania mechanizmów stymulacji neuronalnej w podczerwieni

Analiza funkcji przedsionkowych komórek rzęsatych jest skomplikowana przez ich lokalizację głęboko w najtwardszej części czaszki, kości skroniowej skalistej. W większości badań nad funkcjonalnymi komórkami rzęsatymi wykorzystano dokładnie izolowane komórki rzęsate. W tym artykule opisano częściowo nienaruszony preparat nabłonka przedsionkowego myszy do badań elektrofizjologicznych i mikroskopii dwufotonowej.

Izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować nienaruszone zwoje korzenia grzbietowego do nagrań z zaciskiem łatowym. Preparat ten utrzymuje mikrośrodowisko dla neuronów i satelitarnych komórek glejowych, unikając w ten sposób zmian fenotypowych i funkcjonalnych obserwowanych przy użyciu zdysocjowanych neuronów DRG.

Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Przedstawiamy tutaj protokół izolacji, oczyszczania i hodowli pierwotnych komórek marginalnych z myszy stria vascularis oraz do tworzenia in vitro modeli stresu oksydacyjnego i starzenia komórkowego w celu badania zaburzeń ściany bocznej ślimaka.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy

We present a new dissection method to extract the vestibular ganglion and all five vestibular organs (utricle, saccule, and three cristae: lateral/horizontal, anterior, and posterior) as one whole-mount vestibular complex. Confocal imaging allows visualization of vestibular neuron cell bodies for quantification, as well as neuronal projections to the sensory...

Whole-Mount Dissection of the Vestibular Complex and Quantification of Vestibular Ganglion Neurons in Mice

Naucz się izolować i hodować neurony przedsionkowe i spiralne zwoju zwojowego od noworodków myszy. Ta metoda patch-clamp umożliwia badanie kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźnikowych kluczowych dla słuchu i równowagi.

Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

Przeglądaj więcej filmów