Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

Wiele kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźników, które znajdują się na końcach neuronów słuchowych i przedsionkowych, znajduje się również w ich ciałach komórkowych. Hodowle izolowanych ciał komórkowych można badać in vitro, aby zrozumieć, w jaki sposób te kanały jonowe i receptory wpływają na odpowiedzi neuronów. Zwarta morfologia ciał komórkowych pozwala na uzyskanie wysokiej jakości zapisów elektrycznych w celu scharakteryzowania zależnych od napięcia właściwości kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźników.

Co więcej, łatwy dostęp do szerokiej gamy typów komórek pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości dzięki fizycznej analizie różnorodności komórek. Procedury zostaną zademonstrowane przez doktorantkę Katherine Regalado wraz ze stypendystami podoktoranckimi, dr Danielem Bronsonem i Nathanielem Nowakiem z mojego laboratorium. Na początek przyłóż szklaną pipetę pastwiskową do płomienia palnika Bunsena, aby przygotować pipety tritracyjne do dysocjacji komórek.

Gdy szklana końcówka zacznie się topić, rozciągnij szklankę do żądanej średnicy końcówki. Odciągnij jeden koniec pipety od płomienia, aby utworzyć małe zagięcie. Umieść wygiętą pipetę pod mikroskopem.

Za pomocą płytki punktacji naciąć i rozbić szklankę o żądanej średnicy. Przełóż końcówkę pipety nad górną częścią płomienia palnika. Spowoduje to szybkie wypolerowanie szorstkich krawędzi w pobliżu końcówki.

Wyjmij mózg uśpionej myszy za pomocą zamkniętych nożyczek chirurgicznych. Przeciąć i usunąć nerw czaszkowy, aby całkowicie odłączyć mózg od czaszki. Zaczynając od tyłu głowy, ściągnij przezroczysty błoniasty materiał kleszczami, a następnie odetnij górną część czaszki za pomocą nożyczek chirurgicznych.

Usuń nadmiar tkanki z tyłu głowy i szyi, aby obszar sekcji i kapsułka otic były czystsze i łatwiej dostępne. Przenieść tkankę na drugą szalkę Petriego ze świeżym roztworem L-15. Następnie zlokalizuj torebkę uszną i nerwy słuchowe, górne, przedsionkowe i przedsionkowe dolne.

Oddziel górne i dolne zwoje za pomocą małych nożyczek sprężynowych i odetnij nerw słuchowy. Za pomocą skalpela delikatnie ogol kostny grzbiet, aby osłabić obszar kostny, pod którym nerw zanurza się w kostnej torebce. Ostrożnie usuń zanieczyszczenia skalpelem, odsłaniając całą spuchniętą część ganglionu.

Użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby przeciąć i oddzielić ganglion od gałęzi nerwu obwodowego, która nurkuje w kierunku łagiewki. Usuń górny ganglion za pomocą drobnych kleszczy i przenieś go na 35-milimetrową szalkę Petriego ze świeżym roztworem L-15. Po wstępnym podgrzaniu roztworu enzymatycznego wlej mieszaninę enzymów na 35-milimetrową szalkę Petriego i umieść ją w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut.

Oczyść ganglion za pomocą cienkich kleszczy i małych nożyczek sprężynowych, usuwając kość, nadmiar tkanki, włókna nerwowe i wszelkie inne zbędne struktury. Uważaj, aby zminimalizować usunięcie tkanki zwojowej. Przenieś oczyszczone zwoje jaj do podgrzanego roztworu enzymu i umieść go z powrotem w inkubatorze na 10 do 40 minut.

Następnie przenieś zwoje na 35-milimetrową szalkę Petriego ze świeżym roztworem L-15. Po dwóch do trzech minutach przenieś zwoje na inną 35-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną przefiltrowaną pożywką hodowlaną. Przenieś około 150 mikrolitrów przefiltrowanej pożywki hodowlanej na naczynie z powlekanym szklanym dnem.

Następnie przenieś żądaną liczbę zwojów na szkiełko nakrywkowe. Pobrać niewielką ilość pożywki hodowlanej z naczynia hodowlanego i przepłukać pipetę tritracyjną pożywką, aby zapobiec przywieraniu tkanki do boków szklanej pipety. Delikatnie i wielokrotnie przepuszczać tkankę przez pipetę, aż zwoje zostaną wystarczająco zdysocjowane.

Po pięciu minutach sprawdź pod mikroskopem świetlnym, czy komórki osiadły na szkiełku nakrywkowym. Ostrożnie umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 12 do 24 godzin. Następnie zlokalizuj torebkę uszną po przecięciu głowy na pół i wyjmij ją z czaszki, odłupując krawędzie za pomocą kleszczy.

W spiralnej części torebki usznej znajduje się ślimak z narządem Cortiego. Odłup kość, nakładając się na zwoje ślimaka za pomocą cienkich kleszczy równoległych do krzywizny kości. Użyj małych nożyczek sprężynowych, aby odciąć modiolus u podstawy ślimaka, aby uwolnić go od reszty torebki usznej.

Pokrój narząd Cortiego na dwa lub trzy zwoje za pomocą małych nożyczek sprężynowych, tak aby leżał płasko, i wycinaj modiolus z każdego obrotu. Usuń rozstęp naczyniowy, ściskając prążek u podstawy drobnymi kleszczami. Rozwiń się wokół spirali i aż do wierzchołka, aby uwolnić ją od narządu Cortiego.

Usuń spiralny ganglion, przecinając krawędź miejsca, w którym włókna neuronalne spiralnego zwoju wystają w kierunku komórek rzęsatych, a następnie wyczyść ganglion, jak pokazano wcześniej. Po enzymatycznym potraktowaniu zwoju spiralnego, należy go roztroszyć w pożywce hodowlanej uzupełnionej N2 i B27. Umieść naczynie hodowlane zawierające zdysocjowane zwoje w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 12 do 24 godzin.

Zanurz końcówkę pipety w czystym roztworze naczynia hodowlanego, aby napełnić go czystym roztworem, który nie zawiera amfoterycyny. Napełnić tylną część pipety roztworem wewnętrznym zawierającym amfoterycynę. Zanurz końcówkę pipety z powrotem w czystym roztworze szalki hodowlanej, podczas gdy amfoterycyna powoli wchodzi do końcówki z tyłu pipety.

Następnie zakończ napełnianie pipety roztworem amfoterycyny w ilości do dwóch trzecich pipety. Opuść pipetę do wanny komory nagrywającej i umieść końcówkę pipety pośrodku pola widzenia. Upewnij się, że końcówka jest wolna od pęcherzyków powietrza lub innych zanieczyszczeń.

Umieść pipetę blisko membrany i mocno wyląduj na środku ogniwa. Zastosować podciśnienie lub ssanie za pomocą strzykawki lub pipety doustnej. Włącz potencjał utrzymywania minus 60 miliwoltów.

Rezystancja uszczelnienia powinna wzrastać, aż przekroczy giga omów. Gdy utworzy się uszczelka giga omów, zwolnij podciśnienie. Zanim tyrozyna zacznie działać, rezystancja wejściowa powoli maleje, a prąd płynący w odpowiedzi na pięciomiliwoltowy krok napięcia stopniowo wzrasta, gdy amfoterycyna dostaje się do membrany.

Reprezentatywne przykłady prądów całych komórek wywoływanych przez neuron zwojowy przedsionkowy pokazano na tym rysunku. Prądy sodowe netto dopływu są tutaj identyfikowane na podstawie ich przejściowej aktywacji i dezaktywacji. Prądy netto na zewnątrz są przenoszone głównie przez jony potasu i mają znacznie wolniejszą kinetykę aktywacji i inaktywacji niż prądy sodowe.

Aktywowane hiperpolaryzacją cykliczne prądy bramkowane nukleotydami lub prądy HCN są aktywowane przez rodzinę długotrwałych napięć hiperpolaryzacyjnych. Stabilność charakterystyki kanału jonowego w perforowanej łacie w różnych punktach czasowych podczas nagrywania pokazano na tym rysunku. Zależne od napięcia krzywe aktywacji prądów HCN zmierzono w konfiguracji perforowanej łaty.

Krzywa ma kształt sigmoidalny i była stabilna przez całe długie nagranie. Względna niestabilność trybu pękniętej łaty jest zilustrowana przez nienakładające się na siebie krzywe sigmoidalne z różnych punktów czasowych. Poniżej przedstawiono krzywe aktywacji prądów HCN podczas konfiguracji z pękniętą łatą.

Pokazano tutaj wzorce wypalania w pięciu zwojach przedsionkowych somara, pięciu neuronach zwoju spiralnego i odpowiadające im bieżące kroki. Ta niejednorodność wzorców wypalania odzwierciedla fundamentalną różnorodność w składzie leżących poniżej kanałów sodowych i potasowych zarówno w neuronach przedsionkowych, jak i neuronach zwojów spiralnych. Aby zmaksymalizować przeżycie komórek podczas tej procedury, unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza, nie przepracowuj tkanki i pozwól komórkom osiąść przed umieszczeniem próbek w inkubatorze.

Perforowany zacisk krosowy umożliwia badanie kanałów jonowych, które są modulowane przez cytozolowe drugie przekaźniki, co ma kluczowe znaczenie dla badania wpływu eferentnych neuroprzekaźników na neurony zwojowe. Nagrania tych dwubiegunowych neuronów odegrały zasadniczą rolę w ujawnieniu, w jaki sposób różnorodność biofizyczna przyczynia się do różnorodności funkcjonalnej neuronów czuciowych.