Wizualizacja metabolitów zidentyfikowanych w metabolomie przestrzennym tradycyjnej medycyny chińskiej przy użyciu DESI-MSI

W tym artykule opisano głównie opłacalną metodę przygotowania próbek roślinnych i obrazowania przy użyciu DESI-MSI, a także może przezwyciężyć wady związane z suchymi tkankami, które łatwo pękają po wdmuchiwaniu azotu. Korzeń poddano kriosekcji na mikrotomie kriostatu, natomiast liść przygotowano metodą wdrukowywania, co wymaga kosztownej maszyny lub powoduje utratę intensywności sygnału. Nasza metoda może przezwyciężyć te ograniczenia.

Metoda ta może być stosowana w metabolomice przestrzennej roślin, takiej jak dystrybucja i przemieszczanie się toksyn w roślinach pod wpływem stresu abiotycznego i biotycznego. Na początek weź oczyszczone korzenie i liście z dwuletniej rośliny szałwii miltiorrhiza i bezpośrednio pokrój w przekrój o grubości około trzech do pięciu milimetrów. Następnie przyklej próbkę do szkiełka mikroskopowego z adhezją za pomocą taśmy dwustronnej.

Umieść kolejne szkiełko mikroskopowe nad próbką i owiń je folią uszczelniającą jak kanapkę. Następnie zamroź próbkę kanapki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny, a następnie poddaj ją działaniu próżni powietrznej przez dwie godziny w temperaturze uwięzionej od minus 75 do minus 82 stopni Celsjusza i wakuometrze w temperaturze od 2,5 do 3,7 paskala. W celu analizy, po wyjęciu próbek z chłodni, należy doprowadzić je do temperatury pokojowej w eksykatorze, aby uniknąć kondensacji na powierzchni próbki przed poddaniem próbki aplikacji matrycowej.

Zaimplementuj konfigurację detektora przyrządów i kalibrację masy w trybie jonizacji elektronrozpylającej lub ESI. Przeprowadzić konfigurację detektora przy użyciu leucyny i cefaliny w acetonitrylu w wodzie w stosunku jeden do jednego i przeprowadzić kalibrację masy za pomocą mrówczanu sodu i izopropanolu wodnego w stosunku jeden do jednego. Wyjmij źródło ESI i zamontuj jednostkę DESI na spektrometrze masowym.

Podłącz dopływ azotu gazowego do jednostki DESI i dostosuj ciśnienie gazu do około 0,5 megapaskala. Napełnij pięciomililitrową strzykawkę leucyną i cefaliną oraz kwasem mrówkowym w metanolu wodnym w stosunku od jednego do dziewięciu i podłącz strzykawkę do wysokowydajnej pompy strzykawkowej, aby zapewnić rozpuszczalnik do jonizacji substancji chemicznych w próbce. Następnie przymocuj kapilarnę dostarczającą rozpuszczalnik do strzykawki i rozpylacza DESI.

Rozpuszczalnik zapewniający kapilatę to standardowa kapilara o wymiarach o średnicy wewnętrznej 75 mikrometrów i średnicy zewnętrznej 375 mikrometrów. Uruchom pompę strzykawkową i ustaw szybkość zaparzania na dwa mikrolitry na minutę, aby uzyskać stały przepływ i rozpylenie rozpuszczalnika. Zakręć zawór azotu gazowego, a następnie włącz go po około 15 sekundach.

Niewielka kropla rozpuszczalnika wydmuchuje się na scenę i można zobaczyć rozpylenie, jeśli przepływ rozpuszczalnika jest w stanie stałym. Następnie dostosuj położenie opryskiwacza pod względem kąta natrysku, osi XYZ, występu i wysokości. Użyj czerwonych i czarnych znaczników jako odniesień, aby zoptymalizować sygnał spektrometrii mas, aby uzyskać intensywność sygnału około 1 razy 10 do piątej w trybie czułości.

Ponieważ występ opryskiwacza jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na intensywność sygnału, wyreguluj występ, zmieniając osłonę gazową azotu za pomocą klucza o średnicy pięciu milimetrów. Kierunek natrysku wpływa na jakość obrazu bryłowego. Dlatego obracaj opryskiwacz, aż strumień będzie prosty.

Po wykonaniu wszystkich tych kroków konfiguracja jest gotowa do eksperymentów i zwykle jest stabilna przez około trzy tygodnie użyteczności po wstępnej konfiguracji. W przypadku obrazowania DESI-MS nie jest wymagana wstępna obróbka próbki. Jeśli to możliwe, usuń jednak nadmiar nośnika ze szkiełek.

Zrób zdjęcie próbki na szkiełku. Nie dotykając powierzchni próbki, aby uniknąć jakichkolwiek zanieczyszczeń, umieść szkiełko w pozycji płytki na stoliku DESI, który ma dwie pozycje płytki, A i B. Użyj standardowych szkiełek lub pełnego szkiełka, aby dopasować się do pozycji. Pełna zjeżdżalnia może pomieścić do czterech slajdów, a tym samym ma znacznie większą powierzchnię do eksperymentów.

Otwórz oprogramowanie do masowego przetwarzania obrazów w wysokiej rozdzielczości. Ustaw nową blachę na karcie Pozyskanie i wybierz odpowiednią pozycję blachy, A lub B, oraz typ blachy. Na stronie Wybór obrazu zaznacz cztery rogi slajdu, a następnie obraz zostanie automatycznie dostosowany do prawidłowej orientacji.

Aby ustawić parametry MS, wybierz typ eksperymentu jako tryb DESI-MS, który jest powszechnie używany, w którym zostanie wykryty tylko jon macierzysty. Następnie wybierz polaryzację jako dodatnią lub ujemną, ponieważ instrument może używać tylko jednej polaryzacji w eksperymencie. Następnie zastosuj tryb czułości, aby uzyskać więcej informacji na temat chemikaliów w małych ilościach.

Następnie narysuj prostokąt, aby zdefiniować obszar skanowania na karcie Wzór i ustaw rozmiar piksela, zachowując równe rozmiary X i Y piksela. Ustaw szybkość skanowania na nie więcej niż pięciokrotność rozmiaru piksela. Zapisz projekt i wyeksportuj arkusz roboczy dla oprogramowania do akwizycji MS.

Następnie zaimportuj arkusz roboczy do oprogramowania do akwizycji MS i zapisz go jako nową listę próbek. Naciśnij przycisk Start Uruchom, aby rozpocząć skanowanie obrazów MS, a do kolejki eksperymentów można dodać wiele obrazów, importując więcej arkuszy. Załaduj plik danych próbki do oprogramowania do masowego przetwarzania obrazu i ustaw parametry przetwarzania obrazu DESI.

Ponieważ leucyna i cefalina zostały użyte do wewnętrznej masy zamka, a masa zamka jest jedynym punktem do określenia polaryzacji eksperymentu, ważne jest, aby ustawić prawidłową masę zamka. Ustaw 556.2772 dla trybu dodatniego i 554.2620 dla trybu ujemnego. Aby utworzyć listę docelowych substancji chemicznych, należy załadować przetworzony plik danych w celu wizualizacji obrazu DESI próbki.

Kliknij przycisk Normalizacja, aby znormalizować dane za pomocą całkowitej chromatografii jonowej, aby uzyskać względną intensywność określonej substancji chemicznej do odniesienia, a następnie można porównać ze sobą różne próbki. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) i skopiuj kilka kopii na przykładowym obrazie. Następnie wybierz wszystkie ROI i wyeksportuj analizę wielowymiarową, aby wyodrębnić informacje MS ze wszystkich ROI.

Obrazowanie metodą spektrometrii mas korzenia i całych odcinków liści pokazuje rozkład przestrzenny wybranych związków. Kolor każdego pojedynczego piksela reprezentuje względną intensywność stosunku masy do ładunku, a zatem może być powiązany z naturalnym rozkładem i obfitością jonów metabolitowych w próbce. Rozmieszczenie docelowych związków, tanszynonu IIA i kwasu rozmarynowego, jest widoczne w różnych obszarach korzenia.

Związek tanshinol A został wykryty w sekcjach liści Jako protokół mający na celu odtwarzalność, najważniejszą rzeczą jest optymalizacja intensywności sygnału poprzez dostosowanie położenia opryskiwacza w kilku wymiarach.