Name: Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę hodowli organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenia monowarstw komórkowych. Protokół umożliwia badanie transportu składników odżywczych, funkcji bariery i interakcji z mikroorganizmami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Institut Carnot France Futur Elevage (projekt "OrganoPig") oraz przez INRAE HOLOFLUX (projekt "Holopig"). Autorzy są wdzięczni obiektom Genotoul Core Facilities (TRI). Dziękujemy Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Tuluza) za staranną korektę.

<ol><li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465(2013).</li>
<li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368(2021).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+intestinal+enteroids%3A+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682(2019).</li>
<li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375(2020).</li>
<li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li>
<li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031(2022).</li>
<li>Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance%2C+intestinal+development%2C+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li>
<li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li>
<li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li>
<li>Tsai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li>
<li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+porcine+intestinal+organoids%3A+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li>
<li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li>
<li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced%2C+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li>
<li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143(2021).</li>
<li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94(2021).</li>
<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821(2020).</li>
<li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1%2C2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011(2020).</li>
<li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease%2C+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Stem+Cells%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li>
<li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196(2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394(2019).</li>
<li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430(2019).</li>
<li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje metodę stosowaną do kriokonserwacji krypt nabłonkowych z jelita prosiąt w celu długotrwałego przechowywania, a następnie hodowli organoidów 3D. W protokole tym wykorzystuje się roztwór zamrażający zawierający DMSO, FBS, inhibitor Y27632 ROCK, DMEM i antybiotyki. W innym badaniu na świniach uzyskano organoidy z krypt kriokonserwowanych w podobnym roztworze do zamrażania, ale bez inhibitora ROCK15. Inhibitor Y27632 ROCK został włączony w celu zapobiegania apoptozie i utrzymania puli komórek macierzystych, ponieważ po rozmrożeniu komórki krypty nabłonka ulegają dysocjacji, co może prowadzić do śmierci komórki ("anoikis")27,28. Co ciekawe, enteroidy koni uzyskano z krypt nabłonkowych zamrożonych w pożywce hodowlanej zawierającej tylko DMEM i DMSO16; Ta prosta metoda nie została jeszcze przetestowana pod kątem krypt nabłonka świń. Opublikowano inne metody hodowli organoidów ludzkich i świń z zamrożonych tkanek lub biopsji zamiast krypt nabłonkowych 4,17. Zaletą tej metody jest możliwość bezpośredniej kriokonserwacji tkanek jelitowych bez konieczności wykonywania procedury izolacji krypty, która wymaga czasu i sprzętu laboratoryjnego. Może to być wygodne, gdy tkanki muszą być pobierane z dala od laboratorium. Jednak w przypadku izolowania krypt bezpośrednio po uboju, duże segmenty jelita mogą być przetwarzane w celu uzyskania bardzo dużej liczby krypt, co nie ma miejsca w przypadku rozpoczynania od małych zamrożonych fragmentów tkanek. Po rozmrożeniu krypt nabłonkowych organoidy obserwowano od 3-4 dni po wysiewie i pękały po 10 dniach. Jest to wolniejsze tempo wzrostu niż w przypadku rozpoczynania hodowli ze świeżych krypt nabłonkowych, dla których organoidy uzyskano od 1 dnia po wysiewie i zwykle można je podzielić około 5 dnia11. Khalil i in. stwierdzili również opóźniony wzrost enteroidów świń podczas rozpoczynania od zamrożonych krypt15, co sugeruje, że komórki macierzyste mogą potrzebować czasu, aby odzyskać swoją zdolność proliferacyjną. Uzyskaliśmy również mniejszą liczbę organoidów, zaczynając od zamrożonych krypt w porównaniu ze świeżymi kryptami, co może być spowodowane śmiercią komórek macierzystych podczas procesu zamrażania. W niektórych próbach rozmrażania krypt (<20%) nie uzyskano organoidów z zamrożonych krypt, prawdopodobnie z powodu nieoptymalnej procedury kriokonserwacji (np. opóźnione zamrażanie po izolacji krypt prawdopodobnie powyżej 1 godziny). Dlatego zalecamy trzymanie krypt na lodzie do czasu liczenia i zamrażanie ich tak szybko, jak to możliwe.
W przypadku organoidów 3D zdecydowaliśmy się użyć komercyjnej pożywki do hodowli organoidów opracowanej dla ludzi. Rzeczywiście, poprzednie doniesienia wykazały, że organoidy jelitowe świń rosną wydajnie z tym podłożem 8,11,14,19,25,26,29,30. Interesujące jest, aby ta pożywka hodowlana była gotowa do użycia i miała znormalizowane stężenie czynników wzrostu w partii. Jednak ta pożywka hodowlana jest kosztowna, jej skład jest nieujawniony, a zatem nie jest możliwe modulowanie jej składu. W przeciwieństwie do tego, inne badania wykazały hodowlę organoidów jelitowych świń w niestandardowych pożywkach zawierających inhibitory farmakologiczne, rekombinowany czynnik wzrostu i / lub kondycjonowane podłoża 5,6,7,21. Chociaż metoda ta jest bardzo elastyczna i tańsza, jest czasochłonna w produkcji kondycjonowanych pożywek i może nie być odtwarzalna ze względu na potencjalną zmienność stężenia czynników wzrostu w kondycjonowanych pożywkach. W związku z tym jakość każdej partii kondycjonowanych pożywek powinna być zwalidowana poprzez pomiar wzrostu organoidów lub ekspresji genów markerowych31.
Badanie wykazało, że organoidy jelita czczego świń hodowane w tym samym komercyjnym pożywce do hodowli organoidów, które są tutaj stosowane, rosły szybciej i wydawały się mniej zróżnicowane w porównaniu z enteroidami hodowanymi z pożywkami zawierającymi rekombinowany czynnik wzrostu i / lub kondycjonowanymi pożywkami23. Wysoki stan proliferacyjny ułatwia hodowlę organoidów 3D, ale może wymagać indukowania różnicowania, aby był bardziej reprezentatywny dla cech fizjologicznych jelit. W tym protokole, w celu przejścia organoidów 3D, komórki są w pełni dysocjowane do liczenia, co pozwala kontrolować liczbę komórek wysianych w ECM. Zwiększa to odtwarzalność fenotypu organoidów, na co duży wpływ ma ich gęstość. Co więcej, liczenie komórek pozwala uniknąć uzyskania zbyt niskiej lub przepełnionej hodowli, co wymaga dostosowania harmonogramu hodowli. W większości innych badań przygotowywano fragmenty organoidów, które nie są w pełni zdysocjowane na pojedyncze komórki, i stosowano współczynnik rozcieńczenia do pasażowania. Ta metoda jest prostsza, ale może powodować zmienność w zależności od gęstości organoidów w kulturze.
W przypadku hodowli w monowarstwach, komórki organoidowe są wysiewane we wkładkach hodowlanych wstępnie pokrytych cienką warstwą ECM, co umożliwia przyłączanie komórek, ale pozwala uniknąć wzrostu organoidów w 3D. W protokole tym wykorzystano kolagen typu IV jako białko ECM, jak opisano wcześniej u świń23. W innych badaniach z monowarstwami organoidów świń wykorzystano ten sam ECM pochodzący z guza, który zastosowano tutaj do hodowli organoidów 3D 6,8,9,21,25,30. Zaletą stosowania kolagenu jest możliwość standaryzacji stężenia białka o w pełni określonym składzie, co nie ma miejsca w ECM pochodzącym z nowotworu. Kluczowym krokiem dla powodzenia hodowli monowarstw komórkowych jest zwrócenie uwagi na wygląd prekursorowych organoidów 3D, które powinny mieć dobrze zdefiniowane krawędzie i puste światło bez czarnych zanieczyszczeń. Rzeczywiście, organoidy o wysokim poziomie dojrzewania i niskim tempie proliferacji nie są odpowiednim źródłem komórek do hodowli 2D. W związku z tym czas dysocjacji organoidów 3D na pojedyncze komórki ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego etapu.
Hodowla monowarstw 2D z pojedynczych komórek pozwala na standaryzację liczby wysiewanych komórek, co jest trudniejsze w przypadku zaczynania od fragmentów organoidów, jak to ma miejsce w przypadku niektórych innych metod. Wysialiśmy 7,6 x 105 komórek na cm2, co jest wysoką wartością w porównaniu z większością innych badań 21,22,23 u świń, które używały niższej gęstości komórek, w zakresie od 0,25 x 105 komórek na cm 2 do 1,78 x 105 komórek na cm2. Wymóg dużej liczby komórek organoidowych stanowi ograniczenie tego protokołu, ale pozwolił nam szybko uzyskać zlewającą się monowarstwę, w pełni pokrywającą wkładkę hodowlaną po 1 dniu. Natomiast Vermeire i wsp.23 uzyskali konfluencję po 4-7 dniach przy mniejszej gęstości wysianych komórek (od 0,25 x 105 komórek/cm2 do 0,4 x 105 komórek/cm2). W niektórych badaniach wykorzystano również monowarstwy komórek organoidowych świni, które nie pokrywały w pełni powierzchni hodowli w przypadku zakażeń wirusami 8,30. W tych warunkach wierzchołkowa strona komórek nabłonka jest dostępna do leczenia, ale jeśli celem jest badanie wchłaniania składników odżywczych lub przepuszczalności nabłonka, wymagane są w pełni zlewające się monowarstwy.
W przypadku monowarstw komórek organoidowych zastosowano komercyjne podłoże do hodowli organoidów uzupełnione 20% FBS, w oparciu o niedawne badanie monowarstw pochodzących z enteroidów bydlęcych32. W naszych testach suplementacja 20% FBS była konieczna do uzyskania w pełni zlewających się monowarstw, prawdopodobnie ze względu na wysokie zapotrzebowanie na czynnik wzrostu. Wręcz przeciwnie, inne badania wykorzystujące to samo podłoże komercyjne ustaliły monowarstwy bez dodatkowego FBS 8,25,30, ale bez osiągnięcia pełnej konfluencji. W innych badaniach stosowano również suplementację 20% FBS w dostosowanej pożywce do hodowli monowarstw komórek organoidów świń21,22. W naszych eksperymentach TEER jest wysoki 1 dzień po wysiewie (około 700 Ω·cm2) i utrzymuje się na wysokim poziomie do 3 dnia (około 1500 Ω·cm2; jest to zgodne z tworzeniem ścisłych połączeń, na co wskazuje ekspresja okludyny. Van der Hee i wsp. uzyskali podobne wartości TEER w ciągu 72 godzin dla monowarstw komórek organoidów jelita czczego21. Wykazali również, że monowarstwy mogą być utrzymywane do 12-15 dnia przy codziennych zmianach pożywki. W przeciwieństwie do tego, inne badania wykazały znacznie niższe wartości TEER (około 200 Ω·cm2) dla monowarstw komórek organoidowych świni 6,22. Te różnice między badaniami mogą być związane z badanym segmentem jelita lub z używanymi pożywkami, które wpływają na różnicowanie nabłonka.
Podsumowując, powyższy protokół hodowli organoidów 3D jelit świń z zamrożonych krypt nabłonkowych ułatwia organizację pracy hodowlanej. Zmniejsza to zapotrzebowanie na świeże tkanki pozyskiwane od żywych zwierząt. Wyjaśniamy również, jak stworzyć w pełni zlewające się monowarstwy komórek pochodzące z organoidów świń w czasie krótszym niż 3 dni. W związku z tym nasze protokoły mogą być użytecznymi zasobami dla naukowców badających nabłonek jelit świń do badań weterynaryjnych lub biomedycznych.

Nabłonek jelitowy jest tworzony przez monowarstwę komórek pokrywających błonę śluzową przewodu pokarmowego na styku ze środowiskiem świetlnym. Ta pozycja jest związana z różnymi funkcjami, takimi jak wchłanianie składników odżywczych i funkcja barierowa, które są wspierane przez obecność komórek macierzystych i wielu zróżnicowanych typów komórek nabłonkowych (absorpcyjnych, enteroendokrynnych, Panetha i komórek kubkowych)1. Unieśmiertelnione linie komórkowe tradycyjnie używane do badania komórek nabłonkowych mają poważne ograniczenia, ponieważ nie odzwierciedlają złożoności komórkowej nabłonka jelitowego i prezentują nieprawidłowości genomowe2. Opracowanie trójwymiarowych (3D) organoidów przez Sato i wsp.3 dostarczyło nowego modelu do badania nabłonka jelitowego o zwiększonym znaczeniu fizjologicznym. Rzeczywiście, organoidy jelitowe pochodzą z nieprzekształconych komórek macierzystych, składają się z wielu typów komórek i podsumowują funkcjonalność nabłonka jelitowego. Organoidy jelitowe są coraz częściej wykorzystywane do zrozumienia rozwoju i funkcji nabłonka jelitowego oraz jego interakcji z patogenami, składnikami odżywczymi, toksynami, lekami, mikrobiotą i jej metabolitami2.
Początkowo opracowane dla ludzi i myszy, metody stosowane do hodowli organoidów jelitowych zostały ostatnio dostosowane do innych gatunków, w tym świń4. Gonzales et al.5 byli pierwszymi, którzy wyhodowali organoidy świń z jelita czczego; Od tego czasu organoidy świń zostały opisane dla innych segmentów jelit (dwunastnicy, jelita krętego i okrężnicy)6,7,8 i wykazano, że zachowują fenotyp specyficzny dla lokalizacji9,10,11. Organoidy 3D jelit świń są obecnie powszechnie używane do badania wpływu składników odżywczych12,13 lub infekcje jelitowe6,8,14.
Większość badań opisywała hodowlę organoidów jelitowych, zaczynając od świeżo wyizolowanych krypt nabłonkowych. Nie zawsze jest to jednak wykonalne ze względów logistycznych, zwłaszcza w przypadku pracy z dużymi zwierzętami, takimi jak świnie. Rzeczywiście, pomieszczenia dla zwierząt dla świń mogą znajdować się daleko od laboratorium, w którym hodowane są organoidy, co komplikuje organizację pracy. Co więcej, hodowla organoidów jest czasochłonna; W związku z tym nie jest praktyczne jednoczesne hodowanie wielu linii organoidów, na przykład z różnych segmentów jelit lub kilku zwierząt. Aby obejść te problemy, kilka badań na ludziach, koniach i świniach opisało metody hodowli organoidów z zamrożonych tkanek jelitowych (lub biopsji) lub z izolowanych krypt nabłonkowych4,15,16,17. Metody te pozwalają na krioprezerwację komórek macierzystych nabłonka jelitowego z wielu segmentów jelita jednego zwierzęcia, które w razie potrzeby można następnie wykorzystać do hodowli organoidów. Co więcej, pozwala to na znaczne zmniejszenie liczby żywych zwierząt wykorzystywanych jako dawcy komórek macierzystych, ponieważ można stworzyć duże zapasy kriokonserwowanych krypt (zasady 3R). Kolejną zaletą tej metody jest wzrost organoidów jelitowych tylko od interesujących zwierząt po uzyskaniu wyników fenotypowych lub genotypowych, co jest wysoce opłacalne.
In vivo, komórki nabłonka jelitowego są spolaryzowane, z wierzchołkową stroną skierowaną w stronę światła. In vitro, w organoidach 3D, wierzchołkowa strona komórek nabłonka jest również skierowana w stronę światła (tj. wewnątrz organoidów)4. Organizacja ta uniemożliwia dostęp do strony wierzchołkowej, co stanowi problem podczas badania wpływu składników luminalnych (np. składników odżywczych, drobnoustrojów, metabolitów) na komórki nabłonkowe. Aby obejść tę wadę, opracowano kilka metod, takich jak hodowla komórek organoidowych jako monowarstw 2D, mikroiniekcja i odwrócenie polaryzacji ("organoidy wierzchołkowe")18,19. Hodowla monowarstw komórek organoidowych staje się najbardziej wydajnym i elastycznym systemem. Zasada polega na dysocjacji organoidów 3D na pojedyncze komórki i wysiewaniu ich na naczyniu do hodowli komórkowej uprzednio pokrytym cienką warstwą macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)20. W tych warunkach hodowli wierzchołkowa strona komórek nabłonka jest skierowana do góry, a zatem jest dostępna dla eksperymentalnych metod leczenia20. Hodowla monowarstw komórek organoidowych została niedawno zaadaptowana dla jelita świni21,22; monowarstwy komórkowe pochodzące z organoidów 3D świń były wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do badania zakażeń jelitowych6,23,24,25, transport składników odżywczych9, oraz modelowanie chorób trawiennych26.
Tutaj to badanie najpierw przedstawia szczegółowy protokół hodowli i utrzymania organoidów 3D jelit świń pochodzących z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych (Rysunek 1). Następnie opisano protokół ustalania monowarstw komórek z organoidów 3D jelita świni. Opisane tutaj metody dostarczają narzędzi eksperymentalnych, które można wykorzystać do badania nabłonka jelitowego świni pod kątem transportu składników odżywczych, funkcji bariery i interakcji gospodarz-mikroorganizm.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific AM9260G</td><td></td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych </td><td>Corning</td><td>003526</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych </td><td>Corning</td><td>003548</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowa probówka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Euromedex</td><td>A6003</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Wirówka Universal 320 R</td><td>Hettich</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu IV z ludzkiego łożyska</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w kwasie octowym zgodnie z zaleceniami producenta. Podwielokrotność (500 &mikro; L) i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. </td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania komórek CoolCell LX</td><td>Corning</td><td>432003</td><td>Służy do krioprezerwacji krypt i organoidów. </td></tr><tr><td>Countess 3 Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16842556</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>630-1845</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube ClearLine 1 mL</td><td>Clear line </td><td>390706</td><td>Służy do krioprezerwacji krypt i organoidów. </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 5 mg/ml w wodzie zgodnie z zaleceniami producenta s rekomendacja. Podwielokrotność (20 &mikro; L) i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C </td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT) </td><td>Merck</td><td>10197777001</td><td>Sklep pod adresem 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM, suplement o wysokiej zawartości glukozy, pirogronian</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31966047</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl Suloxidide)</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe Epredia Superfrost Plus Adhezja</td><td>VWR</td><td>631-9483 </td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>Przechowywać 5 ml porcji w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Sterylne sitka komórkowe Fisherbrand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>Służy do izolacji krypt. </td></tr><tr><td>Stały rotator platformy 3D Tilt </td><td>VWR</td><td> 97025-564 </td><td>Używany do inkubacji w protokole barwienia immunologicznego. </td></tr><tr><td>Gibco PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific 10010015</td><td></td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & st. C.</td></tr><tr><td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605-010</td><td>Odczynnik do dysocjacji enzymów. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG, Alexa fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>Przeciwciało wtórne. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Rozcieńczenie robocze 1:1000. </td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td><td>Stem Cell Technology</td><td>6010</td><td>Pożywka do hodowli organoidów. Przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Rozmrozić podłoże podstawowe i suplement organoidowy w temperaturze pokojowej i wymieszać (1:1). Przechowuj mieszankę w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 tygodnia. </td></tr><tr><td>Wkładka z membraną PET przezroczysta Falcon na płytkę 24 dołki</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td> Eclipse TS2</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Macierz zewnątrzkomórkowa pochodząca z nowotworu stosowana do hodowli 3D organoidów. Matrigel polimeryzuje w temperaturze pokojowej. Do pipetowania Matrigelu używać schłodzonych końcówek. Przygotuj 500 &mikro; L i przechowywać w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe do fluorescencji z DAPI</td><td>Vectashield</td><td>H1250</td><td> Przechowywać w temperaturze 4 °C. </td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne okludyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>71-1500</td><td>Przeciwciało pierwotne. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozcieńczenie robocze 1:200. </td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 32%</td><td>Mikroskopia elektronowa nauka</td><td>15714</td><td>Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) pod kapturem chemicznym, dodając 5 ml 32% PFA do 35 ml PBS. Porcję przez 10 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Przeciwbakteryjny. Przechowywać 5 ml porcji w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Phalloidin TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Sonda do barwienia aktyny. 1 mg/ml roztwór podstawowy. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td>Środek przeciwdrobnoustrojowy do komórek pierwotnych działających na bakterie, mykoplazmy i grzyby. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK (Y27632)</td><td>ATCC</td><td>ACS-3030</td><td>Służy do utrzymania komórek macierzystych. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM w sterylnej wodzie zgodnie z zaleceniami producenta i przechowywać porcje (50  ��; L) przy -20 &st. C.</td></tr><tr><td>Wytrząsarka obrotowa XL</td><td>Clear line </td><td>062646CL</td><td>Służy do izolacji krypty. </td></tr><tr><td>Pipety serologiczne pasiaste 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych </td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>8787</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Trypan Blue stain, 0,4% </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>System próżniowy Vacusip</td><td>Integra</td><td>159000</td><td>Służy do usuwania podłoża ze studzienek organoidowych. </td></tr></tbody></table>

hodowla organoidów 3d jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Organoidy jelitowe są coraz częściej wykorzystywane do badania nabłonka jelitowego do modelowania chorób trawiennych, lub do badania interakcji z lekami, składnikami odżywczymi, metabolitami, patogenami i mikrobiotą. Metody hodowli organoidów jelitowych są obecnie dostępne dla wielu gatunków, w tym dla świń, które są gatunkiem o dużym znaczeniu zarówno jako zwierzę hodowlane, jak i jako model translacyjny dla ludzi, na przykład do badania chorób odzwierzęcych. W tym miejscu podajemy szczegółowy opis procedury stosowanej do hodowli organoidów 3D jelit świni z zamrożonych krypt nabłonkowych. Protokół opisuje, w jaki sposób kriokonserwować krypty nabłonkowe z jelita świni i późniejsze procedury hodowli organoidów jelitowych 3D. Głównymi zaletami tej metody są (i) czasowa dysocjacja izolacji krypt od hodowli organoidów 3D, (ii) przygotowanie dużych zapasów kriokonserwowanych krypt pochodzących z wielu segmentów jelita i od kilku zwierząt jednocześnie, a co za tym idzie (iii) zmniejszenie potrzeby pobierania próbek świeżych tkanek od żywych zwierząt. Szczegółowo opisujemy również protokół tworzenia monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D, aby umożliwić dostęp do wierzchołkowej strony komórek nabłonka, która jest miejscem interakcji ze składnikami odżywczymi, drobnoustrojami lub lekami. Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj protokoły są przydatnym źródłem do badania nabłonka jelitowego świni w badaniach weterynaryjnych i biomedycznych.

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, krypty nabłonkowe są pozyskiwane z jelita świni i krio konserwowane do długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie (Rycina 1 i Rycina 2A). Po rozmrożeniu komórki macierzyste krypt są wysiewane w ECM (Rycina 2B). Na tym etapie zazwyczaj dochodzi do utraty struktury krypty z powodu dezintegracji struktury krypty w ECM. Organoidy można zaobserwować w ciągu 3-4 dni, po czym szybko rosną i rozwijają struktury pączkujące (Rycina 2B). Pomyślnie uzyskano organoidy po rozmrożeniu zamrożonych krypt w &gt;80% prób. Około 10 dni po rozmrożeniu (zależnie od tempa wzrostu organoidów) przeprowadza się pasażowanie organoidów w celu powiększenia hodowli (Rycina 3). Organoidy rosną szybciej po rozdzieleniu i wykazują zróżnicowaną morfologię, przy czym niektóre są torbielowate, a większość pączkująca. Dla optymalnego utrzymania hodowli, organoidy wykorzystywane do pasażowania muszą mieć wyraźne i puste światło oraz dobrze zdefiniowane krawędzie (przykłady wskazane zielonymi strzałkami), bez czarnych zanieczyszczeń w świetle (wskazanych czerwonymi strzałkami), co obserwuje się w dojrzałych organoidach (Rycina 3). Stwierdzono, że czarne szczątki komórkowe zaczynają gromadzić się około 6. dnia po pasażowaniu. Dlatego zaleca się rozdzielenie lub zamrożenie organoidów w 4-5. dniu po pasażowaniu.
Stopień dojrzałości organoidów jest również istotnym czynnikiem przy uzyskiwaniu monowarstw komórkowych. Organoidy o zaawansowanej dojrzałości (wskazanej przez obecność czarnych szczątków komórkowych w świetle) nie są optymalne do wysiewu monowarstw. Zazwyczaj dysocjujemy organoidy 3D 4 dni po pasażowaniu, aby zebrać komórki do hodowli 2D. Do wysiania jednego insertu hodowlanego z 2,5 x 105 komórkami potrzeba około jednego do trzech dołków z organoidami 3D hodowanymi w zagęszczeniu 3 000 komórek na 50 µL kopułki ECM. Komórki przywierają i tworzą w pełni konfluentną monowarstwę w ciągu 1 dnia (Ryc. 4A), co potwierdzają wysokie wartości TEER wynoszące około 700 Ω·cm2 (Ryc. 4B). Jednakże, na tym wczesnym etapie brzegi komórek są trudne do wizualizacji w mikroskopii w świetle przechodzącym, prawdopodobnie ze względu na niski poziom zróżnicowania. Wartości TEER pozostają wysokie przez 3 dni (Ryc. 4B).
Barwienie aktyny wskazuje, że strona apikalna komórek nabłonkowych jest skierowana w stronę światła w organoidach 3D (Rysunek 5A). Komórki organoidów wysiane w insertach hodowlanych tworzą konfluentną pojedynczą warstwę komórek nabłonkowych, z powierzchnią apikalną skierowaną w stronę górnej komory (Rysunek 4B,C). Barwienie okludyny ujawnia obecność połączeń ścisłych po stronie apikalnej komórek nabłonkowych w organoidach 3D oraz w monowarstwach komórkowych (Rysunek 5A-C).
<img alt="Schemat 3D organoidów jelita świni: izolacja, hodowla, krio konserwacja, przygotowanie monowarstw komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie metod stosowanych do hodowli 3D organoidów oraz monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów. Krypty nabłonkowe są izolowane z jelita prosięcia. Krypty te mogą zostać i) niezwłocznie wykorzystane do hodowli 3D organoidów lub ii) zamrożone i przechowywane w biobanku w ciekłym azocie. Kriokonserwowane krypty mogą zostać rozmrożone i wykorzystane do hodowli 3D organoidów. Hodowlę 3D organoidów można utrzymywać poprzez sukcesywne pasażowanie lub zamrozić i przechowywać w biobanku. Z hodowli 3D organoidów można uzyskać monowarstwy komórkowe, co umożliwia dostęp do strony apikalnej komórek i badanie funkcji bariery nabłonkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Progresja wzrostu organoidów krypt; obrazy mikroskopowe; wyizolowane krypty; obserwacja w dniach 4-10." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Hodowla trójwymiarowych (3D) organoidów jelit świni z krio konserwowanych krypt nabłonkowych. (A) Reprezentatywny obraz mikroskopowy świeżo wyizolowanych krypt jelita czczego. (B) Reprezentatywne obrazy mikroskopowe organoidów 3D uzyskanych po rozmrożeniu krypt jelita czczego. Organoidy hodowano w 25 µL kopułce ECM na płytce 48-dołkowej. Na rycinie przedstawiono obrazy organoidów 3D w 4, 7, 8, 9 i 10 dniu po wysianiu. Pasek skali oznacza 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Fazy wzrostu komórek w ciągu 4 dni; obrazy mikroskopowe; badanie morfologii komórek, porównanie osi czasu hodowli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Morfologia 3D organoidów jelitowych świni pochodzących z kriozachowanych krypt nabłonkowych po pierwszym pasażu. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe przedstawiające rozwój organoidów pochodzących z kriozachowanych krypt jelita czczego po pierwszym pasażu od 4. do 7. dnia. Zielone strzałki wskazują przejrzyste organoidy odpowiednie do pasażowania lub wysiewania monowarstw. Czerwone strzałki wskazują dojrzałe organoidy nieprzydatne do rozdzielania lub wysiewania monowarstw; w związku z tym należy wykorzystać studzienki przed pojawieniem się takiej morfologii. Pasek skali reprezentuje 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wzrostu komórek z wynikami TEER; obrazy mikroskopowe z 4 dni; wykres przedstawia TEER w funkcji czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Charakterystyka monowarstw komórkowych pochodzących z 3D organoidów jelita świni. (A) Reprezentatywne obrazy mikroskopowe morfologii monowarstwy w ciągu 3 dni. Komórki organoidów jelita czczego wysiano w liczbie 2.5 x 105 komórek do insertów do hodowli komórkowej o powierzchni 0.33 cm2 pokrytych kolagenem IV w stężeniu 50 ng/mL. Pasek skali oznacza 500 µm. (B) Transepitelialna oporność elektryczna (TEER) monowarstw komórek organoidów w ciągu 3 dni. Punkty połączone linią odpowiadają tej samej studzience w różnych odstępach czasu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii konfokalnej DNA, aktyny i okludyny w komórkach nabłonkowych do badania lokalizacji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Obrazowanie organoidów jelita czczego świni hodowanych w 3D lub 2D. Obrazowanie z mikroskopii konfokalnej (A) organoidów 3D 5 dni po podziale oraz (B,C) monowarstw komórek organoidowych 3 dni po wysianiu (B: przekrój XZ; C: przekrój XY). DNA (niebieski) zabarwiono DAPI. Aktynę (czerwony) zabarwiono falloidyną. Okludynę (zielony) zabarwiono przeciwciałem poliklonalnym. Białe strzałki wskazują okludynę zlokalizowaną w złączach ścisłych. Pasek skali odpowiada 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy protokół hodowli organoidów 3D jelit świń z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych. Opisujemy również metodę tworzenia monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D, umożliwiających dostęp do wierzchołkowej strony komórek nabłonkowych.

Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Nasz protokół zapewnia narzędzia do badania nabłonka jelit świni do badań weterynaryjnych i biomedycznych. Organoidy jelitowe świń można wykorzystać do badania transportu składników odżywczych, funkcji bariery i interakcji gospodarz-drobnoustroj. Poprzez zachowanie krypt nabłonka jelita świni pozwala na stworzenie dużego zapasu komórek macierzystych, które można później wykorzystać do hodowli organoidów w monowarstwach 3D lub 2D.Protokół ten jest szczegółowo opisany dla jelita czczego, ale może być również stosowany do innych segmentów jelita, takich jak dwunastnica, jelito kręte i okrężnica. Na początek szybko rozmrozić fiolkę zawierającą 900 zamrożonych krypt w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś roztwór krypty do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.Wirować przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać 150 mikrolitrów macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM ze schłodzoną końcówką, aby uzyskać końcowe stężenie 150 krypt na 25 mikrolitrów ECM. Pibułować w górę i w dół 10 razy, aby uzyskać jednorodną zawiesinę krypt w ECM.Wysiewaj sześć dołków z kroplą 25 mikrolitrów na studzienkę na wstępnie podgrzaną 48-dołkową płytkę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w celu polimeryzacji ECM. Dodaj 250 mikrolitrów na studzienkę kultury pożywki o temperaturze pokojowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Aby przejść przez organoidy 3D pochodzące z zamrożonych krypt 10 dni po wysianiu, usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 250 mikrolitrów wstępnie podgrzanego PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji zastąp PBS 250 mikrolitrami wstępnie podgrzanego odczynnika dysocjacji enzymów uzupełnionego 10 inhibitorem skał mikromolowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w każdym dołku.Odłączyć organoidy w ECM przez zeskrobanie pipetą P-1000 i ostrożnie homogenizować przez pięciokrotne pipetowanie. Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, a następnie dysocjować komórki przez pipetowanie w górę iw dół 10 razy. Dodaj 500 mikrolitrów DMEMc do każdej studzienki zawierającej zdysocjowane komórki i wyciągnij do 12 studzienek do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej trzy mililitry zimnego DMEMc.Wirować przy 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze zimnego DMEMc. Policz komórki w rozcieńczeniu od jednego do dwóch w błękitu trypanowym z licznikiem komórek.Odwirować niezbędną objętość roztworu komórkowego, aby uzyskać 3000 żywych komórek na kopułę. Zawiesić osad z 17 mikrolitrami zimnego DMEMc na 3000 żywych komórek na lodzie. Dostosuj głośność do wymaganej liczby dołków.Powoli dodawaj 33 mikrolitry zimnego ECM na 3000 żywych komórek. Dostosuj objętość do wymaganej liczby dołków i homogenizuj bez robienia pęcherzyków. Następnie obejrzyj studzienki z 50 mikrolitrami zawiesiny komórek ECM na studzienkę na wstępnie podgrzaną 24-dołkową płytkę i inkubuj przez 30 minut w celu polimeryzacji ECM.Dodać 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej na studzienkę. Następnie inkubuj i zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Aby pokryć wkładkę hodowlaną, przygotuj roztwór powlekający zawierający kolagen dożylnie rozcieńczony w 50 mikrogramach na mililitr w zimnym PBS.Dodać 150 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu powlekającego do każdej wkładki do hodowli komórkowej i inkubować przez noc lub przez trzy godziny. Pięć dni po rozszczepieniu odłącz organoidy za pomocą ECM, zeskrobując je pipetą P-1000. Ostrożnie homogenizować przez pipetowanie pożywki hodowlanej i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów zimnego DMEMc na lodzie.Odwirować zebrane organoidy w temperaturze 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze wstępnie podgrzanego odczynnika dysocjacyjnego enzymatycznego uzupełnionego 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby zainicjować dysocjację organoidów.Inkubować przez pięć minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu trawienia enzymatycznego. Mechanicznie rozbić organoidy, pipetując 10 razy i dodać cztery mililitry lodowatego DMEMc. Odwirować i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu komórek organoidowych w jednym mililitrze DMEMc.Policz komórki w błękitu trypanowym za pomocą licznika komórek i oblicz objętość niezbędną do wysiewu 2,5 razy 10 do piątej komórki na wkładkę hodowli. Odwirować niezbędną objętość zawiesiny komórek odpowiadającą 2,5 razy 10 piątych komórek na wkładkę hodowlaną. Podczas wirowania ostrożnie zassać roztwór powlekający z wkładek hodowlanych i pozostawić go do wyschnięcia pod kapturem bez pokrywki na pięć minut.Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w niezbędnej objętości pożywki 2D uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Wysiewaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na powlekaną przepuszczalną membranę. Dodać 500 mikrolitrów pożywki 2D uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK do dolnej komory i inkubować.Na błonie należy zaobserwować duże zagęszczenie komórek. Jednego dnia po wysiewie należy zastąpić podłoże epickie i podstawowe świeżą pożywką 2D bez inhibitora ROCK. Zmieniaj nośniki każdego dnia.Monowarstwa zlewa się dzień po wysianiu i może być używana do eksperymentów. W tym badaniu krypty nabłonkowe uzyskano z jelita świni i poddano kriokonserwacji w celu długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie. Po rozmrożeniu krypty komórki macierzyste zostały wysiane w ECM.Organoidy zaobserwowano w ciągu trzech do czterech dni i szybko rosły i rozwijały pączkujące struktury. Około 10 dni po rozmrożeniu przeprowadzono pasaż organoidów w celu rozszerzenia kultury. W celu optymalnego utrzymania hodowli, organoidy używane do pakowania muszą mieć przezroczysty i pusty strumień świetlny oraz dobrze zaznaczone krawędzie, bez czarnych zanieczyszczeń w świetle, jak to obserwuje się w dojrzałych organoidach.Komórki łączą się i tworzą w pełni zlewającą się monowarstwę w ciągu jednego dnia, co potwierdza wysoki transepiteliczny opór elektryczny (TEER) wynoszący około 700 centymetrów kwadratowych kopuły. Wskaźnik TEER utrzymuje się na wysokim poziomie przez trzy dni. Barwienie aktyną wskazuje, że wierzchołkowa strona komórek nabłonka jest zorientowana w kierunku światła w organoidach 3D.Komórki organoidowe wysiane we wkładkach hodowlanych tworzą zlewającą się pojedynczą warstwę komórek nabłonkowych ze stroną wierzchołkową zorientowaną w kierunku górnego przedziału. Barwienie okludyną ujawnia obecność ścisłych połączeń po wierzchołkowej stronie komórek nabłonka w organoidach 3D i monowarstwach komórkowych. Ważne jest, aby pamiętać, że organoid używany do wysiewu monowarstw komórek powinien wydawać się przezroczysty z pustym światłem bez czarnych zanieczyszczeń odpowiadających nagromadzeniu martwych komórek.Monowarstwy z organoidu jelitowego świni można wykorzystać do badania wpływu metabolitów lub drobnoustrojów na funkcję bariery nabłonkowej za pomocą testów funkcjonalnych, obrazowania i analizy ekspresji genów.

culture-piglet-intestinal-3d-organoids-from-cryopreserved-epithelial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Poznaj metodę hodowli organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenia monowarstw komórkowych. Protokół umożliwia badanie transportu składników odżywczych, funkcji bariery i interakcji z mikroorganizmami.

Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

Przeglądaj więcej filmów