Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

Nasz protokół zapewnia narzędzia do badania nabłonka jelit świni do badań weterynaryjnych i biomedycznych. Organoidy jelitowe świń można wykorzystać do badania transportu składników odżywczych, funkcji bariery i interakcji gospodarz-drobnoustroj. Poprzez zachowanie krypt nabłonka jelita świni pozwala na stworzenie dużego zapasu komórek macierzystych, które można później wykorzystać do hodowli organoidów w monowarstwach 3D lub 2D.

Protokół ten jest szczegółowo opisany dla jelita czczego, ale może być również stosowany do innych segmentów jelita, takich jak dwunastnica, jelito kręte i okrężnica. Na początek szybko rozmrozić fiolkę zawierającą 900 zamrożonych krypt w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś roztwór krypty do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Wirować przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać 150 mikrolitrów macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM ze schłodzoną końcówką, aby uzyskać końcowe stężenie 150 krypt na 25 mikrolitrów ECM. Pibułować w górę i w dół 10 razy, aby uzyskać jednorodną zawiesinę krypt w ECM.

Wysiewaj sześć dołków z kroplą 25 mikrolitrów na studzienkę na wstępnie podgrzaną 48-dołkową płytkę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w celu polimeryzacji ECM. Dodaj 250 mikrolitrów na studzienkę kultury pożywki o temperaturze pokojowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Aby przejść przez organoidy 3D pochodzące z zamrożonych krypt 10 dni po wysianiu, usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 250 mikrolitrów wstępnie podgrzanego PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji zastąp PBS 250 mikrolitrami wstępnie podgrzanego odczynnika dysocjacji enzymów uzupełnionego 10 inhibitorem skał mikromolowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w każdym dołku.

Odłączyć organoidy w ECM przez zeskrobanie pipetą P-1000 i ostrożnie homogenizować przez pięciokrotne pipetowanie. Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, a następnie dysocjować komórki przez pipetowanie w górę iw dół 10 razy. Dodaj 500 mikrolitrów DMEMc do każdej studzienki zawierającej zdysocjowane komórki i wyciągnij do 12 studzienek do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej trzy mililitry zimnego DMEMc.

Wirować przy 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze zimnego DMEMc. Policz komórki w rozcieńczeniu od jednego do dwóch w błękitu trypanowym z licznikiem komórek.

Odwirować niezbędną objętość roztworu komórkowego, aby uzyskać 3000 żywych komórek na kopułę. Zawiesić osad z 17 mikrolitrami zimnego DMEMc na 3000 żywych komórek na lodzie. Dostosuj głośność do wymaganej liczby dołków.

Powoli dodawaj 33 mikrolitry zimnego ECM na 3000 żywych komórek. Dostosuj objętość do wymaganej liczby dołków i homogenizuj bez robienia pęcherzyków. Następnie obejrzyj studzienki z 50 mikrolitrami zawiesiny komórek ECM na studzienkę na wstępnie podgrzaną 24-dołkową płytkę i inkubuj przez 30 minut w celu polimeryzacji ECM.

Dodać 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej na studzienkę. Następnie inkubuj i zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Aby pokryć wkładkę hodowlaną, przygotuj roztwór powlekający zawierający kolagen dożylnie rozcieńczony w 50 mikrogramach na mililitr w zimnym PBS.

Dodać 150 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu powlekającego do każdej wkładki do hodowli komórkowej i inkubować przez noc lub przez trzy godziny. Pięć dni po rozszczepieniu odłącz organoidy za pomocą ECM, zeskrobując je pipetą P-1000. Ostrożnie homogenizować przez pipetowanie pożywki hodowlanej i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów zimnego DMEMc na lodzie.

Odwirować zebrane organoidy w temperaturze 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze wstępnie podgrzanego odczynnika dysocjacyjnego enzymatycznego uzupełnionego 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby zainicjować dysocjację organoidów.

Inkubować przez pięć minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu trawienia enzymatycznego. Mechanicznie rozbić organoidy, pipetując 10 razy i dodać cztery mililitry lodowatego DMEMc. Odwirować i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu komórek organoidowych w jednym mililitrze DMEMc.

Policz komórki w błękitu trypanowym za pomocą licznika komórek i oblicz objętość niezbędną do wysiewu 2,5 razy 10 do piątej komórki na wkładkę hodowli. Odwirować niezbędną objętość zawiesiny komórek odpowiadającą 2,5 razy 10 piątych komórek na wkładkę hodowlaną. Podczas wirowania ostrożnie zassać roztwór powlekający z wkładek hodowlanych i pozostawić go do wyschnięcia pod kapturem bez pokrywki na pięć minut.

Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w niezbędnej objętości pożywki 2D uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Wysiewaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na powlekaną przepuszczalną membranę. Dodać 500 mikrolitrów pożywki 2D uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK do dolnej komory i inkubować.

Na błonie należy zaobserwować duże zagęszczenie komórek. Jednego dnia po wysiewie należy zastąpić podłoże epickie i podstawowe świeżą pożywką 2D bez inhibitora ROCK. Zmieniaj nośniki każdego dnia.

Monowarstwa zlewa się dzień po wysianiu i może być używana do eksperymentów. W tym badaniu krypty nabłonkowe uzyskano z jelita świni i poddano kriokonserwacji w celu długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie. Po rozmrożeniu krypty komórki macierzyste zostały wysiane w ECM.

Organoidy zaobserwowano w ciągu trzech do czterech dni i szybko rosły i rozwijały pączkujące struktury. Około 10 dni po rozmrożeniu przeprowadzono pasaż organoidów w celu rozszerzenia kultury. W celu optymalnego utrzymania hodowli, organoidy używane do pakowania muszą mieć przezroczysty i pusty strumień świetlny oraz dobrze zaznaczone krawędzie, bez czarnych zanieczyszczeń w świetle, jak to obserwuje się w dojrzałych organoidach.

Komórki łączą się i tworzą w pełni zlewającą się monowarstwę w ciągu jednego dnia, co potwierdza wysoki transepiteliczny opór elektryczny (TEER) wynoszący około 700 centymetrów kwadratowych kopuły. Wskaźnik TEER utrzymuje się na wysokim poziomie przez trzy dni. Barwienie aktyną wskazuje, że wierzchołkowa strona komórek nabłonka jest zorientowana w kierunku światła w organoidach 3D.

Komórki organoidowe wysiane we wkładkach hodowlanych tworzą zlewającą się pojedynczą warstwę komórek nabłonkowych ze stroną wierzchołkową zorientowaną w kierunku górnego przedziału. Barwienie okludyną ujawnia obecność ścisłych połączeń po wierzchołkowej stronie komórek nabłonka w organoidach 3D i monowarstwach komórkowych. Ważne jest, aby pamiętać, że organoid używany do wysiewu monowarstw komórek powinien wydawać się przezroczysty z pustym światłem bez czarnych zanieczyszczeń odpowiadających nagromadzeniu martwych komórek.

Monowarstwy z organoidu jelitowego świni można wykorzystać do badania wpływu metabolitów lub drobnoustrojów na funkcję bariery nabłonkowej za pomocą testów funkcjonalnych, obrazowania i analizy ekspresji genów.