Name: Izolacja i oczyszczanie β-glukanu grzybów jako strategia immunoterapii glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę izolacji i oczyszczania β-glukanów grzybowych w celu immunoterapii glejaka. Protokół obejmuje ekstrakcję z Pleurotus ostreatus, Ganoderma lucidum i innych gatunków oraz analizę wpływu na komórki mikrogleju BV2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Vasiliki Economopoulos za jej wewnętrzny skrypt do pomiaru sygnału fuluorescencji w ImageJ. Chcielibyśmy również podziękować CITIUS (Uniwersytet w Sewilli) i całemu personelowi za wsparcie podczas demonstracji. Prace te były wspierane przez hiszpański FEDER I + D + i-USE, US-1264152 z Uniwersytetu w Sewilli oraz Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

Cztery różne warianty grzybów opisane w tym protokole zostały uzyskane z komercyjnego źródła (zobacz Tabelę Materiałów).
1. Izolacja β-glukanów grzybów
<ol>
	<li>Ekstrakcja i izolacja rozpuszczalnych polisacharydów grzybowych 
	UWAGA: Rozpuszczalne polisacharydy grzybowe (SMP) otrzymano zgodnie z procedurą schematycznie pokazaną w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
	<ol>
		<li>Delikatnie opłucz świeże owocniki P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus i G. lucidum (około 2,000 g/grzyb) w wodzie destylowanej pięć razy.</li>
		<li>Wysuszyć owocniki w temperaturze 50 ± 2 °C w konwencjonalnym piecu do suszenia na powietrzu, aż do osiągnięcia stałej wagi (~24 h).</li>
		<li>Zmielić suszone grzyby w młynku ostrzowym, uzyskując około 200 g proszku z każdego grzyba.</li>
		<li>Zawiesić 100 g proszku grzybowego (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus i G. lucidum) w 1,000 ml H2Od. Następnie sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut, a na koniec pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
		<li>Odwirować otrzymaną zawiesinę o sile 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wysuszyć osad zawierający nierozpuszczalne polisacharydy grzybowe (IMP) w temperaturze 50 ± 2 °C w suszarce powietrznej przez 24 godziny.</li>
		<li>Odrzucić osad i zachować supernatant. Zagęścić supernatant 10 razy w wyparce obrotowej.</li>
		<li>Wytrącić koncentrat zawierający OMP etanolem (80% stężenia końcowego) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę etanolu o stężeniu 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, zatrzymać osad i odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
		<li>Przemyć osad trzykrotnie 80% etanolem przed rozpuszczeniem go wH2Od (10% w/v). Ustaw pH na 6,5/7, a temperaturę na 37 °C i potraktuj odpowiednio 2 U i 4 U α-amylazy i glukoamylazy w celu rozpuszczenia α-glukanów zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Po poddaniu działaniu α-amylazy/glukoamylazy należy dostosować pH i temperaturę odpowiednio do 8,0 i 50 °C, a następnie potraktować alkazą (2,5 U/g białka) (patrz Tabela Materiałów) w celu rozpuszczenia białek. 
		UWAGA: Ta sekwencyjna obróbka enzymatyczna usuwa większość α-glukanów i białek, które współwytrącają się z β-glukanami w wytrącaniu etanolu.</li>
		<li>Po hydrolizie odwirować hydrolizat o sile 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie pięciokrotnie zagęścić czysty supernatant w wyparce obrotowej. Wytrącić ponownie 80% etanolem.</li>
		<li>Powstały osad należy rozpuścić w H2Od i dializować w wodzie destylowanej przez 24 godziny za pomocą membran rurkowych z celulozy (membrany odcinające 12 000 Da; patrz tabela materiałów) w celu usunięcia cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej. Odzyskaj część rozpuszczalną w wodzie i liofilizuj ją, aby uzyskać rozpuszczalne β-glukany (SβG).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar cukru i białka
	<ol>
		<li>Zmierzyć całkowitą zawartość cukru w każdej frakcji metodą kwasu fenolowo-siarkowego, używając glukozy jako standardu8. 
		UWAGA: Kwantyfikacja zawartości β-glukanu może być również przeprowadzona przy użyciu zestawu do oznaczania β-glukanu (grzyby i drożdże; patrz Tabela materiałów), w oparciu o hydrolizę enzymatyczną i aktywność oksydoreduktaz: mianowicie egzo-1,3-β-glukanazy, oksydazy glukozowej, β-glukozydazy i peroksydazy, a następnie tworzenia chinoneiminy. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, z niewielkimi modyfikacjami.</li>
		<li>Użyj 18 MH2SO4 zamiast 12 MH2SO4.</li>
		<li>Oceń zawartość wszystkich glukanów i α-glukanów oddzielnie.</li>
		<li>Zmierz wynikowe wartości β-glukanu jako różnicę między całkowitymi wartościami glukanu i α-glukanu (potrójnego) zgodnie z protokołem Kjeldahla. W niektórych przypadkach zawartość białka można określić metodą Lowry'ego, używając albuminy do wykreślenia krzywej kalibracyjnej11,12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza spektroskopii absorpcyjnej w ultrafiolecie
	<ol>
		<li>Widma ultrafioletu (UV) SβG należy uzyskać za pomocą spektrofotometru UV-widzialnego (patrz tabela materiałów), skanując próbki w zakresie 200-400 nm (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Przygotować 1,0 mg/ml każdego SβG wH2Od, przenieść roztwór do kuwety kwarcowej i zeskanować w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza rozkładu masy cząsteczkowej
	<ol>
		<li>Oszacować jednorodność SβGs i masę cząsteczkową polimerów za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) przy użyciu systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (patrz tabela materiałów) wyposażonego w detektor indeksu refrakcji i ultrahydrożelową liniową kolumnę filtracyjną żelu (300 mm x 7,8 mm; <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Przeprowadzić test w temperaturze 40 °C, używając wody dejonizowanej jako eluentu o natężeniu przepływu 0,5 ml/min-1 i dekstransu (110, 80 i 50 kDa) jako wzorców (patrz Tabela materiałów). Zbierz frakcję o pojemności 5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR)
	<ol>
		<li>Zapisz widma podczerwieni (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) na spektrometrze FTIR w zakresie 4000-500 cm-1. Próbki należy wcześniej wymieszać z KBr w celu utworzenia folii (standardowa procedura FTIR; patrz instrukcje producenta i tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza składu molekularnego
	<ol>
		<li>Oszacuj skład molekularny SβG za pomocą wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC) oraz chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS), zgodnie ze standardowymi procedurami12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Badanie in vitro stymulacji mikrogleju indukowanej β-glukanem
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa mysiego glejaka i komórek mikrogleju w szkiełkach 8-dołkowych 
	UWAGA: Ten protokół jest specyficzny dla linii komórkowych GL261 (glejak) i BV2 (mikroglej). Jednak z niewielkimi modyfikacjami kroki te mogą być potencjalnie wykorzystane do badania innych linii komórek nowotworowych i odpornościowych.
	<ol>
		<li>Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, kompletną pożywkę modyfikowaną L-glutaminą, 4,5 g/l D-glukozy i bez pirogronianu. Dodać 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (patrz tabela materiałów). Materiał należy wstępnie podgrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Zamrożone podwielokrotności BV2 i GL261 rozmrażać w łaźni wodnej (37 °C) przez 2 minuty, a tuż przed całkowitym rozmrożeniem przenieść je do okapu z przepływem laminarnym i umieścić komórki w dwóch różnych sterylnych kolbach T25 (po jednej dla każdej linii komórkowej).</li>
		<li>Inkubować kolby T25 w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do zlewania się kultury. 
		UWAGA: W zależności od warunków zamarzania i czasu kriokonserwacji, czas do zbiegania może się różnić. Te linie komórkowe zwykle potrzebują od 3 do 5 dni, aby osiągnąć zbieg w kolbie T75.</li>
		<li>Po tym, jak hodowla komórek BV2 zacznie się zlewać, przenieś ją do szkiełek 8-dołkowych 0,6 x 106 komórek/dołek. Szkiełka z 8-dołkową komorą należy przechowywać w inkubatorze przez 24 godziny.</li>
		<li>Po umieszczeniu komórek mikrogleju w 8-dołkowych szkiełkach komorowych powtórz ten sam protokół z komórkami GL261.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja mikrogleju za pomocą β-glukanów
	<ol>
		<li>Pokryj komórki BV2 czterema różnymi β-glukanami (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum i H. erinaceus) w stężeniu 0,2 mg/ml przez 72 godziny. Jeden warunek doświadczalny musi pozostać nieleczony (normalna pożywka), działając jako grupa kontrolna.</li>
		<li>Po 72 godzinach zebrać supernatant pipetą i przepuścić pozostałą objętość przez filtr strzykawkowy 0,20 μm. Następnie zawiesić supernatant w temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie GL261 wstępnie aktywowaną pożywką kondycjonowaną mikroglejem
	<ol>
		<li>Gdy GL261 zlewa się w 80% z szkiełkami w komorze 8-dołkowej, dodaj pożywkę mikroglejową nasączoną β glukanem (krok 2.2.2) o końcowym stężeniu objętościowym 25% przez 72 godziny (objętość całkowita: 250 μl/studzienkę).</li>
		<li>Po 72 godzinach inkubacji usunąć pożywkę i wyrzucić.</li>
		<li>Przemyć komórki roztworem soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS; pH 7,4, 0,1 M) trzy razy przez 5 minut.</li>
		<li>Utrwalić komórki, dodając 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze 4 °C przez 15 min. 
		UWAGA: W zależności od różnych przeciwciał, które mogą być stosowane do immunofluorescencji, metody wiązania mogą różnić się od typowych 4% PFA. Utrwalacze na bazie alkoholu mogą być bardziej skuteczne w zachowywaniu niektórych epitopów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie immunofluorescencyjne
	<ol>
		<li>Przemyć próbki PBS trytonem X (PBST; 0,01%) przez 10 minut trzy razy.</li>
		<li>Usunąć PBST i dodać albuminę surowicy bydlęcej (BSA) blokujący bufor 10% w PBST (Tabela 1) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć bufor blokujący i dodać 200 μl do studzienki PBS zawierającego mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych (przeciwciało monoklonalne Ki-67 w stosunku 1:500 szczura i przeciwciało kaspazy-3 w stosunku 1:500 u królika; patrz tabela materiałów). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 4 °C pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
		<li>Umyć studzienki trzy razy przez 10 minut za pomocą PBS na wytrząsarce (niska prędkość).</li>
		<li>Usunąć PBS i zastąpić 200 μl na studzienkę PBS zawierającego mieszaninę przeciwciał drugorzędowych (przeciwciało drugorzędowe 1:200 anty-szczurzo IgG (H + L) silnie adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488 i 1:200 przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L) silnie adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 647; patrz Tabela materiałów) przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Płukać próbki PBS przez 10 minut na wielofunkcyjnym wytrząsarce.</li>
		<li>Usunąć PBS i dodać 200 μl na basenik 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczonego w PBS (1:5,000) przez 1 min.</li>
		<li>Usuń DAPI (patrz Tabela materiałów) i myj komórki przez 5 minut w PBS.</li>
		<li>Usunąć ramkę studzienki i dodać 50 μl PBS:glicerolu (1:1) na każdą studzienkę i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci.</li>
		<li>Uzyskuj obrazy z powiększeniem 20x za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja i analiza proliferacji i apoptozy komórek nowotworowych
UWAGA: Aby zmierzyć potencjalny wpływ różnych β-glukanów na proliferację komórek nowotworowych i apoptozę, w oprogramowaniu ImageJ użyto wewnętrznego skryptu do ilościowego określenia liczby dodatnich pikseli Ki67 (proliferacja) i cCasp3 (apoptoza)13.
<ol>
	<li>Otwórz plik ImageJ. Kliknij przycisk Wtyczki. Kliknij na Coloc2, wtyczkę wcześniej zainstalowaną w folderze wtyczek, a na koniec wybierz obraz do analizy11. 
	UWAGA: Ta wtyczka została udostępniona po wcześniejszym kontakcie z dr Vasiliki Economopoulosem (veconom@uwo.ca). Zamiast skryptu, zarówno oprogramowanie ImageJ, jak i Fiji mają różne narzędzia do analizy kolokalizacji (patrz tabela materiałów), o podobnych właściwościach.</li>
	<li>Ustaw progi zgodnie z warunkami kontrolnymi (nieleczone, tylko DMEM). Kliknij przycisk OK. 
	UWAGA: Aby uniknąć rozbieżności w tle i intensywności, wszystkie zdjęcia muszą być wykonane w tych samych warunkach. Najlepiej, aby sesje obrazowania były wykonywane tego samego dnia, a parametry mikroskopu nie uległy zmianie na wszystkich obrazach.</li>
	<li>Upewnij się, że pojawią się wynikowe obrazy kolokalizowanych pikseli i okno podsumowania zawierające wartość procentową lub nieprzetworzoną liczbę pikseli powyżej progu. Znormalizować wyniki w odniesieniu do warunków kontrolnych (nieleczonych). 
	UWAGA: Wszystkie dane podane są jako średnia ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do tworzenia wykresów i analiz (patrz tabela materiałów). Zastosowano jednoczynnikową ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya. Błędy są reprezentowane jako błąd standardowy średniej (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).</li>
</ol>

<ol><li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+to+curing+primary+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li>
<li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+glioblastoma%3A+current+understanding+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561(2021).</li>
<li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2Fmicroglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775(2021).</li>
<li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+%26%2334%3Bcold%26%2334%3B+into+%26%2334%3Bhot%26%2334%3B+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Turning &#34;cold&#34; into &#34;hot&#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163(2019).</li>
<li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412(2021).</li>
<li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li>
<li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+medicinal+fungi-derived+%CE%B2-glucan+on+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250(2021).</li>
<li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology & Oncology. 2, 25(2009).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li>
<li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li>
<li>Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li>
<li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lowry+method+for+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li>
<li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173(2020).</li>
<li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10(2018).</li>
<li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Agricultural+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li>
<li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edible+mushrooms+and+beta-glucans%3A+impact+on+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195(2021).</li>
<li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Sciences+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li>
<li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies%3A+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Research+International%22%5BJournal%5D)">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li>
<li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7(2021).</li>
<li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer%3A+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12%2C155+patients%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li>
<li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li>
<li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li>
<li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li>
</ol>

Nie ma sprzecznych interesów, które można by zadeklarować.

W pracy opisano zastosowanie dobrze znanych technik do skutecznego izolowania, oczyszczania i charakteryzowania zawartości SβG z czterech różnych grzybów. Wyniki pokazały, że po ekstrakcji SMP gorącą wodą, uzyskanych z P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum i H. erinaceus, a następnie leczeniu hydrolitycznym α-amylazą, glukozydazą i proteazą, zawartość α-glukanu i białka została zmniejszona, co znacznie wzbogaciło ilość czystych SβGs.
Mimo to zaobserwowaliśmy, ...

Pomimo pojawienia się nowych osiągnięć w dziedzinie neuroonkologii, oczekiwana długość życia pacjentów z glejakiem pozostaje niewielka. Złoty standard terapii przeciwko nowotworom mózgu opiera się na połączeniu chirurgii, radioterapii i chemioterapii. Jednak w ciągu ostatniej dekady immunoterapia stała się potężną strategią leczenia różnych rodzajów raka1. W związku z tym możliwość wykorzystania odpowiedzi immunologicznej organizmu przeciwko komórkom nowotworowym stała się ostatnio czwartym filarem onkologii.
Od dawna wiadomo, że jednym z największych wyzwań w tej dziedzinie jest pokonanie silnej immunosupresji występującej w mikrośrodowisku guza2. Szczególnie w przypadku glejaka, jednej z najczęstszych i najbardziej agresywnych postaci raka mózgu, odkrycie kluczowych szlaków, które koordynują takie pronowotworowe scenariusze i znalezienie nowych związków, które mogłyby przeciwdziałać depresyjnej odpowiedzi układu odpornościowego, może utorować drogę przyszłym terapiom przeciwko tej nieuleczalnej chorobie.
Mózg posiada własne komórki układu odpornościowego, a najbardziej odpowiednim typem komórek jest mikroglej. Udowodniono, że komórki te zachowują się dość złożysto w różnych chorobach centralnych3. W przypadku pierwotnych guzów mózgu (np. glejaka) komórki te są przesunięte w kierunku fenotypu przeciwzapalnego, który wspiera komórki nowotworowe w kolonizacji miąższu mózgu3. Liczne publikacje podkreśliły główną rolę tych komórek podczas progresji guza. Jednym z głównych powodów takiego stanu rzeczy jest to, że mikroglej związany z glejakiem i naciekane makrofagi (GAM) stanowią jedną trzecią całkowitej masy guza, co sugeruje jednoznaczny wpływ ich stanów aktywacji podczas progresji guza mózgu4,5.
W tym duchu, β-glukany grzybów zostały opisane jako silne cząsteczki wywołujące skuteczne reakcje immunologiczne, w tym fagocytozę i produkcję czynników prozapalnych, prowadzące do eliminacji czynników szkodliwych6,7,8,9,10. Grzybowe β-glukany były na ogół badane przy użyciu ekstraktów z różnych części grzybów. Przypisanie konkretnych efektów wymaga jednak jego oczyszczenia, aby uniknąć niejasności i móc zrozumieć mechanizm działania takich cząsteczek jak czynniki immunomodulujące8.
W tej pracy, rozpuszczalne β-glukany są oczyszczane z owocnika czterech różnych grzybów, regularnie stosowanych jako grzyby jadalne (Pleurotus ostreatus i Pleurotus djamor) oraz lecznicze (Ganoderma lucidum i Hericium erinaceus). W szczególności te cztery grzyby mają duże zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym i zostały wyprodukowane w przyjaznej dla środowiska gospodarce o obiegu zamkniętym w przedsiębiorstwie komercyjnym (patrz tabela materiałów).
Aby położyć podwaliny pod przyszłe zastosowanie grzybów β-glukanów w terapiach raka mózgu, niezbędne są dobrze zdefiniowane strategie oczyszczania i badania przedkliniczne zagłębiające się w ich domniemaną interakcję z komórkami układu odpornościowego, aby ocenić ich potencjalną rolę jako mediatorów przeciwnowotworowych. Praca ta opisuje liczne etapy izolacji i oczyszczania potrzebne do odzyskania rozpuszczalnych β-glukanów zawartych w owocnikach wybranego grzyba. Po pomyślnym oczyszczeniu komórki mikrogleju są aktywowane w celu wzmocnienia ich fenotypu zapalnego. Mysie komórki glejaka wielopostaciowego (GL261) są powlekane innym podłożem kondycjonowanym przez mikroglej, wcześniej traktowanym tymi ekstraktami, a następnie oceniany jest jego wpływ na zachowanie komórek nowotworowych. Co ciekawe, badania pilotażowe z naszego laboratorium (dane nie pokazane) ujawniły, w jaki sposób prozapalny mikroglej może spowolnić migrację komórek nowotworowych i właściwości inwazji nie tylko w komórkach glejaka, ale także w innych liniach komórek nowotworowych. Ta multidyscyplinarna praca może stanowić użyteczne narzędzie dla naukowców zajmujących się onkologią do testowania obiecujących związków zdolnych do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej w wielu różnych typach nowotworów.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka 8-dołkowe</td><td>Thermo Fisher, USA</td><td>171080</td><td></td></tr><tr><td>Piec suszący na powietrzu</td><td>J.P. Selecta S.A., Hiszpania</td><td>2000210</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Alcalase</td><td>Novozymes, Dania</td><td>proteaza</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32728</td><td></td></tr><tr><td>Młyn ostrzowy</td><td>Retsch, Niemcy</td><td>&nbsp; SM100</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>MERK, Niemcy</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Membrana rurkowa celulozowa</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>MERK, Niemcy</td><td>Eppendorf, 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Kolokacja plugginsów</td><td>ImageJ</td><td></td><td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&nbsp;)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MERK, Niemcy</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dextrans</td><td>Pharmacosmos, Holbalk, Dania</td><td>Dekstran 410, 80, 50</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s zmodyfikowany Eagle&acute; s medium, Gluta MAXTM</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>10564011</td><td></td></tr><tr><td>Extenda (&alpha;- amylaza/glukoamylaza)</td><td>Novozymes, Dania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>spektrometu FT-IR</td><td>Bruker-Vertex, Szwajcaria</td><td>VERTEX 70v</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do</td> <td>tworzenia wykresów i analizyGraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System H2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td><td>Inkubator HPLC</td><td></td>Waters 2695</tr><tr><td></td><td>Eppedorf</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy</td><td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td><td>725500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>MERK, Niemcy</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Crison, Barcelona, Hiszpania</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>1010-015</td><td></td></tr><tr><td>Królik Rozszczepiony Kaspaza-3 (Asp175)</td><td>Przeciwciało Abcam, Wielka Brytania</td><td>ab243998</td><td></td></tr><tr><td>Szczur Ki-67 Monoklonalny</td><td>Thermofisher, USA</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>B&uuml; chi Ib&eacute; rica S.L.U., Hiszpania</td><td>El Rotavapor R-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-hydrożelowa liniowa kolumna do filtracji żelowej (300 mm x 7,8 mm)</td><td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td><td>WAT011545</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV</td><td>Amersham Bioscience, Wielka Brytania</td><td>Ultrospec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Laboratories, C.A, USA</td><td>H-5000-60</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>J.P. Selecta S.A., Hiszpania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 7 DUO.</td><td>Zeiss, Niemcy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&beta;-glukan Zestaw testowy</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlandia</td><td>K-BGLU</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glukany</td><td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td><td></td><td>Dostarczono cztery warianty grzybów</td></tr></tbody></table>

izolacja i oczyszczanie β-glukanu grzybów jako strategia immunoterapii glejaka

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Jednym z największych wyzwań w opracowywaniu skutecznych terapii przeciwko glejakowi jest pokonanie silnej supresji immunologicznej w mikrośrodowisku guza. Immunoterapia stała się skuteczną strategią odwracania odpowiedzi układu odpornościowego przeciwko komórkom nowotworowym. Makrofagi i mikroglej (GAM) związane z glejakiem są głównymi czynnikami napędzającymi takie scenariusze przeciwzapalne. W związku z tym wzmocnienie odpowiedzi przeciwnowotworowej w GAM może stanowić potencjalną terapię wspomagającą w leczeniu pacjentów z glejakiem. W tym duchu cząsteczki β-glukanu grzybów są od dawna znane jako silne modulatory odporności. Opisano ich zdolność do stymulowania wrodzonej aktywności immunologicznej i poprawy odpowiedzi na leczenie. Te cechy modulujące są częściowo przypisywane ich zdolności do wiązania się z receptorami rozpoznawania wzorców, które, co ciekawe, są silnie wyrażane w GAM. W związku z tym praca ta koncentruje się na izolacji, oczyszczaniu, a następnie stosowaniu β-glukanów grzybów w celu wzmocnienia odpowiedzi rakobójczej mikrogleju na komórki glejaka. Mysie linie komórkowe glejaka (GL261) i mikrogleju (BV-2) są wykorzystywane do testowania właściwości immunomodulujących czterech różnych β-glukanów grzybów ekstrahowanych z grzybów intensywnie stosowanych w obecnym przemyśle biofarmaceutycznym: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus i Ganoderma lucidum. Aby przetestować te związki, przeprowadzono testy kostymulacji w celu zmierzenia wpływu wstępnie aktywowanej pożywki kondycjonowanej mikroglejem na proliferację i aktywację apoptozy w komórkach glejaka.

Skuteczne oczyszczanie β-glukanów 
Masę MP, SMP i SβG otrzymanych z owocników P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum i H. erinaceus po procesie ekstrakcji i oczyszczania zestawiono w Tabeli 1. Podstawowy skład (całkowite węglowodany, β-glukany i białka) MP, SMP i SβG otrzymanych z grzybów przedstawiono w Tabeli 2. Wyniki te pokazują, że zastosowany protokół pozwolił na odzyskanie dużej ilości białek w SMP. Jednakże obróbka enzymatyczna...

Obecny protokół opisuje etapy oczyszczania i kolejne badania czterech różnych grzybów β-glukanów jako potencjalnych cząsteczek immunomodulujących, które wzmacniają właściwości przeciwnowotworowe mikrogleju przeciwko komórkom glejaka.

Izolacja i oczyszczanie β-glukanu grzybów jako strategia immunoterapii glejaka

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Beta-glukany grzybowe są ważnymi modulatorami układu odpornościowego. Poprawa protokołów czystości i izolacji ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia ich potencjalnej roli jako współadiuwantów w terapii przeciwnowotworowej. Wysoki stopień czterech różnych beta-glukanów osiągnięto przy użyciu różnych urządzeń powszechnie spotykanych w laboratoriach biologii molekularnej i proteomicznej.Protokół ten koncentruje się na testowaniu wpływu beta-glukanów na mikroglej, najliczniejszą rezydującą komórkę odpornościową mózgu. Modulowanie fenotypu mikrogleju w glejaku może przynieść ważne informacje na ten temat. Rozpocznij ekstrakcję rozpuszczalnych polisacharydów grzybowych lub SMP od pięciokrotnego przepłukania świeżych owocników Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus i Ganoderma lucidum wodą destylowaną.Następnie umyte owocniki całkowicie wysuszyć w temperaturze 50 stopni Celsjusza w konwencjonalnym piecu do suszenia powietrzem przez około 24 godziny, a następnie zmielić je w młynie ostrzowym, uzyskując około 200 gramów proszku z każdego grzyba. Następnie zawiesić 100 gramów wszystkich czterech proszków grzybowych lub MP w 1 000 mililitrach wody destylowanej i autoklawow

isolation-purification-fungal-glucan-as-an-immunotherapy-strategy-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Ten film demonstruje test in vitro wykorzystujący β-glukany do aktywacji komórek mikrogleju do produkcji rodników ponadtlenkowych, reaktywnych form tlenu. W komórkach raka mózgu generowane reaktywne utleniacze aktywnie hamują proliferację komórek nowotworowych i indukują śmierć komórki.

Test do analizy testowego β-glukanu jako strategii immunoterapii przeciwko komórkom raka mózgu

Film pokazuje izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z mózgu myszy za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego. Następnie następuje wirowanie w gradiencie gęstości w celu zebrania komórek odpornościowych do dalszej analizy.

Izolowanie komórek odpornościowych naciekających nowotwór z mysiego mózgu

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Limfodepletywne i immunomodulacyjne efekty standardu leczenia chemioterapią i radioterapią mogą być wykorzystane do zwiększenia skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii limfocytami T. Przedstawiamy metodę generowania limfocytów T receptora antygenu chimerycznego (CAR) specyficznych dla EGFRvIII i podawania ich w kontekście standardowej opieki nad glejakiem.

Wytwarzanie limfocytów CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Terapeutyczne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obiecujące jako metoda leczenia inwazyjnego glejaka. Optymalna transplantacja polega na dostarczeniu MSCs do jamy resekcji guza na rusztowaniach. W tym miejscu przedstawiono techniki przedkliniczne do badania leczenia glejaka wielopostaciowego MSC, w tym: resekcja guza pod kontrolą obrazu; wszczepianie rusztowań z nasionami MSC; i śledzenie terapii pooperacyjnej.

Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Poznaj metodę izolacji i oczyszczania β-glukanów grzybowych w celu immunoterapii glejaka. Protokół obejmuje ekstrakcję z Pleurotus ostreatus, Ganoderma lucidum i innych gatunków oraz analizę wpływu na komórki mikrogleju BV2.

Izolacja i oczyszczanie β-glukanu grzybów jako strategia immunoterapii glejaka

Przeglądaj więcej filmów