Name: Izolacja i oczyszczanie β-glukanu grzybów jako strategia immunoterapii glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę izolacji i oczyszczania β-glukanów grzybowych w celu immunoterapii glejaka. Protokół obejmuje ekstrakcję z Pleurotus ostreatus, Ganoderma lucidum i innych gatunków oraz analizę wpływu na komórki mikrogleju BV2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Vasiliki Economopoulos za jej wewnętrzny skrypt do pomiaru sygnału fuluorescencji w ImageJ. Chcielibyśmy również podziękować CITIUS (Uniwersytet w Sewilli) i całemu personelowi za wsparcie podczas demonstracji. Prace te były wspierane przez hiszpański FEDER I + D + i-USE, US-1264152 z Uniwersytetu w Sewilli oraz Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

Cztery różne warianty grzybów opisane w tym protokole zostały uzyskane z komercyjnego źródła (zobacz Tabelę Materiałów).
1. Izolacja β-glukanów grzybów
<ol>
	<li>Ekstrakcja i izolacja rozpuszczalnych polisacharydów grzybowych 
	UWAGA: Rozpuszczalne polisacharydy grzybowe (SMP) otrzymano zgodnie z procedurą schematycznie pokazaną w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
	<ol>
		<li>Delikatnie opłucz świeże owocniki P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus i G. lucidum (około 2,000 g/grzyb) w wodzie destylowanej pięć razy.</li>
		<li>Wysuszyć owocniki w temperaturze 50 ± 2 °C w konwencjonalnym piecu do suszenia na powietrzu, aż do osiągnięcia stałej wagi (~24 h).</li>
		<li>Zmielić suszone grzyby w młynku ostrzowym, uzyskując około 200 g proszku z każdego grzyba.</li>
		<li>Zawiesić 100 g proszku grzybowego (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus i G. lucidum) w 1,000 ml H2Od. Następnie sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut, a na koniec pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
		<li>Odwirować otrzymaną zawiesinę o sile 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wysuszyć osad zawierający nierozpuszczalne polisacharydy grzybowe (IMP) w temperaturze 50 ± 2 °C w suszarce powietrznej przez 24 godziny.</li>
		<li>Odrzucić osad i zachować supernatant. Zagęścić supernatant 10 razy w wyparce obrotowej.</li>
		<li>Wytrącić koncentrat zawierający OMP etanolem (80% stężenia końcowego) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę etanolu o stężeniu 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, zatrzymać osad i odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
		<li>Przemyć osad trzykrotnie 80% etanolem przed rozpuszczeniem go wH2Od (10% w/v). Ustaw pH na 6,5/7, a temperaturę na 37 °C i potraktuj odpowiednio 2 U i 4 U α-amylazy i glukoamylazy w celu rozpuszczenia α-glukanów zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Po poddaniu działaniu α-amylazy/glukoamylazy należy dostosować pH i temperaturę odpowiednio do 8,0 i 50 °C, a następnie potraktować alkazą (2,5 U/g białka) (patrz Tabela Materiałów) w celu rozpuszczenia białek. 
		UWAGA: Ta sekwencyjna obróbka enzymatyczna usuwa większość α-glukanów i białek, które współwytrącają się z β-glukanami w wytrącaniu etanolu.</li>
		<li>Po hydrolizie odwirować hydrolizat o sile 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie pięciokrotnie zagęścić czysty supernatant w wyparce obrotowej. Wytrącić ponownie 80% etanolem.</li>
		<li>Powstały osad należy rozpuścić w H2Od i dializować w wodzie destylowanej przez 24 godziny za pomocą membran rurkowych z celulozy (membrany odcinające 12 000 Da; patrz tabela materiałów) w celu usunięcia cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej. Odzyskaj część rozpuszczalną w wodzie i liofilizuj ją, aby uzyskać rozpuszczalne β-glukany (SβG).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar cukru i białka
	<ol>
		<li>Zmierzyć całkowitą zawartość cukru w każdej frakcji metodą kwasu fenolowo-siarkowego, używając glukozy jako standardu8. 
		UWAGA: Kwantyfikacja zawartości β-glukanu może być również przeprowadzona przy użyciu zestawu do oznaczania β-glukanu (grzyby i drożdże; patrz Tabela materiałów), w oparciu o hydrolizę enzymatyczną i aktywność oksydoreduktaz: mianowicie egzo-1,3-β-glukanazy, oksydazy glukozowej, β-glukozydazy i peroksydazy, a następnie tworzenia chinoneiminy. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, z niewielkimi modyfikacjami.</li>
		<li>Użyj 18 MH2SO4 zamiast 12 MH2SO4.</li>
		<li>Oceń zawartość wszystkich glukanów i α-glukanów oddzielnie.</li>
		<li>Zmierz wynikowe wartości β-glukanu jako różnicę między całkowitymi wartościami glukanu i α-glukanu (potrójnego) zgodnie z protokołem Kjeldahla. W niektórych przypadkach zawartość białka można określić metodą Lowry'ego, używając albuminy do wykreślenia krzywej kalibracyjnej11,12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza spektroskopii absorpcyjnej w ultrafiolecie
	<ol>
		<li>Widma ultrafioletu (UV) SβG należy uzyskać za pomocą spektrofotometru UV-widzialnego (patrz tabela materiałów), skanując próbki w zakresie 200-400 nm (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Przygotować 1,0 mg/ml każdego SβG wH2Od, przenieść roztwór do kuwety kwarcowej i zeskanować w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza rozkładu masy cząsteczkowej
	<ol>
		<li>Oszacować jednorodność SβGs i masę cząsteczkową polimerów za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) przy użyciu systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (patrz tabela materiałów) wyposażonego w detektor indeksu refrakcji i ultrahydrożelową liniową kolumnę filtracyjną żelu (300 mm x 7,8 mm; <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Przeprowadzić test w temperaturze 40 °C, używając wody dejonizowanej jako eluentu o natężeniu przepływu 0,5 ml/min-1 i dekstransu (110, 80 i 50 kDa) jako wzorców (patrz Tabela materiałów). Zbierz frakcję o pojemności 5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR)
	<ol>
		<li>Zapisz widma podczerwieni (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) na spektrometrze FTIR w zakresie 4000-500 cm-1. Próbki należy wcześniej wymieszać z KBr w celu utworzenia folii (standardowa procedura FTIR; patrz instrukcje producenta i tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza składu molekularnego
	<ol>
		<li>Oszacuj skład molekularny SβG za pomocą wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC) oraz chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS), zgodnie ze standardowymi procedurami12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Badanie in vitro stymulacji mikrogleju indukowanej β-glukanem
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa mysiego glejaka i komórek mikrogleju w szkiełkach 8-dołkowych 
	UWAGA: Ten protokół jest specyficzny dla linii komórkowych GL261 (glejak) i BV2 (mikroglej). Jednak z niewielkimi modyfikacjami kroki te mogą być potencjalnie wykorzystane do badania innych linii komórek nowotworowych i odpornościowych.
	<ol>
		<li>Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, kompletną pożywkę modyfikowaną L-glutaminą, 4,5 g/l D-glukozy i bez pirogronianu. Dodać 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (patrz tabela materiałów). Materiał należy wstępnie podgrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Zamrożone podwielokrotności BV2 i GL261 rozmrażać w łaźni wodnej (37 °C) przez 2 minuty, a tuż przed całkowitym rozmrożeniem przenieść je do okapu z przepływem laminarnym i umieścić komórki w dwóch różnych sterylnych kolbach T25 (po jednej dla każdej linii komórkowej).</li>
		<li>Inkubować kolby T25 w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do zlewania się kultury. 
		UWAGA: W zależności od warunków zamarzania i czasu kriokonserwacji, czas do zbiegania może się różnić. Te linie komórkowe zwykle potrzebują od 3 do 5 dni, aby osiągnąć zbieg w kolbie T75.</li>
		<li>Po tym, jak hodowla komórek BV2 zacznie się zlewać, przenieś ją do szkiełek 8-dołkowych 0,6 x 106 komórek/dołek. Szkiełka z 8-dołkową komorą należy przechowywać w inkubatorze przez 24 godziny.</li>
		<li>Po umieszczeniu komórek mikrogleju w 8-dołkowych szkiełkach komorowych powtórz ten sam protokół z komórkami GL261.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja mikrogleju za pomocą β-glukanów
	<ol>
		<li>Pokryj komórki BV2 czterema różnymi β-glukanami (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum i H. erinaceus) w stężeniu 0,2 mg/ml przez 72 godziny. Jeden warunek doświadczalny musi pozostać nieleczony (normalna pożywka), działając jako grupa kontrolna.</li>
		<li>Po 72 godzinach zebrać supernatant pipetą i przepuścić pozostałą objętość przez filtr strzykawkowy 0,20 μm. Następnie zawiesić supernatant w temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie GL261 wstępnie aktywowaną pożywką kondycjonowaną mikroglejem
	<ol>
		<li>Gdy GL261 zlewa się w 80% z szkiełkami w komorze 8-dołkowej, dodaj pożywkę mikroglejową nasączoną β glukanem (krok 2.2.2) o końcowym stężeniu objętościowym 25% przez 72 godziny (objętość całkowita: 250 μl/studzienkę).</li>
		<li>Po 72 godzinach inkubacji usunąć pożywkę i wyrzucić.</li>
		<li>Przemyć komórki roztworem soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS; pH 7,4, 0,1 M) trzy razy przez 5 minut.</li>
		<li>Utrwalić komórki, dodając 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze 4 °C przez 15 min. 
		UWAGA: W zależności od różnych przeciwciał, które mogą być stosowane do immunofluorescencji, metody wiązania mogą różnić się od typowych 4% PFA. Utrwalacze na bazie alkoholu mogą być bardziej skuteczne w zachowywaniu niektórych epitopów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie immunofluorescencyjne
	<ol>
		<li>Przemyć próbki PBS trytonem X (PBST; 0,01%) przez 10 minut trzy razy.</li>
		<li>Usunąć PBST i dodać albuminę surowicy bydlęcej (BSA) blokujący bufor 10% w PBST (Tabela 1) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć bufor blokujący i dodać 200 μl do studzienki PBS zawierającego mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych (przeciwciało monoklonalne Ki-67 w stosunku 1:500 szczura i przeciwciało kaspazy-3 w stosunku 1:500 u królika; patrz tabela materiałów). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 4 °C pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
		<li>Umyć studzienki trzy razy przez 10 minut za pomocą PBS na wytrząsarce (niska prędkość).</li>
		<li>Usunąć PBS i zastąpić 200 μl na studzienkę PBS zawierającego mieszaninę przeciwciał drugorzędowych (przeciwciało drugorzędowe 1:200 anty-szczurzo IgG (H + L) silnie adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488 i 1:200 przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L) silnie adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 647; patrz Tabela materiałów) przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Płukać próbki PBS przez 10 minut na wielofunkcyjnym wytrząsarce.</li>
		<li>Usunąć PBS i dodać 200 μl na basenik 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczonego w PBS (1:5,000) przez 1 min.</li>
		<li>Usuń DAPI (patrz Tabela materiałów) i myj komórki przez 5 minut w PBS.</li>
		<li>Usunąć ramkę studzienki i dodać 50 μl PBS:glicerolu (1:1) na każdą studzienkę i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci.</li>
		<li>Uzyskuj obrazy z powiększeniem 20x za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja i analiza proliferacji i apoptozy komórek nowotworowych
UWAGA: Aby zmierzyć potencjalny wpływ różnych β-glukanów na proliferację komórek nowotworowych i apoptozę, w oprogramowaniu ImageJ użyto wewnętrznego skryptu do ilościowego określenia liczby dodatnich pikseli Ki67 (proliferacja) i cCasp3 (apoptoza)13.
<ol>
	<li>Otwórz plik ImageJ. Kliknij przycisk Wtyczki. Kliknij na Coloc2, wtyczkę wcześniej zainstalowaną w folderze wtyczek, a na koniec wybierz obraz do analizy11. 
	UWAGA: Ta wtyczka została udostępniona po wcześniejszym kontakcie z dr Vasiliki Economopoulosem (veconom@uwo.ca). Zamiast skryptu, zarówno oprogramowanie ImageJ, jak i Fiji mają różne narzędzia do analizy kolokalizacji (patrz tabela materiałów), o podobnych właściwościach.</li>
	<li>Ustaw progi zgodnie z warunkami kontrolnymi (nieleczone, tylko DMEM). Kliknij przycisk OK. 
	UWAGA: Aby uniknąć rozbieżności w tle i intensywności, wszystkie zdjęcia muszą być wykonane w tych samych warunkach. Najlepiej, aby sesje obrazowania były wykonywane tego samego dnia, a parametry mikroskopu nie uległy zmianie na wszystkich obrazach.</li>
	<li>Upewnij się, że pojawią się wynikowe obrazy kolokalizowanych pikseli i okno podsumowania zawierające wartość procentową lub nieprzetworzoną liczbę pikseli powyżej progu. Znormalizować wyniki w odniesieniu do warunków kontrolnych (nieleczonych). 
	UWAGA: Wszystkie dane podane są jako średnia ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do tworzenia wykresów i analiz (patrz tabela materiałów). Zastosowano jednoczynnikową ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya. Błędy są reprezentowane jako błąd standardowy średniej (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).</li>
</ol>

<ol><li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+to+curing+primary+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li>
<li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+glioblastoma%3A+current+understanding+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561(2021).</li>
<li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2Fmicroglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775(2021).</li>
<li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+%26%2334%3Bcold%26%2334%3B+into+%26%2334%3Bhot%26%2334%3B+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Turning &#34;cold&#34; into &#34;hot&#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163(2019).</li>
<li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412(2021).</li>
<li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li>
<li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+medicinal+fungi-derived+%CE%B2-glucan+on+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250(2021).</li>
<li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology & Oncology. 2, 25(2009).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li>
<li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li>
<li>Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li>
<li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lowry+method+for+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li>
<li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173(2020).</li>
<li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10(2018).</li>
<li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Agricultural+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li>
<li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edible+mushrooms+and+beta-glucans%3A+impact+on+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195(2021).</li>
<li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Sciences+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li>
<li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies%3A+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Research+International%22%5BJournal%5D)">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li>
<li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7(2021).</li>
<li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer%3A+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12%2C155+patients%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li>
<li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li>
<li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li>
<li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li>
</ol>

Nie ma sprzecznych interesów, które można by zadeklarować.

W pracy opisano zastosowanie dobrze znanych technik do skutecznego izolowania, oczyszczania i charakteryzowania zawartości SβG z czterech różnych grzybów. Wyniki pokazały, że po ekstrakcji SMP gorącą wodą, uzyskanych z P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum i H. erinaceus, a następnie leczeniu hydrolitycznym α-amylazą, glukozydazą i proteazą, zawartość α-glukanu i białka została zmniejszona, co znacznie wzbogaciło ilość czystych SβGs.
Mimo to zaobserwowaliśmy, ...

Pomimo pojawienia się nowych osiągnięć w dziedzinie neuroonkologii, oczekiwana długość życia pacjentów z glejakiem pozostaje niewielka. Złoty standard terapii przeciwko nowotworom mózgu opiera się na połączeniu chirurgii, radioterapii i chemioterapii. Jednak w ciągu ostatniej dekady immunoterapia stała się potężną strategią leczenia różnych rodzajów raka1. W związku z tym możliwość wykorzystania odpowiedzi immunologicznej organizmu przeciwko komórkom nowotworowym stała się ostatnio czwartym filarem onkologii.
Od dawna wiadomo, że jednym z największych wyzwań w tej dziedzinie jest pokonanie silnej immunosupresji występującej w mikrośrodowisku guza2. Szczególnie w przypadku glejaka, jednej z najczęstszych i najbardziej agresywnych postaci raka mózgu, odkrycie kluczowych szlaków, które koordynują takie pronowotworowe scenariusze i znalezienie nowych związków, które mogłyby przeciwdziałać depresyjnej odpowiedzi układu odpornościowego, może utorować drogę przyszłym terapiom przeciwko tej nieuleczalnej chorobie.
Mózg posiada własne komórki układu odpornościowego, a najbardziej odpowiednim typem komórek jest mikroglej. Udowodniono, że komórki te zachowują się dość złożysto w różnych chorobach centralnych3. W przypadku pierwotnych guzów mózgu (np. glejaka) komórki te są przesunięte w kierunku fenotypu przeciwzapalnego, który wspiera komórki nowotworowe w kolonizacji miąższu mózgu3. Liczne publikacje podkreśliły główną rolę tych komórek podczas progresji guza. Jednym z głównych powodów takiego stanu rzeczy jest to, że mikroglej związany z glejakiem i naciekane makrofagi (GAM) stanowią jedną trzecią całkowitej masy guza, co sugeruje jednoznaczny wpływ ich stanów aktywacji podczas progresji guza mózgu4,5.
W tym duchu, β-glukany grzybów zostały opisane jako silne cząsteczki wywołujące skuteczne reakcje immunologiczne, w tym fagocytozę i produkcję czynników prozapalnych, prowadzące do eliminacji czynników szkodliwych6,7,8,9,10. Grzybowe β-glukany były na ogół badane przy użyciu ekstraktów z różnych części grzybów. Przypisanie konkretnych efektów wymaga jednak jego oczyszczenia, aby uniknąć niejasności i móc zrozumieć mechanizm działania takich cząsteczek jak czynniki immunomodulujące8.
W tej pracy, rozpuszczalne β-glukany są oczyszczane z owocnika czterech różnych grzybów, regularnie stosowanych jako grzyby jadalne (Pleurotus ostreatus i Pleurotus djamor) oraz lecznicze (Ganoderma lucidum i Hericium erinaceus). W szczególności te cztery grzyby mają duże zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym i zostały wyprodukowane w przyjaznej dla środowiska gospodarce o obiegu zamkniętym w przedsiębiorstwie komercyjnym (patrz tabela materiałów).
Aby położyć podwaliny pod przyszłe zastosowanie grzybów β-glukanów w terapiach raka mózgu, niezbędne są dobrze zdefiniowane strategie oczyszczania i badania przedkliniczne zagłębiające się w ich domniemaną interakcję z komórkami układu odpornościowego, aby ocenić ich potencjalną rolę jako mediatorów przeciwnowotworowych. Praca ta opisuje liczne etapy izolacji i oczyszczania potrzebne do odzyskania rozpuszczalnych β-glukanów zawartych w owocnikach wybranego grzyba. Po pomyślnym oczyszczeniu komórki mikrogleju są aktywowane w celu wzmocnienia ich fenotypu zapalnego. Mysie komórki glejaka wielopostaciowego (GL261) są powlekane innym podłożem kondycjonowanym przez mikroglej, wcześniej traktowanym tymi ekstraktami, a następnie oceniany jest jego wpływ na zachowanie komórek nowotworowych. Co ciekawe, badania pilotażowe z naszego laboratorium (dane nie pokazane) ujawniły, w jaki sposób prozapalny mikroglej może spowolnić migrację komórek nowotworowych i właściwości inwazji nie tylko w komórkach glejaka, ale także w innych liniach komórek nowotworowych. Ta multidyscyplinarna praca może stanowić użyteczne narzędzie dla naukowców zajmujących się onkologią do testowania obiecujących związków zdolnych do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej w wielu różnych typach nowotworów.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka 8-dołkowe</td><td>Thermo Fisher, USA</td><td>171080</td><td></td></tr><tr><td>Piec suszący na powietrzu</td><td>J.P. Selecta S.A., Hiszpania</td><td>2000210</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Alcalase</td><td>Novozymes, Dania</td><td>proteaza</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32728</td><td></td></tr><tr><td>Młyn ostrzowy</td><td>Retsch, Niemcy</td><td>&nbsp; SM100</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>MERK, Niemcy</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Membrana rurkowa celulozowa</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>MERK, Niemcy</td><td>Eppendorf, 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Kolokacja plugginsów</td><td>ImageJ</td><td></td><td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&nbsp;)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MERK, Niemcy</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dextrans</td><td>Pharmacosmos, Holbalk, Dania</td><td>Dekstran 410, 80, 50</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s zmodyfikowany Eagle&acute; s medium, Gluta MAXTM</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>10564011</td><td></td></tr><tr><td>Extenda (&alpha;- amylaza/glukoamylaza)</td><td>Novozymes, Dania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>spektrometu FT-IR</td><td>Bruker-Vertex, Szwajcaria</td><td>VERTEX 70v</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do</td> <td>tworzenia wykresów i analizyGraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System H2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td><td>Inkubator HPLC</td><td></td>Waters 2695</tr><tr><td></td><td>Eppedorf</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy</td><td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td><td>725500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>MERK, Niemcy</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Crison, Barcelona, Hiszpania</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>1010-015</td><td></td></tr><tr><td>Królik Rozszczepiony Kaspaza-3 (Asp175)</td><td>Przeciwciało Abcam, Wielka Brytania</td><td>ab243998</td><td></td></tr><tr><td>Szczur Ki-67 Monoklonalny</td><td>Thermofisher, USA</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>B&uuml; chi Ib&eacute; rica S.L.U., Hiszpania</td><td>El Rotavapor R-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-hydrożelowa liniowa kolumna do filtracji żelowej (300 mm x 7,8 mm)</td><td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td><td>WAT011545</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV</td><td>Amersham Bioscience, Wielka Brytania</td><td>Ultrospec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Laboratories, C.A, USA</td><td>H-5000-60</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>J.P. Selecta S.A., Hiszpania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 7 DUO.</td><td>Zeiss, Niemcy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&beta;-glukan Zestaw testowy</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlandia</td><td>K-BGLU</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glukany</td><td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td><td></td><td>Dostarczono cztery warianty grzybów</td></tr></tbody></table>

izolacja i oczyszczanie β-glukanu grzybów jako strategia immunoterapii glejaka

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Jednym z największych wyzwań w opracowywaniu skutecznych terapii przeciwko glejakowi jest pokonanie silnej supresji immunologicznej w mikrośrodowisku guza. Immunoterapia stała się skuteczną strategią odwracania odpowiedzi układu odpornościowego przeciwko komórkom nowotworowym. Makrofagi i mikroglej (GAM) związane z glejakiem są głównymi czynnikami napędzającymi takie scenariusze przeciwzapalne. W związku z tym wzmocnienie odpowiedzi przeciwnowotworowej w GAM może stanowić potencjalną terapię wspomagającą w leczeniu pacjentów z glejakiem. W tym duchu cząsteczki β-glukanu grzybów są od dawna znane jako silne modulatory odporności. Opisano ich zdolność do stymulowania wrodzonej aktywności immunologicznej i poprawy odpowiedzi na leczenie. Te cechy modulujące są częściowo przypisywane ich zdolności do wiązania się z receptorami rozpoznawania wzorców, które, co ciekawe, są silnie wyrażane w GAM. W związku z tym praca ta koncentruje się na izolacji, oczyszczaniu, a następnie stosowaniu β-glukanów grzybów w celu wzmocnienia odpowiedzi rakobójczej mikrogleju na komórki glejaka. Mysie linie komórkowe glejaka (GL261) i mikrogleju (BV-2) są wykorzystywane do testowania właściwości immunomodulujących czterech różnych β-glukanów grzybów ekstrahowanych z grzybów intensywnie stosowanych w obecnym przemyśle biofarmaceutycznym: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus i Ganoderma lucidum. Aby przetestować te związki, przeprowadzono testy kostymulacji w celu zmierzenia wpływu wstępnie aktywowanej pożywki kondycjonowanej mikroglejem na proliferację i aktywację apoptozy w komórkach glejaka.

Skuteczne oczyszczanie β-glukanów 
Masę MP, SMP i SβG otrzymanych z owocników P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum i H. erinaceus po procesie ekstrakcji i oczyszczania zestawiono w Tabeli 1. Podstawowy skład (całkowite węglowodany, β-glukany i białka) MP, SMP i SβG otrzymanych z grzybów przedstawiono w Tabeli 2. Wyniki te pokazują, że zastosowany protokół pozwolił na odzyskanie dużej ilości białek w SMP. Jednakże obróbka enzymatyczna...

Obecny protokół opisuje etapy oczyszczania i kolejne badania czterech różnych grzybów β-glukanów jako potencjalnych cząsteczek immunomodulujących, które wzmacniają właściwości przeciwnowotworowe mikrogleju przeciwko komórkom glejaka.

Izolacja i oczyszczanie β-glukanu grzybów jako strategia immunoterapii glejaka

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Beta-glukany grzybowe są ważnymi modulatorami układu odpornościowego. Poprawa protokołów czystości i izolacji ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia ich potencjalnej roli jako współadiuwantów w terapii przeciwnowotworowej. Wysoki stopień czterech różnych beta-glukanów osiągnięto przy użyciu różnych urządzeń powszechnie spotykanych w laboratoriach biologii molekularnej i proteomicznej.Protokół ten koncentruje się na testowaniu wpływu beta-glukanów na mikroglej, najliczniejszą rezydującą komórkę odpornościową mózgu. Modulowanie fenotypu mikrogleju w glejaku może przynieść ważne informacje na ten temat. Rozpocznij ekstrakcję rozpuszczalnych polisacharydów grzybowych lub SMP od pięciokrotnego przepłukania świeżych owocników Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus i Ganoderma lucidum wodą destylowaną.Następnie umyte owocniki całkowicie wysuszyć w temperaturze 50 stopni Celsjusza w konwencjonalnym piecu do suszenia powietrzem przez około 24 godziny, a następnie zmielić je w młynie ostrzowym, uzyskując około 200 gramów proszku z każdego grzyba. Następnie zawiesić 100 gramów wszystkich czterech proszków grzybowych lub MP w 1 000 mililitrach wody destylowanej i autoklawować zawiesinę w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować powstałą zawiesinę o stężeniu 6 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie suszyć osad zawierający nierozpuszczalne polisacharydy grzybowe lub IMP w temperaturze 50 stopni Celsjusza w piecu do suszenia powietrzem przez 24 godziny. Odrzucić osad i zagęścić supernatant 10 razy w wyparce obrotowej. Następnie wytrącić koncentrat zawierający SMP etanolem przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu zawiesiny etanolu o stężeniu 6 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wyrzucić supernatant za pomocą pipety i trzykrotnie przemyć osad 80% etanolem przed rozpuszczeniem go i wodą destylowaną. Dostosuj pH do 6,5 do 7, a temperaturę do 37 stopni Celsjusza i rozpuścić alfa-glukany, traktując zawiesinę odpowiednio dwiema jednostkami i czterema jednostkami alfa-amylazy i glukoamylazy. Następnie dostosuj pH do 8,0 i temperaturę do 50 stopni Celsjusza i rozpuszczaj białka, traktując zawiesinę alkalazą odpowiadającą 2,5 jednostki na gram białka.Po hydrolizie odwirować hydrolizat i pięciokrotnie oczyścić koncentrat supernatantu w wyparce obrotowej. Ponownie wytrącić koncentrat sklarowany nad osadem, dodając 80% etanolu. Aby usunąć cząsteczki o niskiej masie cząsteczkowej, rozpuszczono osad w wodzie destylowanej i dializowano go w wodzie destylowanej przez 24 godziny za pomocą membran rurkowych z odcięcia 12 000 daltonów.Odzyskaj część rozpuszczalną w wodzie i wysusz ją na liofilizacji, aby wytworzyć rozpuszczalne beta-glukany lub S beta-G. Oceń całkowitą zawartość glukanów i alfa-glukanów osobno. Zmierz wynikowe wartości beta-glukanu jako różnicę między całkowitymi wartościami glukanu i alfa-glukanu.Aby uzyskać widma UV S beta-G za pomocą spektrofotometru UV w zakresie widzialnym, należy przygotować 1,0 miligrama na mililitr każdego S beta-G w wodzie destylowanej. Przenieś próbkę do kuwety kwarcowej i zeskanuj w temperaturze pokojowej w zakresie od 200 do 400 nanometrów. Oszacować jednorodność S beta-G i masę cząsteczkową polimerów za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość lub SEC przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub systemu HPLC wyposażonego w detektor światła widzialnego UV i żelową kolumnę filtracyjną Superdex TM 200 10/300 GL.Zapisać widma próbki w podczerwieni na spektrometrze podczerwieni z transformacją Fouriera lub spektrometrze FTIR w zakresie od 4 000 do 500 centymetrów. Aktywuj mikroglej, pokrywając komórki mikrogleju BV2 przez 72 godziny stężeniem 0,2 miligrama na mililitr czterech różnych beta-glukanów wyizolowanych z P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum i H.erinaceus. Po 72 godzinach zebrać sklarowany osad za pomocą pipety i przepuścić pozostałą objętość przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,20 mikrometra.Następnie zamrozić supernatant w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej 24 godziny. Aby potraktować GL 261 wstępnie aktywowaną pożywką kondycjonowaną mikroglejem, dodaj 250 mikrolitrów pożywki mikroglejowej poddanej działaniu beta-glukanu do 80% zlewających się komórek GL 261 przez 72 godziny. Wyrzuć pożywkę po 72 godzinach.Widma UV różnych S beta-G nie wykazały pików absorpcji UV przy 260 i 280 nanometrach, co wskazuje, że S beta-G nie zawierały kwasów nukleinowych i białek. Chromatogramy HPLC wykazały dobrą jednorodność z głównym ostrym i pojedynczym pikiem po 10,9 minucie dla P.ostreatus, 10,5 minuty dla lucidum, 11,3 minuty dla P.djamor i 8,20 minuty dla H. erinaceus, co sugeruje, że frakcja jest zgodna z homopolimerami. Widma FTIR mierzyły drgania molekularne odpowiadające kowalencyjnym wiązaniom polisacharydowym.Okazało się, że SS beta-G składały się z węglowodanów sprzężonych z minimalną ilością białka. HPTLC i GC-MS analizując profil monosacharydowy S beta-G wykazały obecność dużej ilości D-glukozy, mniejszych ilości D-galaktozy i D-mannozy oraz śladowych ilości D-ksylozy, D-ramnozy, D-fukozy i L-arabinozy. Korzystając z wewnętrznego skryptu w oprogramowaniu ImageJ, określono ilościowo liczbę pikseli dodatnich dla każdego kanału fluorescencyjnego.Skrypt wykorzystał próbki kontrolne jako próg intensywności każdego fluoroforu i podał liczbę pikseli. Wskazywał on ekspresję dla każdego markera po różnych warunkach eksperymentalnych. Co ciekawe, GL 261 nie doznał znaczących różnic w zakresie proliferacji guza po ekspozycji na różne pożywki kondycjonowane mikroglejem.Jednak P.djamor i H.erinaceus wykazały silną indukcję odpowiednio około sześciokrotnego i dziewięciokrotnego wzrostu rozszczepionej kaspazy-3. Zapewnienie wysokiej jakości czystości beta-glukanów jest niezbędne dla tego protokołu. Protokół ten wykorzystuje zaawansowany sprzęt, taki jak spektrofotometr, HPLC.lub FITR. Korzystanie z tych narzędzi zwiększa wiarygodność naszych ustaleń. Możemy śmiało analizować wpływ beta-glukanów na mikroglej i uzyskiwać pewniejsze wyniki.Ze względu na ograniczenia czasowe i światowe ograniczyliśmy nasz protokół do badania beta-glukanów na komórkach mikrogleju. Jednak inne komórki układu odpornościowego, takie jak makrofagi lub limfocyty T, mogą być łatwo dostępne podczas tego protokołu. Po raz pierwszy protokoły te łączą dwie różne dziedziny wiedzy.Po pierwsze, zastosowanie procedury biotechnologicznej do oczyszczania określonych produktów, a po drugie, zastosowanie technik hodowli komórkowych w celu zbadania ich właściwości immunomodulacyjnych.

isolation-purification-fungal-glucan-as-an-immunotherapy-strategy-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Ten film demonstruje test in vitro wykorzystujący β-glukany do aktywacji komórek mikrogleju do produkcji rodników ponadtlenkowych, reaktywnych form tlenu. W komórkach raka mózgu generowane reaktywne utleniacze aktywnie hamują proliferację komórek nowotworowych i indukują śmierć komórki.

Test do analizy testowego β-glukanu jako strategii immunoterapii przeciwko komórkom raka mózgu

Film pokazuje izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z mózgu myszy za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego. Następnie następuje wirowanie w gradiencie gęstości w celu zebrania komórek odpornościowych do dalszej analizy.

Izolowanie komórek odpornościowych naciekających nowotwór z mysiego mózgu

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Limfodepletywne i immunomodulacyjne efekty standardu leczenia chemioterapią i radioterapią mogą być wykorzystane do zwiększenia skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii limfocytami T. Przedstawiamy metodę generowania limfocytów T receptora antygenu chimerycznego (CAR) specyficznych dla EGFRvIII i podawania ich w kontekście standardowej opieki nad glejakiem.

Wytwarzanie limfocytów CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Terapeutyczne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obiecujące jako metoda leczenia inwazyjnego glejaka. Optymalna transplantacja polega na dostarczeniu MSCs do jamy resekcji guza na rusztowaniach. W tym miejscu przedstawiono techniki przedkliniczne do badania leczenia glejaka wielopostaciowego MSC, w tym: resekcja guza pod kontrolą obrazu; wszczepianie rusztowań z nasionami MSC; i śledzenie terapii pooperacyjnej.

Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Poznaj metodę izolacji i oczyszczania β-glukanów grzybowych w celu immunoterapii glejaka. Protokół obejmuje ekstrakcję z Pleurotus ostreatus, Ganoderma lucidum i innych gatunków oraz analizę wpływu na komórki mikrogleju BV2.

Izolacja i oczyszczanie β-glukanu grzybów jako strategia immunoterapii glejaka

Przeglądaj więcej filmów