Name: Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj technikę subkomórkowego obrazowania wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans in vivo. Metoda wykorzystuje wskaźniki genetyczne do badania dynamiki wapnia w mitochondriach i komórkach nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 przyznane F. Hoerndli). Chcielibyśmy również podziękować dr Attili Stetak za plazmid pAS1.

1. Tworzenie szczepów transgenicznych
<ol>
	<li>Korzystając z wybranej metody klonowania8,9, sklonuj wektory wyrażeń, aby zawierały promotor Pflp-18 lub Prig-3 (dla sygnału specyficznego dla AVA w brzusznym rdzeniu nerwowym), następnie wybrany wskaźnik Ca2+, a następnie 3' UTR (więcej informacji w dyskusji)10. Wykaz plazmidów i ich źródeł można znaleźć w Tabeli Uzupełniającej 1.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z ustalonym protokołem tworzenia szczepów transgenicznych poprzez mikrowstrzyknięcie mieszanki DNA (<100 ng/μL; patrz Tabela Uzupełniająca 1 dla stężeń każdego plazmidu) zawierającej transgen wskaźnikowy Ca2+ (~20 ng/μL) i ratunkowe DNA lin-15+ (marker selekcyjny) do gonady 1-dniowego dorosłego C. elegans10 (genotyp: LIN-15 (N765TS); Fenotyp: wielosromowy)10,11. 
	NUTA. Utrzymuj rodziców lin-15 (n765ts) w temperaturze 15 °C, aby stłumić mutację wrażliwą na temperaturę.</li>
	<li>Utrzymać rodziców, którym wstrzyknięto szczepienie, w temperaturze 20 °C do momentu osiągnięcia przez potomstwo F1 wieku dorosłego, aby umożliwić selekcję transgeniczną przy braku fenotypu wielosromowego.</li>
	<li>Przejście klonalne13 dorosłe potomstwo F1, które nie ma fenotypu wielosromowego, ponieważ wskazuje to na ekspresję tablicy pozachromosomalnej zawierającej wskaźnik Ca2+11.</li>
	<li>Ocenić ekspresję wskaźnikaCa2+ u potomstwa F2 lub F3, które nie ma fenotypu wielosromowego, montując i obrazując 1-dniowe dorosłe osobniki, jak opisano w dalszej części punktu 3. 
	NUTA. Stosunkowo wysoka ekspresja wskaźnika jest wymagana do szybkiego pozyskiwania obrazów, jak opisano tutaj (więcej szczegółów w dyskusji).</li>
	<li>Przeprowadzaj eksperymenty na kolejnych generacjach szczepów transgenicznych z optymalną ekspresją wskaźnika Ca2+ (więcej szczegółów w dyskusji), utrzymując szczepy w standardowych warunkach (20 °C na płytkach NGM)12.</li>
</ol>
2. Konfiguracja optyczna
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu zdolnego do długotrwałego obrazowania poklatkowego. 
	NUTA. Reprezentatywne dane uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego z odwróconym dyskiem wirującym, wyposażonego w lasery wzbudzające o długości fali 488 nm i 561 nm.</li>
	<li>Użyj obiektywu o małym powiększeniu (tj. 10x/0,40), aby uzyskać przybliżoną lokalizację robaka.</li>
	<li>Aby osiągnąć rozdzielczość subkomórkową, przełącz się na neurony i zlokalizuj je za pomocą obiektywu o dużym powiększeniu. 
	NUTA. Do uzyskania reprezentatywnych danych w tym badaniu użyto obiektywu 100x/1,40 NA oil.</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą ultraczułego aparatu zdolnego do szybkiej akwizycji obrazu (>50 kl./s).</li>
	<li>Dla wybranego wskaźnika Ca2+ należy użyć standardowego filtra emisji (tj. filtra emisji 525 nm ± 50 nm dla GCaMP6f i mitoGCaMP).</li>
	<li>Dodaj korektor dryfu Z (ZDC) do akwizycji strumieni obrazu dłuższych niż 10 s, ponieważ wysuszenie podkładki agarowej podczas sesji obrazowania powoduje, że neuryt traci ostrość w ciągu kilku sekund. 
	NUTA. Jeśli zestaw mikroskopowy nie pozwala na ZDC lub jeśli pożądane są długie (>20 min) okresy obrazowania, należy nałożyć obramowanie smaru silikonowego lub stopionej wazeliny wokół podkładki agarowej, aby spowolnić wysychanie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie robaków do obrazowania
<ol>
	<li>Przygotowanie płatków agarowych
	<ol>
		<li>Przygotuj 3 ml 10% agaru, rozpuszczając agar klasy molekularnej w M912 w szklanej probówce hodowlanej o wymiarach 13 mm x 100 mm i podgrzewając w kuchence mikrofalowej przez kilka sekund (patrz Tabela Materiałów). 
		NUTA. Stopiony agar może być przechowywany w bloku grzewczym do 1 godziny lub może być świeży za każdym razem, gdy potrzebne są płatki agarowe.</li>
		<li>Umieść szkiełko mikroskopowe między dwoma dodatkowymi szkiełkami, z których każde ma dwie warstwy taśmy laboratoryjnej (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A-i).</li>
		<li>Odetnij końcówkę końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl (bez filtra) i użyj jej do odpipetowania małej kropli agaru na środkowe szkiełko nakrywkowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-i).</li>
		<li>Spłaszcz agar, naciskając kolejny szkiełko w dół na wierzchu agaru (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A-ii).</li>
		<li>Po schłodzeniu pokrój agar na mały krążek, korzystając z otworu w szklanej probówce hodowlanej o wymiarach 13 mm x 100 mm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A-iii), a następnie usuń otaczający agar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu do walcowania ślimaków
	<ol>
		<li>Rozpuść muscymol w proszku w M9, aby uzyskać zapas o pojemności 30 mM. Rozdzielić na 50 μl porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozmrażać nową porcję 30 mM muscymolu co 3-5 dni (i przechowywać w temperaturze 20 °C podczas użytkowania).</li>
		<li>Rozcieńczyć 30 mM bulion muscymolowy w stosunku 1:1 kulkami polistyrenu, aby uzyskać roztwór do walcowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozycjonowanie robaka do obrazowania
	<ol>
		<li>Umieścić 1,6 μl roztworu do walcowania na środku podkładki agarowej. 
		UWAGA: Ilość płynu należy dostosować do obrazowania młodszych (mniej) lub starszych zwierząt (więcej).</li>
		<li>Używając preferowanego kilofa do robaków (tj. szklanego lub platynowego drutu)13, przenieś robaka w pożądanym wieku bez fenotypu wielosromowego11 do roztworu do walcowania na podkładce agarowej (Rysunek 1A-iv). 
		NUTA. Reprezentatywne dane pochodzą od 1-dniowych hermafrodytów (szczep GCaMP6f = FJH185; szczep mitoGCaMP; FJH597; patrz tabela uzupełniająca 1), które można rozpoznać po obecności tylko jednego rzędu jaj. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji na temat pracy z robakami w różnym wieku.</li>
		<li>Poczekaj ~ 5 minut, aż muscimol zmniejszy ruch robaka, a następnie upuść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm na podkładkę agarową, fizycznie ograniczając ruch robaka.</li>
		<li>W celu zobrazowania neurytów w brzusznym rdzeniu nerwowym, zwiń robaka do orientacji pokazanej na <silna klasa="xfig">Rysunek 1B,C, lekko przesuwając szkiełko nakrywkowe. 
		NUTA. Aby uwidocznić brzuszny rdzeń nerwowy, ustaw robaka z głową do góry i przetaczaj robaka, aż jelito znajdzie się po prawej stronie bliższej części, a po lewej stronie dystalnej części robaka (z perspektywy widza). Odwróć tę orientację (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C) do obrazowania neurytów w rdzeniu nerwowym grzbietowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż robaka na mikroskopie
	<ol>
		<li>Umieść kroplę olejku immersyjnego na szkiełku nakrywkowym przed zamontowaniem go na stoliku mikroskopu.</li>
		<li>Znajdź robaka za pomocą obiektywu o małym powiększeniu (10x) w jasnym polu.</li>
		<li>Przełącz się na obiektyw 100x i dostosuj ostrość.</li>
		<li>Zlokalizuj neuryt AVA za pomocą oświetlenia GCaMP lub mitoGCaMP za pomocą lasera obrazującego 488 nm. 
		UWAGA: Użyj niewielkich regulacji, aby zapobiec zgnieceniu robaka lub ściągnięciu szkiełka nakrywkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Akwizycja strumieni obrazów o wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Obrazowanie in vivo GCaMP
	<ol>
		<li>Ustaw czas ekspozycji na 20 ms.</li>
		<li>Dostosuj ustawienia lasera obrazowania i akwizycji, aż podstawowa fluorescencja GCaMP znajdzie się w średnim zakresie zakresu dynamiki aparatu14. Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać sugestie dotyczące optymalizacji parametrów obrazowania przy użyciu innych konfiguracji mikroskopowych. 
		NUTA. W przypadku konfiguracji optycznej użytej w tym badaniu należy ustawić laser obrazujący 488 nm na następujące ustawienia wyjściowe: moc lasera = 50% i tłumienie = 1. Zmodyfikuj dodatkowe ustawienia akwizycji w następujący sposób: wzmocnienie EM = 200 i wzmocnienie wzmacniacza przedwzmacniacza = 1.</li>
		<li>Po zlokalizowaniu neurytu AVA za pomocą fluorescencji GCaMP przy 100-krotnym powiększeniu, ustaw ZDC (patrz tabela materiałów) na zakres ±30 μm i rozpocznij ciągły autofokus. W razie potrzeby należy ręcznie skorygować płaszczyznę ogniskowej przed obrazowaniem.</li>
		<li>Uchwyć strumień obrazów w 100-krotnym powiększeniu. Czas trwania wynoszący nawet 10 minut można osiągnąć przy użyciu konfiguracji zastosowanej w tym badaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie in vivo mitoGCaMP
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 4.1.1-4.1.2 zgodnie z potrzebami, aby uzyskać podstawową fluorescencję mitoGCaMP w średnim zakresie dla zakresu dynamicznego kamery14. 
		NUTA. W przypadku konfiguracji optycznej zastosowanej w tym badaniu należy ustawić laser obrazujący 488 nm na następujące ustawienia wyjściowe: moc lasera = 20% i tłumienie = 10. Zmodyfikuj ustawienia akwizycji na następujące: wzmocnienie EM = 100 i wzmocnienie wzmacniacza przedwzmacniacza = 2.</li>
		<li>Po zlokalizowaniu mitochondriów w neurycie AVA za pomocą fluorescencji mitoGCaMP, ustaw ZDC zgodnie z opisem powyżej w kroku 3.3.</li>
		<li>Uchwyć strumień obrazów w 100-krotnym powiększeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza strumienia obrazu
<ol>
	<li>Otwórz strumień obrazu w odpowiednim oprogramowaniu do przetwarzania obrazów, aby przeanalizować wartości pikseli w serii obrazów (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Za pomocą narzędzia Zaznaczanie wielokątów zdefiniuj subkomórkowy region zainteresowania (ROI) zawierający GCaMP lub mitoGCaMP.</li>
	<li>Kliknij Analizuj narzędzia > > Menedżer zwrotu z inwestycji. W Menedżerze zwrotu z inwestycji kliknij przycisk Dodaj, a następnie pozycję Więcej > wielu miar. W oknie Multi Measure (Pomiar wielomiarowy) kliknij przycisk OK, aby automatycznie zebrać średnią, minimalną i maksymalną intensywność pikseli ROI zdefiniowaną powyżej dla każdej klatki strumienia obrazu w celu dalszej analizy. 
	NUTA. Zaleca się, aby średnia intensywność pikseli (F avg) była znormalizowana do minimalnej intensywności (Fmin) dla każdego ROI przy użyciu stosunku Favg/Fmin w celu uwzględnienia różnic fluorescencji spowodowanych pozycjonowaniem w płaszczyźnie z. Odrzuć strumienie obrazu z ruchem robaka podczas obrazowania, ponieważ wpłynęłoby to również na pomiary fluorescencji.</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li>
<li>Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%3A+Function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li>
<li>Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Metal+Ions+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inositol+trisphosphate%2Fcalcium+signaling+pathway+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li>
<li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212(2020).</li>
<li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li>
<li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885(2019).</li>
<li>Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082(2011).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-FusionTM+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+and+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Transformation and Microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%3A+Transferring+worms+grown+on+NGM+plates%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Ogama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+improving+image+acquisition+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemist%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy.</a> The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).</li>
<li>Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li>
<li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li>
<li>Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1">http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1</a> (2014).</li>
<li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+promoters+for+C.+elegans+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific promoters for C. elegans glia.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).</li>
<li>Ali, F., Kwan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+in+vivo+calcium+signals+from+neuronal+cell+bodies%2C+axons%2C+and+dendrites%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review.</a> Neurophotonics. 7 (1), 011402(2019).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li>
<li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642(2022).</li>
<li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li>
<li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+cortical+dendrites+modulate+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li>
<li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons%3A+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738(2019).</li>
<li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li>
<li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li>
<li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li>
<li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2%2B+indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262(2014).</li>
<li>Cho, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
<li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820(2022).</li>
<li>Müller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470(2018).</li>
<li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+in+aging+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200(2012).</li>
<li>Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+aging%3A+Learning+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14(2013).</li>
<li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li>
<li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Pierwszą kwestią, którą należy wziąć pod uwagę przy wdrażaniu opisanej metody, jest wybór wskaźnika Ca2+ o idealnej charakterystyce dla danego pytania badawczego. Cytoplazmatyczne wskaźniki Ca2 + zazwyczaj mają wysokie powinowactwo do Ca2 +, a wrażliwość tych wskaźników na Ca2 + jest odwrotnie proporcjonalna do kinetyki (szybkość włączania / wyłączania)16,17. Oznacza to, że albo czułość Ca2+, albo kinetyka bę...

Jony wapnia (Ca2+) są bardzo wszechstronnymi nośnikami informacji w wielu typach komórek. W neuronach Ca2+ jest odpowiedzialny za zależne od aktywności uwalnianie neuroprzekaźników, regulację motoryki cytoszkieletu, precyzyjne dostrojenie procesów metabolicznych, a także wiele innych mechanizmów wymaganych do prawidłowego utrzymania i funkcjonowania neuronów1,2. Aby zapewnić skuteczną sygnalizację wewnątrzkomórkową, neurony muszą utrzymywać niski podstawowy poziom Ca2+ w swojej cytoplazmie3. Osiąga się to poprzez współpracujące mechanizmy obchodzenia się z Ca2 +, w tym wychwyt Ca2 + do organelli, takich jak retikulum endoplazmatyczne (ER) i mitochondria. Procesy te, oprócz rozmieszczenia przepuszczalnych dlaCa2+ kanałów jonowych w błonie plazmatycznej, skutkują niejednorodnymi poziomami cytoplazmatycznego Ca2+ w całym neuronie.
Niejednorodność Ca2+ podczas spoczynku i aktywacji neuronalnej pozwala na różnorodną, specyficzną dla lokalizacji regulację mechanizmów zależnych od Ca2+1. Jednym z przykładów specyficznych dla stężenia skutków Ca2 + jest uwalnianie Ca2 + z ER przez receptory 1,4,5-trifosforanu inozytolu (InsP3). Niski poziom Ca2+ w połączeniu z InsP3 jest wymagany do otwarcia przepuszczalnych dla wapnia porów receptora. Alternatywnie, wysoki poziom Ca2+ zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio hamuje receptor4. Znaczenie homeostazy Ca2 + dla prawidłowego funkcjonowania neuronów jest poparte dowodami sugerującymi, że zakłócona wewnątrzkomórkowa obsługa i sygnalizacja Ca2 + jest wczesnym krokiem w patogenezie zaburzeń neurodegeneracyjnych i naturalnego starzenia się5,6. W szczególności nieprawidłowy wychwyt i uwalnianie Ca2+ przez ER i mitochondria są związane z początkiem dysfunkcji neuronów w chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona i chorobie Huntingtona6,7.
Badanie dyshomeostazyCa2+ podczas naturalnego starzenia się lub neurodegeneracji wymaga podłużnej obserwacji poziomów Ca2+ z subkomórkową rozdzielczością w żywym, nienaruszonym organizmie, w którym zachowana jest natywna architektura komórkowa (tj. układ synaps i dystrybucja kanałów jonowych). W tym celu protokół ten zawiera wytyczne dotyczące stosowania dwóch łatwo dostępnych, genetycznie kodowanych czujników Ca2+ do rejestrowania dynamiki Ca2+ in vivo z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Reprezentatywne wyniki uzyskane opisaną metodą u C. elegans pokazują, w jaki sposób ekspresja wskaźników Ca2 + w cytoplazmie lub macierzy mitochondrialnej pojedynczych neuronów może pozwolić na szybkie uzyskanie obrazów fluorescencyjnych (do 50 Hz), które ilustrują dynamikę Ca2 + z dodatkową zdolnością do rozpoznawania poziomów Ca2 + w pojedynczych strukturach przypominających kręgosłup i poszczególnych mitochondriach.

<table><tbody><tr><td>Obiektyw 100x/1.40 Oil&nbsp; &nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td></td><td>&nbsp; UPlanSApo</td></tr><tr><td>10x/0.40 Obiektyw&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td></td><td>&nbsp; UPlanSApo</td></tr><tr><td>22 mm x 22 mm Szkło osłonowe&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>Numer telefonu 48366-227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza SFR&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>J234-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator wiązkowy</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>Borealis modernizacja do stołu laboratoryjnego CSU-X1</td></tr><tr><td>CleanBench&nbsp;</td><td>TMC&nbsp;</td><td></td><td>Z kontrolą drgań</td></tr><tr><td>Jednorazowe probówki hodowlane</td><td>VWR&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 47729-572</td><td>&nbsp; 13 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Komora środowiskowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>3940</td><td>Zestaw na 20 & deg; C</td></tr><tr><td>Koło filtrów lub suwak</td><td>ASI</td><td></td><td>Do filtrów o średnicy 25 mm</td></tr><tr><td>FJH 185</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis&nbsp;</td><td>FJH 185</td><td>Szczep robaka</td></tr><tr><td>FJH 597</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis</td><td>FJH 597</td><td>Szczep robaka</td></tr><tr><td>Filtr pasmowoprzepustowy GFP&nbsp;</td><td>Chroma&nbsp;</td><td></td><td>525 &plusmn; 50 nm&nbsp;( Średnica 25 mm)</td></tr><tr><td>Sumator laserowy ILE&nbsp;</td><td>Technologie Andor&nbsp;</td><td></td><td>4 linie laserowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Laser półprzewodnikowy ILE 488 nm</td><td>Andor Technologies&nbsp;</td><td></td><td>50 mW</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Wersja 1.52a</td></tr><tr><td>IX83 Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td></td><td>Z kamerą Yokogawa CSU-X1 z obrotowym dyskiem</td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD&nbsp;</td><td>Technologie Andor&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny o niskiej autofluorescencji&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td>Z-81226</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne&nbsp;</td><td></td><td>Wersja 7.10.1&nbsp;</td></tr><tr><td>Skrzynka kontrolna mikroskopu</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX3-CBH</td></tr><tr><td>Muscimol&nbsp;</td><td>MP Biomedyczne&nbsp;/ Sigma</td><td>02195336-CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pAS1</td><td>AddGene</td><td>194970</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>pBSKS</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCT61</td><td></td><td></td><td>Plazmid dostępny w laboratorium Hoerndli/Maricq na żądanie</td></tr><tr><td>pJM23</td><td></td><td></td><td>Plazmid dostępny w laboratorium Hoerndli/Maricq na żądanie</td></tr><tr><td>pKK1&nbsp;</td><td>Dodaj Gene&nbsp;</td><td>194969</td><td>Plazmidowe</td></tr><tr><td>mikrosfery polikulkowe&nbsp;</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>00876-15</td><td>&nbsp; 0,094 &mikro; </td></tr><tr><td>m Komora stabilizująca</td><td>Norlake Scientific NSRI241WSW</td><td>/8H</td><td>Ustawiona na 15 &deg; C</td></tr><tr><td>Kontroler stopnia</td><td>ASI</td><td></td><td>Ze sterowaniem kołem filtrowym</td></tr><tr><td>Standardowy szkiełko mikroskopowe</td><td>Premiere</td><td>9108W-E</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Kontroler panelu dotykowego</td><td>Olympus</td><td></td><td>I3-TPC</td></tr><tr><td>Korektor dryftu Z&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td></td><td>IX3-ZDC2</td></tr></tbody></table>

subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Obrazowanie wapnia (Ca2+) było głównie wykorzystywane do badania aktywności neuronalnej, ale staje się coraz bardziej jasne, że subkomórkowe przetwarzanie Ca2+ jest kluczowym elementem sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Wizualizacja subkomórkowej dynamiki Ca2 + in vivo, w której neurony mogą być badane w ich natywnych, nienaruszonych obwodach, okazała się technicznie trudna w złożonych układach nerwowych. Przezroczystość i stosunkowo prosty układ nerwowy nicienia Caenorhabditis elegans umożliwiają ekspresję specyficzną dla komórki i wizualizację in vivo znaczników i wskaźników fluorescencyjnych. Wśród nich są wskaźniki fluorescencyjne, które zostały zmodyfikowane do stosowania w cytoplazmie, a także w różnych przedziałach subkomórkowych, takich jak mitochondria. Protokół ten umożliwia nieratiometryczne obrazowanie Ca2 + in vivo z rozdzielczością subkomórkową, która umożliwia analizę dynamiki Ca2 + aż do poziomu poszczególnych kolców dendrytycznych i mitochondriów. W tym przypadku dwa dostępne genetycznie kodowane wskaźniki o różnym powinowactwie Ca2 + są wykorzystywane do zademonstrowania zastosowania tego protokołu do pomiaru względnych poziomów Ca2 + w cytoplazmie lub macierzy mitochondrialnej w jednej parze interneuronów pobudzających (AVA). Wraz z manipulacjami genetycznymi i obserwacjami podłużnymi możliwymi u C. elegans, ten protokół obrazowania może być przydatny do udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące tego, w jaki sposób obchodzenie się z Ca2 + reguluje funkcję neuronów i plastyczność.

Te dwa protokoły umożliwiają szybką akwizycję różnicowych poziomów Ca2+ w regionach subkomórkowych i organellach pojedynczych neurytów in vivo z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Pierwszy protokół pozwala na pomiar Ca2+ w cytoplazmie z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Zostało to tutaj zademonstrowane przy użyciu specyficznej dla komórek ekspresji GCaMP6f w glutamatergicznych interneuronach dowodzących AVA15, których neuryty przebiegają przez całą dłu...

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Technika ta może być wykorzystana do pogłębienia naszej wiedzy na temat obchodzenia się z wapniem w neuronach oraz tego, jak podzielony na przedziały wapń może regulować różne mechanizmy ważne dla funkcji neuronów in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na szybkie obrazowanie in vivo w warunkach fizjologicznych w warunkach fizjologicznych u C. elegans, które można łączyć z innymi narzędziami fluorescencyjnymi. Technika ta może dostarczyć informacji na temat mechanizmu regulującego sygnalizację wapniową w neuronach w wielu różnych kontekstach.Na przykład podczas starzenia się, uszkodzenia neuronów i neurodegeneracji. Procedurę tę zademonstruje Ennis Deihl, technik badawczy. Kaz Knight, doktorant, i Rachel Doser, doktorantka z mojego laboratorium.Zacznij od sklonowania wektorów ekspresyjnych, które zawierają promotor, po którym następuje wskaźnik wapnia i trzy główne UTR z wyboru. Stwórz transgeniczne szczepy C.elegans poprzez mikroiniekcję mieszanki DNA zawierającej ratunkowe DNA Lin-15 plus w transgenie wskaźnika wapnia do gonady jednodniowego dorosłego C.elegans. Utrzymuj wstrzyknięte robaki rodzicielskie w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż potomstwo F1 osią

subcellular-imaging-of-neuronal-calcium-handling-in-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Obrazowanie wapnia w komórkach jest wszechstronną metodologią do badania dynamicznej sygnalizacji pojedynczych komórek, na mieszanych populacjach w kulturze, a nawet na przebudzonych zwierzętach, w oparciu o ekspresję przepuszczalnych dla wapnia kanałów/receptorów, które dają unikalne sygnatury funkcjonalne.

Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Poznaj technikę subkomórkowego obrazowania wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans in vivo. Metoda wykorzystuje wskaźniki genetyczne do badania dynamiki wapnia w mitochondriach i komórkach nerwowych.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Przeglądaj więcej filmów