Name: Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: Poznaj metodę automatycznego pomiaru średnicy naczyń siatkówki u myszy znieczulonych, wykorzystującą program MATLAB do analizy obrazów angiografii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie zmian naczyniowych w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem na stypendium podoktoranckie z Islandzkiego Funduszu Badawczego (217796-052) (A.G.L.) oraz Funduszu Pamięci Helga Jónsdóttir i Sigurlidi Kristjánsson (A.G.L i T.E.). Autorzy dziękują prof. Eiríkurowi Steingrímssonowi za udostępnienie myszy.

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Islandzki Urząd ds. Żywności i Weterynarii (licencja MAST nr 2108002). Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. W tym badaniu wykorzystano samce i samice myszy C57BL/6J i Mitfmi-vga9/+. Myszy C57BL/6J (n = 7) użyto jako kontroli. Dzikie typy zostały pozyskane komercyjnie (patrz tabela materiałów), ale wszystkie zmutowane myszy (n = 7) zostały wyhodowane i wychowane w obiektach dla zwierząt w Centrum Biomedycznym na Uniwersytecie Islandzkim. W niniejszej pracy wykorzystano zwierzęta w wieku 3 miesięcy; Protokół dotyczy jednak nawet zwierząt w wieku 1 miesiąca i starszych.
1. Przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę znieczulającą. Pobrać jedną ampułkę z 2 ml roztworu podstawowego ketaminy (25 mg/ml) i 250 μl roztworu podstawowego ksylazyny (2%) w celu przygotowania roztworu roboczego mieszaniny ketaminy/ksylazyny (25 mg/ml ketaminy i 20 mg/ml ksylazyny) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Znieczulić mysz za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy i ksylazyny, z objętością płynu czterokrotnie większą od masy ciała myszy; na przykład mysz o wadze 20 g potrzebuje 35 μl roztworu roboczego ksylazyna/ketamina, aby uzyskać roboczą dawkę mieszaniny ksylazyny (4 mg/kg masy ciała) i ketaminy (40 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Natychmiast po znieczuleniu należy rozszerzyć źrenice za pomocą kropli zawierającej 10% chlorowodorek fenylefryny i 1% tropikamidu.</li>
	<li>Poczekaj, aż zwierzę zostanie w pełni znieczulone, a jego źrenice zostaną szeroko rozszerzone.</li>
	<li>Przygotuj roztwór soli fluoresceiny. Dodać 9 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 1x) do 1 ml roztworu fluoresceiny (stężenie podstawowe 100 mg/mL) (patrz tabela materiałów). Końcowe stężenie roztworu roboczego wynosi 10 mg/ml.</li>
</ol>
2. Obrazowanie in vivo naczyń siatkówki za pomocą systemu obrazowania siatkówki u gryzoni
<ol>
	<li>Roztwór roboczy fluoresceiny podawać dootrzewnowo (5 μl/g masy ciała) znieczulonemu zwierzęciu.</li>
	<li>Nanieś kroplę 2% żelu metylocelulozowego na powierzchnię rogówki, a następnie umieść zwierzę na stoliku ustawiającym system obrazowania (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Ustaw soczewkę kamery do obrazowania dna siatkówki tak, aby bezpośrednio i delikatnie dotykała rogówki myszy. Aby umieścić głowę nerwu wzrokowego w środku pola widzenia, nieznacznie wyreguluj ustawienie.</li>
	<li>Przełącz się na zielony kanał fluorescencyjny w aparacie do badania dna oka.</li>
	<li>Skoncentruj się na naczyniach siatkówki, aby zrobić zdjęcia.</li>
	<li>Aby znaleźć idealny punkt czasowy, zrób kilka zdjęć w 1, 3, 5 i 10 minucie (ale nie dłużej niż 10 minut) po wstrzyknięciu fluoresceiny. 
	UWAGA: Zabieg FA musi zostać zakończony w ciągu 10 minut, ponieważ po tym czasie fluoresceina może stać się zbyt rozproszona, a naczynia staną się niewykrywalne.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania, gdy mysz jest jeszcze znieczulona, należy ją poddać eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
3. Analiza średnicy naczynia siatkówkowego
<ol>
	<li>Otwórz program MATLAB (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Pobierz i zapisz kod "fundusDiameter.m" (patrz Dodatkowy plik kodowania 1, Uzupełniający plik kodowania 2 i Uzupełniający plik kodowania 3).</li>
	<li>Otwórz folder, w którym został zapisany kod. Przeciągnij kod i upuść go na bieżący folder w programie MATLAB.</li>
	<li>Przeciągnij i upuść obraz FFA (obraz angiografii fluorescencji dna oka) lub obrazy, które chcesz przeanalizować w bieżącym folderze w MATLAB.</li>
	<li>Naciśnij narzędzie Uruchom na pasku narzędzi MATLAB.</li>
	<li>Pojawi się wyskakujące okienko. Wpisz nazwę pliku interesującego Cię obrazu w polu Wprowadź nazwę pliku i naciśnij OK. 
	UWAGA: Nie zmieniaj ani nie modyfikuj pozostałych parametrów.</li>
	<li>Wybierz środek tarczy nerwu wzrokowego, a następnie wybierz krawędź tarczy nerwu wzrokowego. Oprogramowanie oblicza teraz intensywność pikseli na obrazach dna oka myszy w okręgu o promieniu dwukrotnie większym niż promień tarczy optycznej, zgodnie z ruchem wskazówek zegara od środka dysku optycznego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Następnie upewnij się, że oprogramowanie wykreśla średnią średnicę naczynia (w pikselach) każdego naczynia w dnie oka w funkcji numeru naczynia (Rysunek 2).</li>
	<li>Następnie upewnij się, że oprogramowanie przesyła dane pomiarowe dla każdego zbiornika do dokumentu Excel, w którym obliczana jest średnia, mediana i odchylenie standardowe tych wartości (Tabela 1 i Tabela 2).</li>
	<li>Przenieś wartości z tabeli wyników do programu arkusza kalkulacyjnego, zaznaczając wszystkie wartości w tabeli. Wklej wartości do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Narysuj wykresy i przeprowadź analizę statystyczną, korzystając z danych wklejonych do wybranego programu arkusza kalkulacyjnego (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+retina+to+study+dementia+and+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging retina to study dementia and stroke.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).</li>
<li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+retinal+vessel+attenuation+in+eyes+with+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).</li>
<li>Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vessel+oxygen+saturation+and+vessel+diameter+in+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).</li>
<li>Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+therapy+for+ischemic+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411(2012).</li>
<li>Wang, S., Villegas-Perez, M. P., Vidal-Sanz, M., Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+optic+axon+dystrophy+and+vacuslar+changes+in+rd+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Progressive optic axon dystrophy and vacuslar changes in rd mice.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (2), 537-545 (2000).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+cells+influence+retinal+vascular+degeneration+in+mouse+models+of+retinal+degeneration+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).</li>
<li>Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocytes+and+the+microphthalmia+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network.</a> Annual Review of Genetics. 38, 365-411 (2004).</li>
<li>Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+the+microphthalmia+locus+and+its+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mitf.+Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The discovery of the microphthalmia locus and its gene.</a> Mitf. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (6), 729-735 (2010).</li>
<li>Garcia-Llorca, A., Aspelund, S. G., Ogmundsdottir, M. H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microphthalmia-associated+transcription+factor+%28Mitf%29+gene+and+its+role+in+regulating+eye+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15386(2019).</li>
<li>Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+promoter+use+in+eye+development%3A+the+complex+role+and+regulation+of+the+transcription+factor+MITF%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF.</a> Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).</li>
<li>Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitf+induction+by+RANKL+is+critical+for+osteoclastogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).</li>
<li>Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+development+of+signaling+pathways+inhibitors+of+melanogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis.</a> Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).</li>
<li>Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+microphthalmia-associated+transcription+factor+%28Mitf%29+mutations+affect+the+structure+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature.</a> Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).</li>
<li>Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging the retinal vasculature.</a> Annual Review of Vision Science. 7, 129-153 (2021).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+vessel+diameter+quantification+and+vessel+tracing+for+OCT+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography.</a> Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248(2020).</li>
<li>Salas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+akinetic+swept+source+optical+coherence+tomography+angiography+at+1060+nm+supporting+a+wide+field+of+view+and+adaptive+optics+imaging+modes+of+the+posterior+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Compact akinetic swept source optical coherence tomography angiography at 1060 nm supporting a wide field of view and adaptive optics imaging modes of the posterior eye.</a> Biomedical Optics Express. 9 (4), 1871-1892 (2018).</li>
<li>Albanna, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+evaluation+of+neurovascular+coupling+in+the+murine+retina+by+dynamic+retinal+vessel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis.</a> PLoS One. 13 (10), e0204689(2018).</li>
<li>Moult, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+anesthetic+protocols+for+functional+blood+flow+imaging+in+the+rat+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005(2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Niniejszy artykuł jest pierwszym, w którym przedstawiono metodę analizy średnicy naczynia siatkówki i unaczynienia siatkówki na podstawie obrazów FA myszy. Ponieważ do uchwycenia obrazów naczyń krwionośnych siatkówki wykorzystano tylko obrazowanie dna oka, metoda ta ma kilka wad, z których jedną jest to, że można wywnioskować zmiany tylko w powierzchownych warstwach unaczynienia siatkówki u myszy badanych w tym badaniu; Jakiekolwiek różnice w głębszych warstwach nie są jeszcze znane. 
Zaprezen...

Prawdopodobnie najbardziej zbadanym łożyskiem naczyniowym w ciele jest unaczynienie siatkówki. Dzięki stale rosnącemu zaawansowaniu technicznemu, unaczynienie siatkówki jest łatwo fotografowane u żywych pacjentów i wykorzystywane w wielu dziedzinach badawczych1. Dodatkowo, unaczynienie siatkówki myszy podczas rozwoju okazało się bardzo skutecznym systemem modelowym do badań nad podstawową biologią wzrostu naczyń krwionośnych. Podstawowym celem unaczynienia siatkówki jest zapewnienie wewnętrznej części siatkówki wsparcia metabolicznego poprzez laminarną siatkę kapilarną, która przenika tkankę nerwową2. Niemniej jednak stan siatkówki, a w konsekwencji każda dysfunkcja lub atrofia, może mieć znaczący wpływ zarówno na rozwidlenia naczyń siatkówki, jak i na średnicę tętnic, wykazując wzajemne oddziaływanie między komórkami siatkówki a unaczynieniem3,4. Wiadomo, że liczne choroby oczu, w tym retinopatia wcześniaków (ROP), retinopatia cukrzycowa (DR), zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), jaskra i neowaskularyzacja rogówki, mogą powodować nieprawidłową angiogenezę oka5. W przypadku unaczynienia siatkówki, mysie modele zwyrodnienia siatkówki często wykazują zmiany porównywalne do tych obserwowanych w chorobach naczyniowych u ludzi6,7. Rodzina supergenu Myc podstawowych czynników transkrypcyjnych helisa-pętla-helisa-zamek błyskawiczny obejmuje gen czynnika transkrypcyjnego związanego z mikroftalmią (Mitf) ulegający ekspresji w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE)8,9,10.
Wykazano, że liczne narządy, w tym oko, ucho, układ odpornościowy, ośrodkowy układ nerwowy, nerki, kości i skóra, są regulowane przez Mitf9,11,12,13. Odkryliśmy, że struktura i funkcja RPE są zaburzone u myszy z różnymi mutacjami w genie Mitf, co skutkuje niektórymi przypadkami zwyrodnienia siatkówki i ostatecznie utratą wzroku10. Ostatnio wykazano, że liczba naczyń i średnica naczyń różnią się znacznie między myszami z mutacją Mitf a myszami typu dzikiego14. Naukowcy i lekarze mogą teraz precyzyjnie określić ilościowo unaczynienie siatkówki in vivo dzięki rozwojowi obrazowania siatkówki. Od 1800 roku naukowcy i lekarze korzystali z korzyści płynących z wizualizacji unaczynienia siatkówki, a angiografia fluoresceinowa (FA) wykazała zarówno przepływ krwi w siatkówce, jak i degradację bariery krew-siatkówka15.
Ten artykuł pokazuje, jak analizować średnicę naczynia siatkówkowego na podstawie obrazów FA myszy za pomocą niestandardowego kodu w oprogramowaniu MATLAB.

<table><tbody><tr><td>1% Tropicamid (Mydriacyl)</td><td>Alcon Inc Laboratories</td><td></td><td>Środek przeciwpowodziowy</td></tr><tr><td>2% Methocel</td><td>OmniVision Eye Care</td><td></td><td>Żel hydroksypropylometylocelulozowy</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Myszy typu dzikiego</td></tr><tr><td>Excel dla Microsoft 365</td><td>Pakiet oprogramowania</td><td>Microsoft Inc</td><td></td></tr><tr><td>Sól</td> <td>sodowa fluoresceinySigma-Aldrich</td><td>28803-100G</td><td>Angiografia fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Matlab 8.0</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td>Pakiet oprogramowania</td></tr><tr><td>Micron IV kamera do dna oka gryzoni</td><td>Phoenix-Micron</td><td>40-2200</td><td>Fotografia dna oka</td></tr><tr><td>Fenylefryna 10% w/v</td><td>Bausch & Lomb</td><td></td><td>Środek mydriatyczny</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami - 100 tabletek</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Sigmaplot 13</td><td>Jandel Scientific Software</td><td></td><td>Pakiet oprogramowania</td></tr><tr><td>S-Ketamina, 25 mg / ml</td><td>Pfizer Inc.</td><td>PAA104470</td><td>Anestezjologia IP</td></tr></tbody></table>

pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

Measuring Retinal Vessel Diameter from Mouse Fluorescent Angiography Images

Ważne jest zbadanie rozwoju unaczynienia siatkówki w retinopatiach, w których nieprawidłowy wzrost naczyń może ostatecznie doprowadzić do utraty wzroku. Mutacje w genie czynnika transkrypcyjnego związanego z mikroftalmią (Mitf) wskazują na hipopigmentację, mikroftalmię, zwyrodnienie siatkówki, a w niektórych przypadkach ślepotę. Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą środków nieinwazyjnych jest niezbędne do badań okulistycznych. Jednak ze względu na niewielkie rozmiary obrazowanie dna oka myszy jest trudne i może wymagać specjalistycznych narzędzi, konserwacji i szkolenia. W tym badaniu opracowaliśmy unikalne oprogramowanie umożliwiające analizę średnicy naczynia siatkówki u myszy za pomocą zautomatyzowanego programu napisanego w MATLAB. Zdjęcia dna oka uzyskano za pomocą komercyjnego systemu kamer do badania dna oka po dootrzewnowym wstrzyknięciu roztworu soli fluoresceiny. Obrazy zostały zmienione w celu zwiększenia kontrastu, a program MATLAB pozwolił na automatyczne wyodrębnienie średniej średnicy naczynia w określonej odległości od tarczy optycznej. Zmiany naczyniowe badano u myszy typu dzikiego i myszy z różnymi mutacjami w genie Mitf, analizując średnicę naczynia siatkówki. Opracowany tutaj specjalnie napisany program MATLAB jest praktyczny, łatwy w użyciu i pozwala naukowcom wygodnie i niezawodnie analizować średnią średnicę i średnią średnicę całkowitą, a także liczbę naczyń z unaczynienia siatkówki myszy.

Rysunek 1 przedstawia proces analizy naczyń siatkówki, który jest stosowany do obrazów FFA myszy ze wszystkich badanych grup. Promień dwukrotnie większy od tarczy nerwu wzrokowego służy do pomiaru intensywności pikseli w kierunku kolistym, zgodnie z ruchem wskazówek zegara, od środka tarczy nerwu wzrokowego. Program oznacza piksele jako punkt początkowy lub końcowy w momencie napotkania punktów odpowiednio powyżej i poniżej określonego przez użytkownika progu. Czynność ta jest powtarzana 30 ...

Unaczynienie siatkówki myszy jest szczególnie interesujące w zrozumieniu mechanizmów powstawania wzorców naczyniowych. Protokół ten automatycznie mierzy średnicę naczyń siatkówki myszy na podstawie obrazów dna oka angiografii fluorescencyjnej w stałej odległości od tarczy nerwu wzrokowego.

Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. ...

Protokół ten zapewnia łatwą i niezawodną metodę automatycznego pomiaru średnicy naczyń siatkówki u znieczulonych myszy z powodu mutacji genów lub choroby siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest to, że napisany na zamówienie program MATLAB jest praktyczny, łatwy w użyciu, wygodny i niezawodny. Zmiany średnicy naczyń siatkówki często występują w chorobach zwyrodnieniowych, takich jak RP i inne schorzenia naczyniowe siatkówki.Modele mysie oferują wgląd w skuteczność leczenia i jego wpływ na naczynia siatkówki. Metoda ta może być potencjalnie przydatna jako wymierne markery kliniczne śledzące progresję zaburzeń naczyniowych w oku oraz do monitorowania potencjalnych metod leczenia. Na początek przygotuj strzykawkę z roztworem roboczym fluoresceiny i podaj ją dootrzewnowo znieczulonemu zwierzęciu i nałóż kroplę 2% żelu metylocelulozowego na powierzchnię rogówki.Następnie umieść zwierzę na stoliku pozycjonującym systemu obrazowania. Ustaw soczewkę kamery do obrazowania dna siatkówki tak, aby bezpośrednio i delikatnie dotykała rogówki myszy, a następnie lekko wyreguluj wyrównanie, aby umieścić głowę nerwu wzrokowego w środku pola widzenia. Następnie przełącz się na zielony kanał fluorescencyjny w kamerze do badania dna oka i skup się na naczyniach siatkówki, aby wykonać zdjęcia.Uchwyć obrazy w żądanych punktach czasowych po wstrzyknięciu fluoresceiny, aby określić idealny punkt czasowy i zobrazować obraz dna oka fluoresceiny. Najpierw otwórz program MATLAB. Następnie pobierz i zapisz średnicę dna oka.Kod m. Następnie otwórz folder analizy obrazu dna oka i przeciągnij i upuść średnicę dna. m do folderu analizy.Przeciągnij i upuść obraz FFA do folderu analizy obrazu. W programie MATLAB kliknij dwukrotnie plik z kodem, aby go aktywować. Wybierz opcję Uruchom.Pojawi się menu podręczne, aby wybrać obraz. Wybierz obraz, a na ekranie pojawi się menu kontekstowe z parametrami analizy. Ustaw parametry analizy w menu kontekstowym i naciśnij OK. Wybierz środek tarczy nerwu wzrokowego, a następnie wybierz krawędź tarczy nerwu wzrokowego.Analiza zostanie przeprowadzona w tle, a wyniki analizy pojawią się na ekranie. Tabela zawiera wartości średniej, odchylenia standardowego i błędu standardowego dla każdego statku. Zapisz tabelę.A następnie zapisz figurę z ustawioną średnią grubością. Otwórz folder analizy z zapisanymi plikami, a następnie otwórz zapisaną figurę. Otwórz zapisaną tabelę, skopiuj wartości i wklej je do pliku programu Excel.Po wstrzyknięciu fluoresceiny uzyskano obrazy z myszy kontrolnej i myszy MITFMI-VGA9/zmutowanej, dla których zmierzono najkrótszą odległość od środka tarczy nerwu wzrokowego do punktów końcowych na naczyniach w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Średnią średnicę naczynia uzyskano w funkcji liczby naczyń dla myszy typu dzikiego i zmutowanego. Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to ustawienie kamery dna oka oraz wyśrodkowanie tarczy nerwu wzrokowego w obrazie dna oka.Oprócz tej techniki można wykonywać techniki molekularne w celu zbadania nowych leków, zdiagnozowania różnych schorzeń naczyniowych w oku i lepszego zrozumienia funkcjonowania układu naczyniowego siatkówki.

measuring-retinal-vessel-diameter-from-mouse-fluorescent-angiography

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Mikroskopia przyżyciowe może być używana u zwierząt do wizualizacji i pomiaru średnic naczyń krwionośnych siatkówki, prędkości przepływu krwi i całkowitego przepływu krwi w siatkówce.

Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Protokół opisuje test mikrokieszeni rogówki, tak jak został on opracowany u myszy.

Test mikrokieszeni rogówki: model angiogenezy w oku myszy

Aby zbadać przepuszczalność bariery krew-siatkówka i wewnętrzną integralność błony ograniczającej w zwierzęcych modelach chorób siatkówki, użyliśmy kilku wariantów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jako narzędzi do oznaczania neuronów siatkówki i gleju. Ekspresja genu reporterowego za pośrednictwem wirusa jest następnie wykorzystywana jako wskaźnik przepuszczalności bariery siatkówkowej.

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Siatkówka wykazuje wyraźne podobieństwa do mózgu, a zatem stanowi unikalne okno do nieinwazyjnego badania układu naczyniowego i struktury neuronalnej w mózgu. Protokół ten opisuje metodę badania demencji przy użyciu technik obrazowania siatkówki. Ta metoda może potencjalnie pomóc w diagnozie i ocenie ryzyka demencji.

Wykorzystanie obrazowania siatkówki do badania demencji

Wiele zagrażających wzrokowi chorób oczu jest związanych z dysfunkcyjnymi mikronaczyniami siatkówki. Dlatego pomiar odpowiedzi tętniczek siatkówki jest ważny dla zbadania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W artykule opisano szczegółowy protokół izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do oceny wpływu substancji wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych.

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Tutaj omawiamy protokół metody, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego dg(fli:EGFP) danio pręgowanego jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą i zmianami strukturalnymi.

Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Poznaj metodę automatycznego pomiaru średnicy naczyń siatkówki u myszy znieczulonych, wykorzystującą program MATLAB do analizy obrazów angiografii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie zmian naczyniowych w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.

Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

Przeglądaj więcej filmów