Name: Zakrzepica tętnicza wywołana chlorkiem żelaza i pobieranie próbek do analizy pod mikroskopem elektronowym 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 57 s
Description: Poznaj metodę indukcji zakrzepicy tętniczej za pomocą chlorku żelaza i przygotowania próbek do mikroskopii elektronowej. Ta technika pozwala badać strukturę zakrzepu na różnych etapach rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom Laboratorium Whiteheart za uważne zapoznanie się z tym manuskryptem. Prace były wspierane przez granty z NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 i HL150818) oraz nagrodę Departamentu ds. Weteranów za zasługi dla S.W.W., R01 HL 155519 dla B.S. oraz grant na program stacjonarny NIBIB dla RDL.

Wszystkie omawiane tutaj eksperymenty zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kentucky.
UWAGA: Narzędzia chirurgiczne są wymienione w <silna klasa="xfig">Rysunek 1 i Tabela materiałów. Użyto myszy C57BL/6J, w wieku 8-10 tygodni, męskie/żeńskie lub odpowiednie szczepy zmodyfikowane genetycznie (Knockout lub Knockin).
1. Uszkodzenie tętnicy szyjnej wywołane FeCl3
<ol>
	<li>Indukcja znieczulenia myszy
	<ol>
		<li>Zważ mysz.</li>
		<li>Znieczulić mysz, wstrzykując dootrzewnowo roztwór tribromoetanolu (i.p.) 0,2 g/kg mu. Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że roztwór znieczulający ma temperaturę pokojową (RT). Taka dawka wystarcza na uspokojenie myszy przez około 1 godzinę.</li>
		<li>Sprawdź odruch u nogi, ściskając palec u nogi 5 minut po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że mysz jest uspokojona. Jeśli mysz nie jest pod wpływem środków uspokajających, odciągnie palec u nogi. Jeśli tak się stanie, odczekaj 5 minut i sprawdź ponownie.</li>
		<li>Jeśli mysz nadal nie jest całkowicie uspokojona, należy podać 1/4 dawki początkowej i odczekać 5 minut.</li>
		<li>Przez cały czas trwania zabiegu należy okresowo monitorować płaszczyznę znieczulenia myszy za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Dodatkowo można również monitorować częstość oddechów i temperaturę ciała w celu utrzymania optymalnego znieczulenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchamienie myszy
	<ol>
		<li>Połóż mysz na poduszce grzewczej (37 °C) w pozycji leżącej na plecach i użyj taśmy klejącej, aby unieruchomić kończyny.</li>
		<li>Użyj nici chirurgicznej (0,1 mm), aby delikatnie pociągnąć górne przednie zęby myszy, aby przedłużyć obszar szyjki macicy/szyi. Jest to ważne dla lepszej wizualizacji obszaru operacyjnego i stabilności sondy Dopplera. Rozmiar nici nie jest ważny, ponieważ służy ona tylko do ciągnięcia przednich zębów zwierzęcia w celu przedłużenia szyi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cięcie
	<ol>
		<li>Spryskaj obszar operacyjny 70% etanolem lub przetrzyj go wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
		<li>Za pomocą bawełnianego wacika nałóż niewielką ilość kremu do depilacji na obszar operacyjny. Odczekaj 1-2 minuty, a następnie użyj mokrego ręcznika papierowego lub chusteczki do usunięcia kremu. 
		UWAGA: Ten krok jest ważny dla czystego obszaru operacyjnego.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek i kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B11,1B13), wykonaj nacięcie linii środkowej od żuchwy do wcięcia nadmostkowego. Cofnij skórę, aby uzyskać lepszą wizualizację obszaru (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspozycja tętnicy szyjnej
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy chirurgicznych i mikrokleszczy preparacyjnych tępo rozetnij nakładającą się powięź powierzchowną i usuń ją, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B12,1B13). Na tym etapie upewnij się, że nie używasz nożyczek, aby uniknąć uszkodzenia innych naczyń krwionośnych w tym obszarze.</li>
		<li>Usuń dodatkową tkankę otaczającą tętnicę szyjną. Unikaj nadmiernego rozwarstwiania otaczającej tkanki, ponieważ w tym obszarze znajduje się nerw błędny i tętnica kręgowa.</li>
		<li>Oddziel tętnicę szyjną od otaczającej tkanki, wycinając ją kleszczami chirurgicznymi i do wiązania szwów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B12,1B15,2C). Upewnij się, że nie przedłużasz ani nie ciągniesz tętnicy, aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia tętnicy lub otaczającego naczynia krwionośnego.</li>
		<li>Umieść kawałek plastiku pod tętnicą, aby zaznaczyć miejsce urazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Użyj kolorowego arkusza przezroczystości, aby ułatwić widzenie w polu operacyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umiejscowienie sondy przepływu
	<ol>
		<li>Umieścić sondę przepływu transsonicznego Dopplera w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl wdH2O) na około 10 minut przed zabiegiem. Włóż drugi koniec sondy do nasadki w przepływomierzu, aby ułatwić odczyt przepływu. Podłącz przepływomierz do komputera. 
		UWAGA: Pomiędzy operacjami sonda przepływu transsonicznego Dopplera powinna być w soli fizjologicznej. Upewnij się, że sonda jest wilgotna i czysta przez cały czas trwania procedury.</li>
		<li>Umieść ultradźwiękową sondę przepływu dopplerowskiego wokół tętnicy przed tworzywem sztucznym (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D). Upewnij się, że obszar uchwytu naczynia sondy nie jest zbyt wysunięty (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C, czerwona strzałka). 
		UWAGA: W razie potrzeby podeprzyj sondę gazikami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B1), aby uzyskać odpowiednią wysokość sondy, ułatwiając optymalną pozycję do odczytu.</li>
		<li>Jeśli obszar operacyjny jest już suchy, dodaj kilka kropli soli fizjologicznej RT, aby obszar był wilgotny. Monitoruj odczyt sondy przepływu. Optymalny odczyt różni się dla każdego zwierzęcia i może wynosić od 0,6 do 1,2 ml/min. Jeśli jest mniejszy lub niestabilny, zmień pozycję sondy przepływu, aby uzyskać optymalny odczyt. 
		UWAGA: Upewnij się, że szyjka myszy nie jest zbyt rozciągnięta, a obszar operacyjny jest czysty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestrowanie linii bazowej przepływu
	<ol>
		<li>Po umieszczeniu sondy monitoruj przepływ krwi przez 2 minuty, aby upewnić się, że przepływ jest stały. Następnie rejestruj przepływ przez 2 minuty (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B) jako linię bazową. Szczegółowy opis przepływomierza można znaleźć w Subramaniam et al.17.</li>
		<li>Aby zarejestrować przepływ krwi, uruchom oprogramowanie WinDAQ. Kliknij opcję Plik, a następnie kliknij Nagraj. Utwórz nowy folder i plik, a następnie rozpocznij nagrywanie. Aby zatrzymać nagrywanie, kliknij Zatrzymaj w sekcji plików. 
		UWAGA: Oprogramowanie WinDAQ jest dostępne bezpłatnie u wydawcy: https://www.dataq.com/products/windaq/.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szkody
	<ol>
		<li>Zatrzymaj rejestrowanie przepływu. Upewnij się, że nie zmieniasz pozycji sondy, aby odczyty pozostały spójne po urazie.</li>
		<li>Dokładnie osusz obszar chusteczką/ręcznikiem papierowym. 
		UWAGA: Nawet niewielka objętość pozostałej cieczy może zmienić stężenie roztworu FeCl3 stosowanego do uszkodzenia naczyń krwionośnych. Prowadzi to do zmiennych wyników i wpływa na odtwarzalność. Gdy obszar jest całkowicie suchy, sonda nie jest w stanie zmierzyć przepływu.</li>
		<li>W plastikowej łódce do ważenia umieść okrągłą bibułę filtracyjną (o średnicy 1 mm, przeciętą dziurkaczem do uszu o średnicy 1 mm). Dodać 1 μl 6% roztworu FeCl3 (wykonanego z dH2O) na bibułę filtracyjną. 
		UWAGA: Pamiętaj, aby dodać roztwór FeCl3 tuż przed użyciem bibuły filtracyjnej. Zbyt wczesne namoczenie papieru może doprowadzić do odparowania roztworu FeCl3 i zmienić nasilenie urazu.</li>
		<li>Za pomocą cienkich kleszczyków podnieś bibułę filtracyjną i umieść ją na tętnicy przed sondą, w części tętnicy oznaczonej plastikiem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D, E). Ten plastik działa jak marker i przekładka. Znakuje uszkodzony obszar i zapobiega przypadkowemu rozcieńczeniu FeCl3, unikając kontaktu z otaczającym wilgotnym obszarem. 
		UWAGA: Upewnij się, że bibuła filtracyjna jest prosta, nie jest ściśnięta ani w żaden inny sposób zagięta. Po umieszczeniu na tętnicy nie zmieniaj położenia bibuły filtracyjnej; Zmienia to zakres urazu.</li>
		<li>Po umieszczeniu bibuły filtracyjnej uruchom minutnik i zapisz przepływ krwi. Po 3 minutach usuń papier i dodaj sól fizjologiczną w miejscu urazu, aby usunąć FeCl3 i zatrzymać proces urazu. Sprawia również, że obszar jest wilgotny. Na tym etapie przepływ krwi powinien powrócić do poziomu wyjściowego, zarejestrowanego przed urazem.</li>
		<li>Monitoruj i rejestruj przepływ, aż zmniejszy się do 10% oryginalnego nagrania lub osiągnie zero. Następuje stały spadek, gdy skrzeplina zaczyna tworzyć się w miejscu urazu (ryc. 3C). Zwróć uwagę na wszelkie znaczące wahania przepływu w tym czasie.</li>
		<li>Aby zbadać stabilność skrzepliny, zapisuj szybki wzrost przepływu krwi po każdym znaczącym i stałym spadku. Zdarzenia te są klasyfikowane jako embolizacja z powodu niestabilnej zakrzepicy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4D). Po konsekwentnym zmniejszaniu przepływu, operator jest w stanie zobaczyć uraz na tętnicy pod koniec eksperymentu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F, niebieska strzałka / przerywany owal).</li>
		<li>Czas zamknięcia naczynia definiuje się jako całkowite ustanie przepływu krwi na co najmniej 1 minutę. Zapisz czas, w którym tworzy się skrzeplina okluzyjna, na co wskazuje odczyt zerowy lub znaczny spadek przepływu.</li>
		<li>Zakończ eksperyment po 30 minutach. Jeśli skrzeplina nie utworzy się w ciągu 30 minut od monitorowania, zarejestruj przepływ, zatrzymaj zapis i wyjmij sondę.</li>
		<li>Wyczyść sondę 70% etanolem i szczotką, aby usunąć wszelkie resztki tkanki/włosów lub zanieczyszczeń. Całkowicie wysusz sondę przed umieszczeniem jej w pudełku do przechowywania. Całkowicie wysusz sondę przed umieszczeniem jej w pudełku do przechowywania w celu długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Umieścić tuszę w worku na tusze, oznaczonym nazwą laboratorium i datą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

2. Pobieranie i przygotowanie próbek do badań seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBF-SEM) po urazie wywołanym FeCl3
UWAGA: Prezentowany protokół EM jest odpowiedni do przygotowania próbki dla SBF-SEM. Ta technika obrazowania oferuje niespotykaną dotąd możliwość badania trójwymiarowej struktury płytek krwi w skrzepie. Dzięki tej technice próbka jest wizualizowana jako seria sekwencyjnych obrazów blokowych SEM, generowanych w miarę postępów w próbce. Kluczowymi punktami tego przygotowania są: 1) próbka musi być zabarwiona metalami ciężkimi wstępnie zatopionymi; oraz 2) próbka osadzona w plastiku musi być odpowiednio przycięta do montażu w SEM (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 6 dla wizualizacji przyciętych próbek). Barwienie po osadzeniu nie jest możliwe w SEM. Podczas pobierania próbki z uszkodzenia naczynia wywołanego FeCl3 do analizy EM, podczas wykonywania operacji należy wprowadzić następujące zmiany. Przedstawione modyfikacje w protokole chirurgicznym FeCl3 mają również zastosowanie do każdej formy mikroskopii elektronowej. Warunki znieczulenia oraz etapy wykonywania nacięcia i odsłaniania tętnicy szyjnej są takie same jak w Protokole 1.
<ol>
	<li>Po odsłonięciu tętnicy szyjnej zaznacz miejsce urazu, luźno otaczając obszar między dwoma gwintami chirurgicznymi (rozmiar: 0,1 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A,B).</li>
	<li>Umieść sondę pod tętnicą, dystalnie od dolnego gwintu (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C).</li>
	<li>Włóż plastikowy element pod tętnicę między dwoma gwintami, aby oznaczyć miejsce urazu FeCl3 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5C).</li>
	<li>Wykonaj pomiary przepływu przed wykonaniem urazu, aby zanotować przepływ podstawowy. Pomiary te służą do podjęcia decyzji, na jakim etapie zostanie pobrana próbka. 
	UWAGA: Upewnij się, że utrwalacz (3% paraformaldehydu/PFA + 0,1% aldehydu glutarowego, oba wykonane w 1x PBS) jest gotowy i w temperaturze RT. Alternatywnie można również zastosować utrwalanie 2,5% aldehydu glutarowego na tle soli. 
	UWAGA: Zarówno paraformaldehyd, jak i aldehyd glutarowy są wysoce toksyczne i drażniące. Podczas obchodzenia się z nimi należy używać rękawiczek, osłony oczu i masek w celu ochrony przed narażeniem. Wszystkie roztwory utrwalające są toksyczne, a etapy utrwalania należy przeprowadzać w dygestorium.</li>
	<li>Wykonaj uraz, umieszczając na tętnicy bibułę filtracyjną nasączoną FeCl3 (stosuje się 8% FeCl3) na 3 minuty (ten czas również może się różnić). Po 3 minutach usuń bibułę filtracyjną i dodaj sól fizjologiczną w miejscu urazu, aby usunąć nadmiar pozostałości FeCl3. Ten krok jest konieczny, aby zapobiec zmiennemu zakresowi urazu i ułatwić zliczanie przepływu przez sondę (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D).</li>
	<li>Monitoruj odczyt przepływu. Gdy przepływ spadnie poniżej 50% wartości początkowej, wyjmij sondę. Szybko osusz obszar i dodaj utrwalacz w tym obszarze, aby zewnętrznie naprawić obszar urazu.</li>
	<li>Natychmiast przytrzymaj tętnicę w pobliżu obszaru urazu za pomocą kleszczy i przetnij poniżej dolnej nici i przed górną nitką. W razie potrzeby poproś inną osobę o pomoc w odcięciu jednego końca. Umieść tkankę na plastikowym naczyniu do hodowli tkanek w tej samej orientacji, w jakiej została pobrana, i dodaj kilka kropli utrwalacza. 
	UWAGA: Przecięcie tętnicy powoduje natychmiastowe rozległe krwawienie, więc upewnij się, że trzymasz tętnicę przed przecięciem jej po raz pierwszy. W tym scenariuszu mysz jest wykrwawiona. Mysz zostaje poddana eutanazji przez wykrwawienie i zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Za pomocą skalpela oczyść dodatkową tkankę wokół tętnicy. Należy pamiętać, aby zapisać orientację przepływu krwi. Aby to zaznaczyć, przytnij jeden koniec poziomo, a drugi zwężając się/ukośnie (<silna klasa="xfig">Rysunek 5E).</li>
	<li>Próbkę należy przechowywać w utrwalaczu (3% PFA i 0,1% aldehydu glutarowego) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie należy przechowywać próbkę w 1% PFA w temperaturze 4 °C do momentu wysłania jej na mokrym lodzie do laboratorium przetwarzania próbek w celu analizy EM. 
	UWAGA: Próbek nie należy zamrażać. Wyzwania związane z tą metodą pobierania próbek to:
	<ol>
		<li>Początkowy odczyt może nie być optymalny lub może ulegać wahaniom po urazie. Może to mieć wpływ na zakres obrażeń, które są wybierane do zatrzymania do analizy EM. Aby rozwiązać ten problem, pamiętaj, aby nagrywać odczyt linii bazowej przez kilka minut, po wypróbowaniu różnych pozycji umieszczenia sondy, aby zdecydować, która pozycja jest optymalna.</li>
		<li>Czas do zatrzymania urazu poprzez dodanie zewnętrznego utrwalacza i rzeczywiste przecięcie odcinka tętniczego do analizy może zwiększyć zmienność w zakresie zakrzepicy. Zachowaj szybkość podczas pobierania próbki po zamocowaniu zewnętrznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymaj próbki do przetworzenia do analizy EM w 1% PFA na mokrym lodzie. Przepłukać próbki przez 3 minuty na lodzie 0,1 M buforem kakodylowym w celu rozpoczęcia dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Utrwalić próbki przez 1 godzinę na lodzie w 0,1 M buforze kakodylowym + 2,5% aldehydu glutarowego + 2 mM CaCl2.</li>
	<li>Odrzucić utrwalacz i przemyć próbki zimnym 0,1 M buforem kakodylanu sodu zawierającym 2 mM CaCl2 (5 x 3 min) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6A).</li>
	<li>Utrwalić próbki roztworem osmu (3% żelazocyjanek potasu [K4C6N6Fe] + 0,3 M bufor kakodylowy + 4 mM CaCl2 zmieszany z równą objętością 4% wodnego tetratlenku osmu [OsO4; w ddH2O]) przez 1 godzinę na lodzie.</li>
	<li>Podczas utrwalania próbek przygotować świeży 1% roztwór hydratu aldehydu trichlorooctowego (TCH) w ddH2O. Inkubować roztwór w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę, delikatnie mieszając.</li>
	<li>Po utrwaleniu przemyć próbki ddH2O w temperaturze pokojowej przez 5 x 3 min.</li>
	<li>Próbki inkubować w przefiltrowanym 1% roztworze TCH (sporządzonym w ddH2O) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć próbki za pomocą ddH2O w temperaturze pokojowej (5 x 3 min).</li>
	<li>Utrwalić próbki w 2% tetratlenku osmu w ddH2O przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemywać próbki za pomocą ddH2O w temperaturze pokojowej przez 5 x 3 minuty każda.</li>
	<li>Umieścić próbki w 1% octanie uranylu (wodnym) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć próbki za pomocą ddH2O w temperaturze pokojowej przez 5 x 3 minuty każda i przetworzyć je za pomocą barwienia en bloc asparaginianem ołowiu Waltona.</li>
	<li>En bloc barwienie asparaginianu ołowiu Waltona3:
	<ol>
		<li>Przygotować 30 mM roztworu kwasu L-asparaginowego w ddH2O. 
		UWAGA: Kwas asparaginowy rozpuszcza się szybciej, jeśli pH zostanie podniesione do 3,8. Ten roztwór podstawowy jest stabilny przez 1-2 miesiące, jeśli jest przechowywany w lodówce.</li>
		<li>Przygotować 20 mM roztworu azotanu ołowiu w 10 ml bulionu z kwasem asparaginowym i dostosować pH do 5,5 za pomocą 1 N KOH.</li>
		<li>Umieścić próbki w roztworze asparaginianu ołowiu w temperaturze 60 °C na 30 minut, po pięciu przemyciachddH 2O w temperaturze pokojowej temperatury, każde przez 3 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnić próbki za pomocą serii stopniowanego etanolu. Użyj chemicznego odwodnienia według protokołu Valdivia18.
	<ol>
		<li>Umyj próbki w każdym z poniższych roztworów, aby stopniowo odwodnić próbkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B): 
		25% alkoholu etylowego przez 3 min 
		50% alkoholu etylowego przez 3 min 
		75% alkoholu etylowego przez 3 min 
		95% alkoholu etylowego przez 3 min 
		100% alkohol etylowy przez 10 minut i powtórz krok dwukrotnie (w sumie trzy prania).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyć próbki w 100% tlenku propylenu (PO) przez 10 minut i powtórzyć ten krok dwukrotnie (w sumie trzy płukania).</li>
	<li>Inkubować w żywicy 50%/50% PO z aktywatorem DMP 30 przez noc w RT i zatopić w 100% Araldite 502/zatopić w aktywatorze DMP30 przez 48 godzin.</li>
</ol>

<ol><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li>
<li>Raskob, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis%3A+a+major+contributor+to+global+disease+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Thrombosis: a major contributor to global disease burden.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).</li>
<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Palta, S., Saroa, R., Palta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+coagulation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Overview of the coagulation system.</a> Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).</li>
<li>Joshi, S., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuts+and+bolts+of+the+platelet+release+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">The nuts and bolts of the platelet release reaction.</a> Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).</li>
<li>Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+action+of+platelets+and+crucial+blood+coagulation+pathways+in+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology-Oncology+and+Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis.</a> International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).</li>
<li>Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+antiplatelet+treatment+in+coronary+artery+disease+patients%3A+A+necessary+evil+or+an+overzealous+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice.</a> Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).</li>
<li>Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+model+of+arterial+thrombosis+induced+by+ferric+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride.</a> Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).</li>
<li>Denis, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+standardization+of+in+vivo+thrombosis+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).</li>
<li>Marsh Lyle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thrombin+inhibitor+efficacy+in+a+novel+rabbit+model+of+simultaneous+arterial+and+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+arterial+thrombosis+by+a+protease-activated+receptor+1+antagonist%2C+FR171113%2C+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig.</a> European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).</li>
<li>Huttinger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+canine+carotid+artery+thrombosis%3A+a+large+animal+model+of+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e57981(2018).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antithrombotic+therapy+by+regulating+the+ROS-mediated+thrombosis+microenvironment+and+specific+nonpharmaceutical+thrombolysis+Using+Prussian+blue+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets.</a> Small. 18 (15), 2106252(2022).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+membrane+cloaked+nanotubes+to+accelerate+thrombolysis+by+thrombus+clot-targeting+and+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration.</a> Small. , 2205260(2022).</li>
<li>Refaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+light-responsive+liposomes+for+protein+delivery%3A+Towards+bleeding-free+photothermally-assisted+thrombolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis.</a> Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+nanoplatelets+to+target+delivery+hirudin+for+site-specific+photothermal%2Fphotodynamic+thrombolysis+and+preventing+venous+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation.</a> Small. 18 (51), 2203184(2022).</li>
<li>Subramaniam, S., Kanse, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).</li>
<li>Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+lipid+droplets+are+translocated+into+the+lumen+of+the+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric-estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">Nonparametric-estimation from incomplete observations.</a> Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).</li>
<li>Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor+and+factor+VIII+are+independently+required+to+form+stable+occlusive+thrombi+in+injured+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins.</a> Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40L+stabilizes+arterial+thrombi+by+a+beta3+integrin--dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism.</a> Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).</li>
<li>Ni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+platelet+thrombus+formation+in+arterioles+of+mice+lacking+both+von+Willebrand+factor+and+fibrinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).</li>
<li>Bergmeier, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+platelet+adhesion+receptor+GPIbalpha+far+exceeds+that+of+its+main+ligand%2C+von+Willebrand+factor%2C+in+arterial+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).</li>
<li>Ciciliano, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+multifaceted+mechanisms+of+the+ferric+chloride+thrombosis+model+using+an+interdisciplinary+microfluidic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach.</a> Blood. 126 (6), 817-824 (2015).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+FeCl3-induced+arterial+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).</li>
<li>Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+hemolysis+and+hemoglobin+oxidation+promote+ferric+chloride-induced+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).</li>
<li>Shim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+model+of+mice+and+the+role+of+red+blood+cells+in+thrombosis+acceleration%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration.</a> Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+prothrombotic+potential+of+four-factor+prothrombin+complex+concentrate+%284F-PCC%29+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models.</a> PLoS One. 16 (10), 0258192(2021).</li>
<li>Wilbs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+peptide+FXII+inhibitor+provides+safe+anticoagulation+in+a+thrombosis+model+and+in+artificial+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs.</a> Nature Communications. 11 (1), 3890(2020).</li>
<li>Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rabbit+model+of+cerebral+venous+sinus+thrombosis+established+by+ferric+chloride+and+thrombin+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection.</a> Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).</li>
<li>Jacob-Ferreira, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antithrombotic+activity+of+Batroxase%2C+a+metalloprotease+from+Bothrops+atrox+venom%2C+in+a+model+of+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rabbit+model+of+cerebral+microembolic+signals+for+translational+research%3A+preclinical+validation+for+aspirin+and+clopidogrel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+evodiamine+on+collagen-induced+platelet+activation+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis.</a> BioMed Research International. 2022, 4893859(2022).</li>
<li>Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+murine+carotid+arterial+injury%3A+A+model+of+redox+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology.</a> Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).</li>
<li>Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+murine+thrombosis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced murine thrombosis models.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54479(2016).</li>
<li>Holly, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ether+lipid+metabolism+by+AADACL1+regulates+platelet+function+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis.</a> Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).</li>
<li>Bird, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+the+therapeutic+index+of+marketed+anti-coagulants+and+anti-platelet+agents+by+guinea+pig+models+of+thrombosis+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis.</a> Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tym badaniem.
Profile ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.

Miejscowe stosowanie FeCl3 do układu krwionośnego w celu wywołania zakrzepicy jest szeroko stosowaną techniką i odegrało zasadniczą rolę w ustaleniu ról dla różnych receptorów płytkowych, szlaków sygnałowych ligandów i ich inhibitorów 20,21,22,23. Mechanizm, za pomocą którego FeCl3 powoduje zakrzepicę, jest wieloaspektowy; Wcześniej obnażenie śródbłonka było uważane za prz...

Zakrzepica to tworzenie się skrzepu krwi, który częściowo lub całkowicie blokuje naczynie krwionośne, utrudniając naturalny przepływ krwi. Prowadzi to do poważnych i śmiertelnych zdarzeń sercowo-naczyniowych, takich jak choroba niedokrwienna serca i udary. Choroby układu krążenia są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności oraz powodują co czwarty zgon na całym świecie1,2,3. Chociaż zakrzepica objawia się nieprawidłowym funkcjonowaniem układu naczyniowego, może być wynikiem podstawowej infekcji bakteryjnej lub wirusowej, zaburzenia immunologicznego, nowotworu złośliwego lub stanu metabolicznego. Przepływ krwi jest utrzymywany przez złożoną interakcję między różnymi składnikami układu naczyniowego, w tym komórkami śródbłonka, czerwonymi/białymi krwinkami, płytkami krwi i czynnikami krzepnięcia4. Po uszkodzeniu naczyniowym płytki krwi wchodzą w interakcję z białkami adhezyjnymi na macierzy podśródbłonkowej i uwalniają swoją ziarnistą zawartość, która rekrutuje więcej płytek krwi5. Jednocześnie aktywowana jest kaskada krzepnięcia, co prowadzi do tworzenia i odkładania się fibryny. Ostatecznie tworzy się skrzep zawierający płytki krwi i czerwone krwinki uwięzione w fibrynowej siatce6. Chociaż dostępne są leki przeciwpłytkowe i przeciwzakrzepowe w celu modulowania zakrzepicy, fałszywe krwawienie pozostaje poważnym problemem w przypadku tych terapii, wymagając precyzyjnego dostrojenia dawek i kombinacji tych leków. W związku z tym nadal istnieje pilna potrzeba odkrycia nowych leków przeciwzakrzepowych7.
Zakrzepica jest badana przy użyciu wielu metod do zadawania uszkodzeń naczyniowych: mechanicznych (podwiązanie naczyń), termicznych (uszkodzenie laserowe) i chemicznych (zastosowanie FeCl3/Rose Bengal). Charakter zakrzepicy różni się w zależności od lokalizacji (tętnicza lub żylna), metody lub rozległości urazu. Spośród wszystkich tych typów, uszkodzenie naczyniowe wywołane FeCl3 jest najczęściej stosowaną metodą. Zastosowano go u myszy, szczurów, królików, świnek morskich i psów8,9,10,11,12. Metoda jest stosunkowo prosta, łatwa w użyciu, a jeśli główne parametry są znormalizowane, jest czuła i powtarzalna w różnych układach naczyniowych (np. tętnicach [szyjnych i udowych], żyłach [szyjnych] i tętniczkach [krezkowych]) (tabela uzupełniająca 1).
Ten model może być również wykorzystany do lepszego zrozumienia mechaniki i morfologii powstawania skrzepów. Technika ta w wyjątkowy sposób ma tę zaletę, że zatrzymuje zakrzepicę w różnych punktach natężenia przepływu, aby zbadać pośrednie etapy procesu, zanim stanie się on okluzyjny. Ostatnie postępy w badaniach nad zakrzepicą wykorzystały ten model do zwrócenia uwagi na niefarmakologiczne metody trombolizy13 lub nieinwazyjne dostarczanie leków przeciwzakrzepowych i/lub fibrynolitycznych14,15. Kilka grup wykazało, że gdy błony płytkowe są pokryte tymi środkami terapeutycznymi, leki mogą być aktywowane po stymulacji termicznej w celu celowania w skrzepy16. Opisane tutaj techniki mogą być przydatne w takich badaniach, jak walidacja ich wyników na poziomie pojedynczej płytki krwi. W tym manuskrypcie Protokół 1 opisuje podstawową procedurę uszkodzenia naczyń krwionośnych za pośrednictwem FeCl3, podczas gdy Protokół 2 opisuje metodę pobierania i utrwalania próbki uszkodzenia naczyniowego do dalszej analizy za pomocą mikroskopii elektronowej.

<table><tbody><tr><td>0,9% sól fizjologiczna&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>BP358-212</td><td>NaCl służy do sporządzania roztworu 0,9% soli fizjologicznej&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson i Spółka&nbsp;</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>190 Proof Etanol&nbsp;</td><td>KOPTEC</td><td>V1101&nbsp;</td><td>Służy do wytwarzania 70% roztworu etanolu do użycia w przygotowaniu myszy do operacji&nbsp;</td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48402</td><td></td></tr><tr><td>25 Yard pleciony jedwabny szew (5-0)</td><td>DEKNATEL</td><td>136082-1204</td><td></td></tr><tr><td>Igła 26G x 3/8&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson i Spółka&nbsp;</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>2-metylo-2-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td></td></tr><tr><td>7,5 ml pipet transferowy, z podziałką do 3 ml</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>135010</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki nasączone alkoholem (70% alkoholu izopropylowego)</td><td>Medline</td><td>MDS090735</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502&nbsp;</td><td>Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 35mm x 10mm&nbsp;</td><td>Corning Incorporated&nbsp;</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>Waga kompaktowa&nbsp;</td><td>Nauka Warda&nbsp;</td><td>470314-390</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne, 12,5 cm długości World</td><td>Precision Instrument</td><td>15922-G</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 aktywator&nbsp;</td><td>Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik dodenylobursztynowy/ DDSA</td><td>Mikroskopia elektronowa Usługi&nbsp;</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>Worki na psie odchody/worek na tusze zwierząt</td><td>Produkty koronowe&nbsp;</td><td>PP-RB-200</td><td></td></tr><tr><td>Dopplerowska sonda przepływowa</td><td>Transonic Systems Inc.</td><td>Żywica MA0.5PSB</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812&nbsp;</td><td>Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, bezwodny 200 proof&nbsp;</td><td>Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do opatrunków do oczu, 4" w pełni zakrzywione, standardowe, końcówki o szerokości 0,8 mm</td><td>Bibuła filtracyjna Integra Miltex</td><td>18-784</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28310-106</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - Ostre-</td><td>narzędzia naukowe&nbsp;</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacze do uszu z pętlą na palec&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe&nbsp;</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>Gąbki z gazy 2" x 2" &ndash; 12 warstw&nbsp;</td><td>Dukal Corporation</td><td>2128</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy (10% roztwór)</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne ze stali węglowej Integra Miltex #10</td><td>Integra&reg; Miltex&reg;</td><td>4110</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek żelaza (III)&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść noża Miltex&reg; Bardzo delikatna stal nierdzewna rozmiar 3</td><td>Integra Lifesciences&nbsp;</td><td>157510</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma&nbsp; Rybacy</td><td>&nbsp; A93100</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>Azotan ołowiu&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Mikroskop L-62</td><td></td></tr><tr><td>LEICA S8AP0</td><td>LEICA</td><td>Nie jest już dostępny</td> Nie <td>jest już dostępny w ofercie firmy</td></tr><tr><td>Stojak do mikroskopu LEICA S8AP0&nbsp;</td><td>LEICA</td><td>10447255</td><td>Produkt nie jest już dostępny w ofercie firmy</td></tr><tr><td>Light-Duty Tissue Wipers&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze mikropreparacyjne; 1x2 zęby, pełna krzywa; 0,8 mm Szerokość końcówki; Długość 4"</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny Firma</td><td>RS-5157</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu 4% roztwór wodny&nbsp;</td><td>Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16% roztwór)</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu, odczynnik ACS&nbsp;</td><td>Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Klasyczna pipeta Rainin PR-10</td><td></td><td></td> Przepływomierz badawczy Rainin 17008649<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Systemy transsoniczne Inc.</td><td>T402B01481</td><td>Model: T402</td></tr><tr><td>Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", przezroczysta</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>305289</tr><tr><td>Podgrzewana podkładka dla małych zwierząt</td><td>K& H Manufacturing Inc.</td><td>Model: HM10</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kakodylanu sodu 0,2 m, pH7,4</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką&nbsp;</td><td>Purytańskie produkty medyczne&nbsp;</td><td>25-806 Oświetlacz 1WC</td><td></td></tr><tr><td>Steromaster&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>12-562-21</td><td>Niedostępny już w ofercie firmy</td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne Dumont #7&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe&nbsp;</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Tiokarbohydrazyd (TCH)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne przeładowania końcówek do pipet o niskiej retencji (0,1-10 &mikro; L)</td><td>VWR</td><td>76323-394</td><td></td></tr><tr>Usługi mikroskopii elektronowej<td>z octanem uranylu</td><td>&nbsp;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Veet Gel Krem do usuwania włosów</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>3116875</td><td></td></tr><tr><td>Białe antystatyczne sześciokątne łodzie wagowe, średnie, 64 x 15 x 19 mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Oprogramowanie S38975</td><td></td></tr><tr><td>WinDAQ/100 dla systemu Windows</td><td>DATAQ Instruments, Inc.</td><td>Wersja 3.38</td><td>Dostępna bezpłatnie do pobrania. https://www.dataq.com/products/windaq/</td></tr> <tr><td>ZEISS AxioCam Icc 1</td><td>ZEISS</td><td>57615</td><td></td></tr></tbody></table>

zakrzepica tętnicza wywołana chlorkiem żelaza i pobieranie próbek do analizy pod mikroskopem elektronowym 3d

Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis and Sample Collection for 3D Electron Microscopy Analysis

Choroby układu krążenia są główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności na całym świecie. Nieprawidłowa zakrzepica jest powszechną cechą stanów ogólnoustrojowych, takich jak cukrzyca i otyłość, oraz przewlekłych chorób zapalnych, takich jak miażdżyca, rak i choroby autoimmunologiczne. Po uszkodzeniu naczyniowym zwykle układ krzepnięcia, płytki krwi i śródbłonek działają w sposób zorganizowany, aby zapobiec krwawieniu, tworząc skrzep w miejscu urazu. Nieprawidłowości w tym procesie prowadzą albo do nadmiernego krwawienia, albo do niekontrolowanej zakrzepicy/niedostatecznej aktywności przeciwzakrzepowej, co przekłada się na niedrożność naczyń i jej następstwa. Model uszkodzenia tętnicy szyjnej indukowany przez FeCl3 jest cennym narzędziem w badaniu, w jaki sposób zakrzepica rozpoczyna się i postępuje in vivo. Model ten obejmuje uszkodzenie/denudację śródbłonka, a następnie tworzenie się skrzepów w uszkodzonym miejscu. Zapewnia bardzo czuły, ilościowy test do monitorowania uszkodzeń naczyń krwionośnych i tworzenia się skrzepów w odpowiedzi na różne stopnie uszkodzenia naczyń. Po zoptymalizowaniu, ta standardowa technika może być wykorzystana do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zakrzepicy, a także zmian ultrastrukturalnych w płytkach krwi w rosnącej skrzeplinie. Test ten jest również przydatny do badania skuteczności leków przeciwzakrzepowych i przeciwpłytkowych. W tym artykule wyjaśniono, jak inicjować i monitorować zakrzepicę tętniczą indukowaną FeCl3 oraz jak pobierać próbki do analizy za pomocą mikroskopii elektronowej.

Dane są zazwyczaj przedstawiane jako czas do okluzji, czyli czas wymagany do powstania całkowicie zamykającego naczynie zakrzepu. Dane te można przedstawić w formie krzywej przeżycia Kaplana-Meiera (Rysunek 4A)19, wykresu punktowego z paskami obrazującymi końcowy przepływ krwi w momencie przerwania przepływu lub zakończenia eksperymentu (Rysunek 4B) lub w formie wykresu liniowego (Rysunek 4C). Za pomocą tej t...

Obecny protokół opisuje, jak wykorzystać uraz za pośrednictwemFeCl 3 do wywołania zakrzepicy tętniczej, oraz jak zbierać i przygotowywać próbki uszkodzeń tętnic na różnych etapach zakrzepicy do analizy mikroskopowej elektronowej.

Zakrzepica tętnicza wywołana chlorkiem żelaza i pobieranie próbek do analizy pod mikroskopem elektronowym 3D

Cardiovascular diseases are a leading cause of mortality and morbidity worldwide. Aberrant thrombosis is a common feature of systemic conditions like ...

Dzięki tej metodzie można określić, jakie składniki płytek krwi i układu hemostatycznego są ważne dla zakrzepicy. Ponadto metoda ta może określić, w jaki sposób wpływa to na wzrost i architekturę skrzepliny na poziomie komórkowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala w powtarzalny sposób badać wiele etapów zakrzepicy na poziomie strukturalnym.Osoba, która nie ma doświadczenia w tej technice, powinna unikać nadmiernego obchodzenia się z tkanką w obszarze operacyjnym. Może to prowadzić do krwawienia i może nadmiernie skomplikować identyfikację tętnicy szyjnej. Rozpocznij oznaczanie miejsca urazu po odsłonięciu tętnicy szyjnej, luźno otaczając obszar między dwoma nitkami chirurgicznymi o rozmiarze 0,1 milimetra.Umieść sondę pod tętnicą dystalną od dolnego gwintu. Włóż plastikowy element pod tętnicę między dwoma gwintami, aby oznaczyć miejsce uszkodzenia chlorkiem żelaza. Wykonaj pomiary przepływu przed wykonaniem urazu, aby zanotować przepływ podstawowy.Wykonaj uraz, umieszczając bibułę filtracyjną nasączoną chlorkiem żelaza na tętnicy na trzy minuty. Usuń bibułę filtracyjną po trzech minutach, aby zapobiec zmiennemu zakresowi obrażeń i ułatwić zliczanie przepływu przez sondę. Dodaj sól fizjologiczną w miejscu urazu, aby usunąć nadmiar pozostałości chlorku żelaza.Monitoruj odczyt przepływu. Gdy przepływ spadnie poniżej 50% wartości początkowej, wyjmij sondę. Szybko osusz obszar i dodaj utrwalacz, aby naprawić obszar urazu na zewnątrz.Następnie natychmiast przytrzymaj tętnicę w pobliżu obszaru urazu za pomocą kleszczy. Przeciąć za dolną nicią i przed górną nitką. Umieść tkankę na plastikowym naczyniu do hodowli tkanek w tej samej orientacji, w jakiej została pobrana, i dodaj kilka kropli utrwalacza.Za pomocą skalpela oczyść dodatkową tkankę wokół tętnicy. Upewnij się, że rejestrujesz orientację przepływu krwi, przecinając jeden koniec poziomo, a drugi zwężając się lub ukośnie. Umieść próbkę w utrwalaczu na godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj próbkę w 1% paraformaldehydzie w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż wyślesz ją w dół mokrego lodu do analizy pod mikroskopem elektronowym.Dane zostały wykreślone jako krzywa przeżycia Kaplana-Meiera, wykres punktowy ze słupkami pokazującymi końcowy przepływ krwi w momencie zatrzymania przepływu krwi lub zakończenia eksperymentu, lub jako wykres liniowy. Przepływ krwi gwałtownie wzrósł, w niektórych przypadkach po stopniowym spadku przez kilka minut, co wskazywało na częściowe zrzucanie rosnącej skrzepliny i było uważane za zdarzenie embolizacji. Tą metodą badano również morfologię skrzepliny okluzyjnej.Szybkie pobranie próbki podczas procesu zakrzepicy jest najważniejszym krokiem, ponieważ opóźnienie w tym procesie może prowadzić do błędnej interpretacji naszej analizy strukturalnej.

ferric-chloride-induced-arterial-thrombosis-sample-collection-for-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model zakrzepicy indukowanej FeCl3 u myszy jest opisany tutaj. Przedstawiono metodę monitorowania wzrostu skrzepliny za pomocą obserwacji mikroskopowej przyżyciowej naczynia krezkowego oraz pomiaru przepływu krwi w tętnicy szyjnej.

Mysi model zakrzepicy wywołanej chlorkiem żelaza na tętnicy szyjnej i naczyniu krezkowym

Naszym celem było zaprojektowanie, wyprodukowanie i przetestowanie ferromagnetycznych stentów do wychwytywania komórek śródbłonka. Dziesięć stentów przetestowano pod kątem złamań, a 10 kolejnych stentów przetestowano pod kątem magnetyzmu zatrzymanego. Na koniec przetestowano 10 stentów in vitro, a 8 kolejnych stentów wszczepiono 4 świniom, aby wykazać wychwytywanie i zatrzymywanie komórek.

Ferromagnetyczny stent z gołego metalu do wychwytywania i zatrzymywania komórek śródbłonka

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Opisujemy udoskonaloną procedurę modeli zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza (FeCl3) na tętnicy szyjnej i krezkowej oraz żyle, scharakteryzowaną efektywnie za pomocą mikroskopii przyżyciowej do monitorowania czasu do powstania skrzeplin okluzyjnych.

Modele zakrzepicy myszy indukowanej chlorkiem żelaza

Tutaj prezentujemy modyfikacje niezbędne do dobrze scharakteryzowanego i powszechnie stosowanego modelu uszkodzenia tętnicy szyjnej wywołanego chlorkiem żelaza (FeCl3) dla małych zwierząt, do wykorzystania w modelu uszkodzenia naczyń krwionośnych dużych zwierząt. Uzyskany w ten sposób model może być wykorzystany do oceny badań przedklinicznych zarówno profilaktycznych, jak i trombolitycznych interwencji farmakologicznych i mechanicznych.

Zakrzepica tętnicy szyjnej psów wywołana chlorkiem żelaza: duży zwierzęcy model uszkodzenia naczyń krwionośnych

Przedstawione tutaj są dwie metody, które mogą być używane indywidualnie lub w połączeniu do analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny. W zestawie znajduje się protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro, a następnie metody zmętnienia skrzepu i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

To badanie opisuje szybką i skuteczną metodę analizy składników komórkowych skrzepów krwi w mózgu poprzez rozpuszczanie skrzepów, barwienie komórek i rutynowe badanie krwi.

Kompleksowe podejście do analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu

Procedura nawleczenia ran kłutych w celu tworzenia hemostatycznej skrzepliny jest przedstawiona tutaj. Powstałe skrzepliny są duże i mają średnicę setek mikronów. W związku z tym odpowiednie są podejścia do obrazowania objętościowego. Sugerujemy zmontowaną transmisyjną mikroskopię elektronową o dużym obszarze jako podejście o wysokiej rozdzielczości dostępne dla wielu osób i szczegółowo opisując protokół przygotowawczy.

Hemostaza rany kłutej i przygotowanie próbek do analizy w zmontowanej mikroskopii elektronowej

Niniejsze badanie przedstawia protokół umożliwiający ustanowienie powtarzalnego, minimalnie inwazyjnego modelu zakrzepicy zatoki strzałkowej górnej u szczura wywołanego chlorkiem żelaza, wykorzystując metodę szu jedwabnego w połączeniu z laserowym obrazowaniem z rozróżnieniem oraz ultrasonografią wysokiej rozdzielczości do oceny.

Ustanowienie zmodyfikowanej zakrzepicy zatoki strzałkowej wywołanej chlorkiem żelaza

Opisujemy procedury ilościowego określania i charakteryzowania zmian miażdżycowych w modelach mysich, wykorzystując precyzyjne przekroje zatoki aortalnej aorty i aorty wstępującej w połączeniu z analizą histochemiczną i immunohistochemiczną.

Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Poznaj metodę indukcji zakrzepicy tętniczej za pomocą chlorku żelaza i przygotowania próbek do mikroskopii elektronowej. Ta technika pozwala badać strukturę zakrzepu na różnych etapach rozwoju.

Zakrzepica tętnicza wywołana chlorkiem żelaza i pobieranie próbek do analizy pod mikroskopem elektronowym 3D

Przeglądaj więcej filmów