Name: Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei w celu badania biologii malarii. Ta technika wspiera rozwój szczepionek przeciwko malarii i pozwala zrozumieć interakcje pasożyta z gospodarzem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez grant AI168307 National Institutes of Health dla SPK. Dziękujemy UGA CTEGD Flow Cytometry Core i UGA CTEGD Microscopy Core. Doceniamy również wkład Asha Pathaka, Anne Elliot i personelu UGA Sporocore w optymalizację protokołu. Chcemy podziękować dr Daichi Kamiyama za cenne spostrzeżenia, dyskusję i plazmidy rodzicielskie zawierające GFP11 i GFP 1-10. Chcielibyśmy również podziękować członkom laboratorium Kurup za ich nieustanne wsparcie, cierpliwość i zachętę.

Wszystkie badania z udziałem kręgowców w naszym laboratorium zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i protokołami University of Georgia dotyczącymi wykorzystania zwierząt.
1. Pokolenie myszy zakażonych P. berghei
<ol>
	<li>Zainicjuj zakażenie krwi u samców lub samic, 6-8-tygodniowych myszy C57BL/6 (B6) przy użyciu pasożytów P. berghei typu dzikiego. Aby to zrobić, przenieś kriokonserwowaną krew zakażoną P. berghei (2 x 105 zakażonych erytrocytów), rozpuszczoną w 400 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), do jednej lub dwóch myszy dawców dootrzewnowo (i.p.).</li>
	<li>Przenieś świeżą krew pobraną przez krwawienie zaoczodołowe od myszy dawcy 5 dni po zakażeniu (dpi) dwóm naiwnym myszom B6. Aby to zrobić, zbierz 200 μl krwi, rozpuść w 300 μl PBS i wstrzyknij 200 μl i.p. myszom biorcy. Upewnij się, że parazytemia u dawców w tym momencie wynosi 2%-5%19,20.</li>
	<li>Monitoruj pasożytnictwo zgodnie z wcześniejszym opisem19,20, zaczynając od 2 d.p.i. w adresatach. Gdy parazytemia waha się od 3% do 5% (około 5 d.p.i.), należy poddać eutanazji myszy biorcy, a następnie pobrać krew przez nakłucie serca lub krwawienie zaoczodołowe. Myszy należy poddać eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenku węgla, a następnie zwichnięcia szyjki macicy lub zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. 
	UWAGA: Gdy parazytemia przekroczy 5%, skuteczność transfekcji może być zmniejszona ze względu na zwiększoną częstość występowania wielokrotnie zakażonych krwinek czerwonych.</li>
</ol>
2. Pokolenie schizontów w kulturze
<ol>
	<li>Pobrać krew od zakażonych myszy w kroku 1.3 (łącznie około 2 ml od dwóch myszy) do 5 ml roztworu Alsevera (patrz tabela materiałów) w sterylnym środowisku. Kroki od 2.1 do 3.12 należy wykonać w sterylnych warunkach. 
	UWAGA: Warunki sterylne obejmują noszenie rękawiczek, wycieranie rękawic i powierzchni 70% etanolem, stosowanie sterylnych materiałów eksploatacyjnych i materiałów oraz pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Odwirowywać krew przez 8 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki RPMI (RPMI 1640 z 20% płodową surowicą bydlęcą [FBS] i 1% penicyliną-streptomycyną, v/v).</li>
	<li>Wirować przez 8 minut przy 450 x g przy suchej temperaturze względnej. Zawiesić osad w 25 ml kompletnej pożywki RPMI i przenieść do kolby hodowlanej T75 z nasadką filtrującą.</li>
	<li>Umieścić w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C i 5% CO2 , delikatnie wstrząsając, aby utrzymać komórki w zawiesinie przez 16 godzin.</li>
	<li>W punkcie czasowym 16 godzin sprawdź, czy nie ma rozwoju schizonta. W tym celu należy zebrać 500 μl próbki, odwirować przy 450 x g przez 8 minut, ponownie zawiesić osad w 10 μl pełnej pożywki RPMI i przygotować rzadki rozmaz krwi. Zabarwić rozmaz krwi za pomocą Giemsa stain19 (patrz Tabela Materiałów) i określić częstotliwość występowania schizontów (Rysunek 1).</li>
	<li>Aby uzyskać optymalną skuteczność transfekcji, 60%-70% pasożytów powinno znajdować się w stadium schizontu. Jeśli zostanie określona wartość mniejsza niż ten próg, kontynuuj hodowlę jak w kroku 2.4 i sprawdzaj co godzinę, czy powyższy próg został przekroczony przed kontynuacją.</li>
</ol>
3. Transfekcja Plasmodium schizonts
<ol>
	<li>Przygotować bufor wirowania gradientowego, rozpuszczając 13 ml pożywki podstawowej o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w 1,44 ml 1,5 M NaCl i 5,6 ml 0,15 M NaCl w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przenieść 25 ml posiewu krwi do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Ostrożnie nałożyć 20 ml gradientowego buforu wirującego na dno probówki wirówkowej za pomocą wąskiej szklanej pipety, aby utworzyć kolumnę gradientową. Należy uważać, aby nie naruszyć warstw cieczy i granic faz oraz zapewnić wyraźny podział między buforem a mediami.</li>
	<li>Wirować przez 20 minut przy 450 x g bez hamulca w temperaturze pokojowej. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usunąć warstwę schizonta15 znajdującą się na styku pożywki hodowlanej i gradientowego buforu wirującego i umieścić ją w nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Ponownie zawiesić izolowane schizonty w kompletnych pożywkach RPMI i zwiększyć całkowitą objętość do 40 ml. Wirować przy 450 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić schizonty w 10 ml kompletnej pożywki RPMI. Następnie przenieś 1 ml tego roztworu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dla każdej transfekcji i odwiruj przy 16 000 x g przez 5 sekund w celu osadzenia zakażonych krwinek czerwonych. Zainfekowane erytrocyty pochodzące od dwóch myszy w powyższy sposób mogą być użyte do maksymalnie 10 oddzielnych transfekcji.</li>
	<li>Połączyć 100 μl buforu do elektroporacji (roztwór nukleofektora z zestawu do elektroporacji; patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej z 5 μg kolistego lub zlinearyzowanego docelowego plazmidowego DNA (w maksymalnej objętości 10 μl), w zależności od potrzeb dla każdej transfekcji w oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Próbka "bez plazmidu" musi być dołączona jako kontrola do transfekcji i selekcji antybiotyków.</li>
	<li>Usunąć supernatant po odwirowaniu z kroku 3.5 i ostrożnie ponownie zawiesić zakażone erytrocyty w przygotowanym roztworze nukleofektora + plazmidowym DNA (od kroku 3.6).</li>
	<li>Przenieść zawiesinę (roztwór nukleofektora + plazmid + schizonty; maksymalnie 110 μl) do kuwet do elektroporacji. Transfekcja za pomocą odpowiedniego programu nukleofektorowego (U-033, patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Upewnij się, że kroki od 3.8 do 3.10 są wykonywane w RT.</li>
	<li>Dodaj 100 μl kompletnej pożywki RPMI do kuwety i przenieś cały roztwór (teraz 200 μl całkowitej objętości) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i utrzymuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wstrzyknąć 200 μl roztworu transfekowanych pasożytów myszom dożylnie (dożylnie), starając się zminimalizować czas między transfekcją a ostatnim wstrzyknięciem myszom. 
	UWAGA: Transfekowane schizonty są wstrzykiwane myszom w czasie krótszym niż 5 minut po elektroporacji, aby zmaksymalizować skuteczność protokołu.</li>
</ol>
4. Wybór transfekowanych pasożytów
<ol>
	<li>Sprawdź poziom pasożyta u myszy zaszczepionych transfekowanymi schizontami codziennie od 2 d.p.i. w celu zweryfikowania infekcji.</li>
	<li>Po zweryfikowaniu infekcji należy rozpocząć wybór leku, podając go doustnie w wodzie do picia, oferowaną ad libitum. 
	UWAGA: Pirymetamina została zastosowana jako selektywny marker leku dla plazmidu. W tym przypadku 17,5 mg pirymetaminy dodano do 250 ml czystej wody (końcowe stężenie 70 mg/l). Ponadto do tej wody dodano 10 g cukru, aby zachęcić myszy do odpowiedniego spożycia wody zawierającej pirymetaminę.</li>
	<li>Monitoruj parazytemię co dwa dni za pomocą rozmazów krwi wykonanych z 5 μl krwi, począwszy od 6 dni po rozpoczęciu leczenia pirymetaminą. Brak wykrywalnych pasożytów po 15 dniach wskazuje na nieudaną transfekcję; W takim przypadku ponownie zainicjuj proces od kroku 1.1, aby podjąć nową próbę.</li>
	<li>Gdy parazytemia osiągnie co najmniej 1%, przenieś pasożyty do naiwnych myszy B6 w celu stworzenia zapasów pasożytów we krwi. Kontynuuj selekcję u nowo zainfekowanych myszy, aż parazytemia osiągnie 2%-5%, w którym to momencie wygeneruj zapasy i zakonserwuj je21.</li>
</ol>
5. Zakażenie komarów liniami transgenicznymi
<ol>
	<li>Zakażone myszy B6 200 μl krwi zawierającej wybrane pasożyty (2 x 105 zakażonych erytrocytów/mysz, dożylnie). Określ parazytemię u tych myszy w dniu żerowania komarów i infekcji. Parazytemia między 2%-5% jest optymalna dla infekcji komarów. Po weryfikacji natychmiast przenieś infekcję na samice komara Anopheles stephensi zgodnie z krokami 5.2-5.4). 
	UWAGA: Inkubatory zawierające komary do infekcji powinny być utrzymywane w temperaturze 20,5 °C, przy wilgotności 80% i w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności (światła włączone między 07:00 a 19:00</li>).
	<li>Dzień przed zakażeniem komarami należy oddzielić samice komarów, umieszczając źródło ciepła na klatce zawierającej zarówno samce, jak i samice komarów, takie jak cienki plastikowy pęcherz lub rękawica wypełniona wodą podgrzaną do temperatury 37 °C. Usunąć samice komarów, które są przyciągane do źródła ciepła, za pomocą aspiratora do owadów i przenieść je do oddzielnego, mniejsza klatka na infekcję. 
	UWAGA: Samce komarów można odróżnić od samic komarów po nieznacznie zmniejszonym rozmiarze ciała i czułkach pióropuszowych.</li>
	<li>Wstrzyknij zakażonym myszom środek znieczulający ogólnie (np. 2% tribromoetanolu/awertyny). Zapewnij pełne znieczulenie, mocno ściskając podkładkę stopy każdej myszy. Jeśli nie zareagują, są wystarczająco uspokojone i gotowe do przeniesienia infekcji na komary.</li>
	<li>Umieść znieczulone myszy na samicach komarów w klatce (od kroku 5.2) w pozycji leżącej mostka. Ręcznie rozłóż przednie i tylne nogi, aby zapewnić jak największą powierzchnię do żerowania komarów. Pozostaw zainfekowane myszy nad każdą klatką na łącznie 15 minut, sprawdzając co 5 minut, aby upewnić się, że myszy nie są obudzone. Po zakończeniu karmienia należy poddać myszy eutanazji za pomocą zwichnięcia szyjki macicy lub zgodnie z instytucjonalnym protokołem wykorzystania zwierząt i bezpiecznie je zutylizować.</li>
</ol>
6. Kolekcja sporozoitów
<ol>
	<li>Sprawdź jelita środkowe komarów pod kątem oocyst w temperaturze około 10 d.p.i., aby zweryfikować powodzenie infekcji i rozwój Plasmodium w obrębie komarów. Odizoluj jelita środkowe komara od brzucha, usuwając końcowy segment brzuszny za pomocą kleszczy. Wizualizuj jelita środkowe w świetle spolaryzowanym pod kątem obecności oocyst22.</li>
	<li>Oczekuje się, że sporozoity typu dzikiego będą obecne w gruczołach ślinowych komarów 18-21 dni po żerowaniu na zakażonych myszach. W 18 dniu przeprowadź sekcję 5-10 komarów, aby ocenić liczbę sporozoitów. 
	UWAGA: Komary są myte i zabijane w etanolu. Następnie martwe komary są dwukrotnie myte PBS w celu usunięcia zanieczyszczeń przed sekcją.</li>
	<li>Aby wyizolować i policzyć sporozoity, ostrożnie usuń głowę komara, wywierając nacisk na klatkę piersiową komara za pomocą kleszczy lub cienkiej igły preparującej. Gruczoły ślinowe pozostają przyczepione do usuniętej głowy (<silna klasa="xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Usunąć wszelkie dodatkowe resztki komarów z gruczołów ślinowych i umieścić w probówce mikrowirówkowej zawierającej 400 μl pożywki do preparowania komarów (zmodyfikowana pożywka Ealge [DMEM] firmy Dulbecco z 1% surowicą mysią, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny; patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Zakłócić izolowane gruczoły ślinowe, przechodząc przez strzykawkę igłową 30 G 15-20 razy. Umieść 10 μl uszkodzonych gruczołów ślinowych w pożywce do preparowania komarów w hemocytometrze i policz. Zawiesić w żądanym stężeniu pożywkę do preparacji komarów lub PBS do wstrzyknięcia myszom, inokulacji do kultur komórkowych lub długotrwałej krioprezerwacji23,24.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geneva%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Geneva.</a> World Health Organization. , 1(2020).</li>
<li>Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria%3A+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Malaria: biology and disease.</a> Cell. 167 (3), 610-624 (2016).</li>
<li>Crompton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+immunity+in+man+and+mosquito%3A+insights+into+unsolved+mysteries+of+a+deadly+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease.</a> Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).</li>
<li>Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-erythrocytic+vaccines+against+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Pre-erythrocytic vaccines against malaria.</a> Vaccines. 8 (3), 400(2020).</li>
<li>Balu, B., Adams, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+transfection+technologies+for+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Advancements in transfection technologies for Plasmodium.</a> International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).</li>
<li>Rodriguez, A., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+parasites+accelerate+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transgenic parasites accelerate drug discovery.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).</li>
<li>Voorberg-vander Wel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+fluorescent+Plasmodium+cynomolgi+reporter+line+reveals+in+vitro+malaria+hypnozoite+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation.</a> Communications Biology. 3, 7(2020).</li>
<li>Christian, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+transgenic+parasites+and+host+reporters+to+dissect+events+that+promote+interleukin-12+production+during+toxoplasmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis.</a> Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).</li>
<li>Montagna, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+export+during+liver+infection+of+the+malaria+parasite+augments+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity.</a> mBio. 5 (4), e01321(2014).</li>
<li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites-recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).</li>
<li>Siciliano, G., Alano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlightening+the+malaria+parasite+life+cycle%3A+bioluminescent+Plasmodium+in+fundamental+and+applied+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 391(2015).</li>
<li>Othman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+transgenic+parasites+in+malaria+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">The use of transgenic parasites in malaria vaccine research.</a> Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).</li>
<li>Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+genetically+arrested+parasites+%28GAPs%29+for+a+precision+malaria+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198(2017).</li>
<li>Otto, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+evaluation+of+rodent+malaria+parasite+genomes+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression.</a> BMC Biology. 12, 86(2014).</li>
<li>Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+and+drug+selection+of+genetically+transformed+blood+stages+of+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei.</a> Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).</li>
<li>Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+gametocyte+culture+and+mosquito+infection+through+artificial+membrane+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61426(2020).</li>
<li>Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+large-scale+isolation+of+Plasmodium+berghei+sporozoites+from+infected+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes.</a> The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).</li>
<li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046(2016).</li>
<li>Bailey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline%3A+the+laboratory+diagnosis+of+malaria.+General+Haematology+Task+Force+of+the+British+Committee+for+Standards+in+Haematology%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology.</a> British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).</li>
<li>Das, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+literature+review+of+microscopy+methods+reported+in+malaria+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).</li>
<li>de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+berghei+ANKA+%28PbA%29+infection+of+C57BL%2F6J+mice%3A+a+model+of+severe+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria.</a> Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).</li>
<li>Musiime, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+that+a+real+oocyst%3F+Insectary+establishment+and+identification+of+Plasmodium+falciparum+oocysts+in+midguts+of+Anopheles+mosquitoes+fed+on+infected+human+blood+in+Tororo%2C+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda.</a> Malaria Journal. 18 (1), 287(2019).</li>
<li>Marques-da-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+type+I+interferon+signaling+in+hepatocytes+controls+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria.</a> Cell Reports. 40 (3), 111098(2022).</li>
<li>Bowers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+Plasmodium+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of Plasmodium sporozoites.</a> Pathogens. 11 (12), 1487(2022).</li>
<li>Zander, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1-like+plasmodium-specific+memory+CD4%2B+T+cells+support+humoral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity.</a> Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Wykorzystaliśmy powyższy protokół w naszym laboratorium do stworzenia kilku linii transgenicznych pasożytów P. berghei . Chociaż zoptymalizowano go pod kątem P. berghei, z powodzeniem wykorzystaliśmy ten protokół do generowania transgenicznych sporozoitów P. yoelii . Po wstrzyknięciu transfekowanych schizontów myszom, pasożyty są wykrywalne zazwyczaj nie później niż 3 d.p.i. we wszystkich grupach, w tym w grupie kontrolnej bez plazmidu. Selekcję rozpoczyna się dopiero po wykryciu parazytemii, a...

Pomimo postępów w opracowywaniu leków i badaniach nad zapobieganiem i leczeniem malarii, globalne obciążenie chorobami malarii pozostaje wysokie. Każdego roku ponad pół miliona ludzi umiera na malarię, przy czym najwyższy poziom śmiertelności obserwuje się wśród dzieci żyjących w regionach endemicznych dla malarii, takich jak Afryka Subsaharyjska1. Malaria jest wywoływana przez pasożyta Plasmodium, który jest przenoszony na ludzi poprzez ukąszenia samic komarów Anopheles przenoszących pasożyta w gruczołach ślinowych. Stadium zakaźne Plasmodium - sporozoity - odkładają się w skórze kręgowców gospodarzy podczas posiłku z krwi i przemieszczają się przez krwioobieg, aby zainfekować komórki wątroby, gdzie przechodzą obowiązkowy rozwój (stanowiący malarię przederytrocytową) przed zakażeniem erytrocytów. Zakażenie erytrocytów inicjuje stadium malarii we krwi i jest odpowiedzialne za całokształt zachorowalności i śmiertelności związanej z chorobą2,3.
Obligatoryjny charakter przederytrocytarnego rozwoju Plasmodium sprawił, że stał się on atrakcyjnym celem dla profilaktycznych wysiłków związanych z opracowywaniem szczepionek i leków4. Warunkiem wstępnym do badania biologii malarii przederytrocytarnej, a także opracowywania szczepionek lub leków ukierunkowanych na stadium wątrobowe, jest dostęp do sporozoitów Plasmodium. Co więcej, nasza zdolność do generowania genetycznie modyfikowanych sporozoitów Plasmodium odegrała zasadniczą rolę w sukcesie takich przedsięwzięć badawczych5,6,7,8,9. Transgeniczne linie Plasmodium wykazujące ekspresję fluorescencyjnych lub luminescencyjnych białek reporterowych pozwoliły nam śledzić ich rozwój in vivo i in vitro10,11. Genetycznie atenuowane pasożyty (GAP), powstałe w wyniku delecji wielu genów w Plasmodium, są również jednymi z najbardziej obiecujących kandydatów na szczepionki12,13.
Modele malarii gryzoni i naczelnych innych niż ludzie pomogły nam zrozumieć mechanizmy interakcji gospodarz-pasożyt w ludzkiej malarii ze względu na podobieństwa w biologii i cyklu życia między gatunkami Plasmodium14. Wykorzystanie gatunków Plasmodium, które infekują gryzonie, ale nie ludzi (np. P. berghei) pozwala na utrzymanie pełnego cyklu życiowego pasożyta i wytwarzanie zakaźnych sporozoitów do badania malarii w stadium wątrobowym w kontrolowanym otoczeniu na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1. Istnieje już wiele oddzielnych protokołów dla generowania transgenicznych pasożytów Plasmodium w stadium krwi15, infekcji komarów16 i izolacji sporozoitów17. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół łączący te metodologie w celu wygenerowania i wyizolowania transgenicznych sporozoitów P. berghei, na przykładzie nowego transgenicznego szczepu PbGFP11. PbGFP11 transportuje 11. nić β superfolderowego białka zielonej fluorescencji (GFP), GFP11, do parazytoforycznej wakuoli (PV) wytwarzanej w hepatocytach gospodarza. PbGFP11 stosuje się w połączeniu z transgenicznymi hepatocytami (tło Hepa1-6) wykazującymi ekspresję reszt, które stanowią fragment GFP 1-10 (GFP 1-10) w cytoplazmie (komórki Hepa GFP 1-10). PbGFP11 informuje o lizie PV w hepatocytach gospodarza poprzez samokomplementację i reformację funkcjonalnego GFP oraz sygnału zielonej fluorescencji18. Warto zauważyć, że GFP11 jest kodowany jako seria siedmiu sekwencji tandemowych w PbGFP11 w celu wzmocnienia wynikowego sygnału fluorescencji. Po zabarwieniu sporozoitów PbGFP11 barwnikiem cytoplazmatycznym CellTrace Violet (CTV) możemy śledzić pasożyty. Liza takich wewnątrzkomórkowych pasożytów barwionych CTV sama w sobie powoduje wyciek CTV do cytoplazmy komórki gospodarza i zabarwienie komórki gospodarza. Oprócz wizualizacji i rozróżniania lizy Plasmodium PV i/lub pasożyta w hepatocytach gospodarza, system ten może być niezawodnie wykorzystywany do badania szlaków immunologicznych odpowiedzialnych za każdy z tych procesów, poprzez genetyczne lub terapeutyczne zaburzenia składników molekularnych takich szlaków.

<table><tbody><tr><td>Igła strzykawkowa 30 G x 1/2"</td><td>Exel international</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Alsevera</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>A3551-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2</td><td>Lonza</td><td>VMI-1021</td><td></td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromoetanol)</td><td>TCI America</td><td>T1420</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi</td><td>BD bioscience</td><td>365967</td><td>do pobierania surowicy</td></tr><tr><td>Jednorazowy hematocytometr C-Chip</td><td>INCYTO</td><td>DHC-N01-5</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych CellVeiw</td> Wirówka <td>Greiner Bio-One</td><td>627860</td><td></td></tr><tr><td>5425</td><td>Eppendorf</td><td>5405000107</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5910R</td><td>Eppendorf</td><td>5910R</td><td>Do wirowania gradientowego</td></tr><tr><td>Delta Vision II - System odwróconego mikroskopu</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D5879-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GenClone</td><td>25-525</td><td></td></tr><tr><td>GFP11</td><td>plazmid Kurup Lab</td><td>pSKspGFP11</td><td>Generowany z plazmidu PL0017</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>48900-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Hepa GFP1-10</td><td>Kurup Lab</td><td>Hepa GFP1-10</td><td>Generowany z komórek Hepa 1-6 (ATCC Cat# CRL-1830)</td></tr> <tr><td>Surowica</td><td></td><td></td> mysia <td>Używana do pożywki do preparowania komarów</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SX0420-5</td><td>1,5 M i 0,15 M do roztworu perkolu</td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems (Lonza)</td><td></td> <td>Program U-033 używany do elektroporacji RBC</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (podłoże wyjściowe o gradiencie gęstości)</td><td>Cytivia</td><td>17-0891-02</td><td>Szczegóły w protokole</td></tr><tr><td>PL0017</td><td>Plasmid BEI Resources</td><td>MRA-786</td><td></td></tr><tr><td>Pirymetamina (do podawania doustnego)</td><td>Sigma</td><td>46706</td><td>Szczegóły przygotowania: Dodaj 17,5 mg pirymetaminy do 2,5 ml DMSO. Wir, jeśli to konieczne, aby całkowicie się rozpuścić; Dostosuj pH 225 ml dH2O do 4 za pomocą HCL. Dodaj pirymetaminę w DMSO do wody i doprowadź do 250 ml. Dodaj 10 g cukru, aby zachęcić do regularnego spożywania odurzanej wody. Pirymetamina jest wrażliwa na światło. Podczas leczenia myszy używaj ciemnej butelki lub butelki pokrytej folią aluminiową.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do mikroskopii SoftWoRx</td><td>Zastosowana precyzja</td><td>v6.1.3</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów plasmodium berghei

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria jest śmiertelną chorobą wywoływaną przez pasożyta Plasmodium i jest przenoszona przez ukąszenia samic komarów Anopheles. Stadium sporozoitowe Plasmodium odkładane przez komary w skórze kręgowców gospodarzy przechodzi fazę obowiązkowego rozwoju w wątrobie przed zainicjowaniem klinicznej malarii. Niewiele wiemy o biologii rozwoju Plasmodium w wątrobie; dostęp do stadium sporozoitu i zdolność do genetycznej modyfikacji takich sporozoitów są kluczowymi narzędziami do badania natury infekcji Plasmodium i wynikającej z niej odpowiedzi immunologicznej w wątrobie. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół wytwarzania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei. Genetycznie modyfikujemy stadium krwi P. berghei i używamy tej formy do zakażania komarów Anopheles, gdy spożywają posiłek z krwi. Po rozwinięciu się pasożytów transgenicznych w komarach, izolujemy stadium sporozoitowe pasożyta z gruczołów ślinowych komarów w celu przeprowadzenia eksperymentów in vivo i in vitro. Wykazujemy ważność protokołu, generując sporozoity nowego szczepu P. berghei wykazującego ekspresję podjednostki 11 białka zielonej fluorescencji (GFP) (GFP11) i pokazujemy, w jaki sposób można go wykorzystać do badania biologii malarii w stadium wątrobowym.

Określenie częstotliwości występowania i stopnia rozwoju schizontów jest kluczowe dla zapewnienia obecności odpowiedniej liczby żywotnych pasożytów w optymalnym stadium do transfekcji. Niedojrzałe schizonty można odróżnić od w pełni dojrzałych schizontów po obecności mniejszej liczby merozoitów, które nie wypełniają całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej erytrocytów (Rycina 1B). Należy zauważyć, że podczas przygotowywania rozmazów z hodowli krwi, zainfekowane erytrocyty mogą pękać, co prowadzi...

Malaria jest przenoszona przez inokulację stadium sporozoitu Plasmodium przez zakażone komary. Transgeniczne zarodźce pozwoliły nam lepiej zrozumieć biologię malarii i bezpośrednio przyczyniły się do opracowania szczepionki przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodologię generowania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

Obecnie mamy ograniczoną wiedzę na temat biologii zakażenia wątroby przez zarodźc. Ten protokół pomógł nam wygenerować wiele linii transgenicznych, które pomogły odpowiedzieć na kilka krytycznych pytań dotyczących biologii organizmu. Podstawowa wiedza na temat pasożyta i jego biologii jest niezbędna do opracowania nowych narzędzi i podejść do zwalczania zakażenia malarią.Metoda transgenezy, którą tutaj opisujemy, pomogła nam rozszyfrować niektóre kluczowe i złożone biologie organizmu, a także gospodarza. Tę procedurę zademonstruje Carson Bowers, mój kierownik laboratorium. Po wygenerowaniu myszy zakażonych P.Bergehei i poddaniu ich eutanazji, należy pobrać dwa mililitry krwi od dwóch zakażonych myszy do pięciu mililitrów roztworu Elsevier w sterylnym środowisku.Odwirować krew o stężeniu 450 G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad ogniwa w 10 mililitrach kompletnego podłoża RPMI. Ponownie odwiruj zawiesinę komórek i ponownie zawieś osad w 25 mililitrach kompletnego podłoża RPMI.Przenieść zawiesinę komórek do kolby hodowlanej T75 z nasadką filtrującą i inkubować, delikatnie wstrząsając, aby utrzymać komórki w zawiesinie. Pod koniec inkubacji zebrać 500 mikrolitrów próbki. Odwirować i ponownie zawiesić osad w 10 mikrolitrach kompletnego podłoża RPMI.Następnie przygotuj cienki rozmaz krwi. Barwić rozmaz krwi barwnikiem Giemsa i określić częstotliwość występowania schizontów. Aby uzyskać optymalną skuteczność transfekcji, 60 do 70% pasożytów powinno znajdować się w stadium schizontu.Przygotować gradientowy bufor wirowy, odtwarzając 13 mililitrów pożywki wyjściowej o gradiencie gęstości w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Przenieś 25 mililitrów posiewu krwi do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie ostrożnie ułóż 20 mililitrów gradientowego buforu wirującego na dnie probówki wirówkowej, używając wąskiej szklanej pipety, aby utworzyć kolumnę gradientową i zapewnić wyraźny podział między buforem a pożywką.Odwirować przygotowany bufor i pożywkę przez 20 minut w temperaturze 450 G, bez przerwy, w temperaturze pokojowej. Za pomocą pipety pastwiskowej ostrożnie usunąć warstwę schizontu na styku pożywki hodowlanej i buforu wirowania gradientowego. Umieść go w nowej 50-mililitrowej probówce wirówkowej.Ponownie zawieś izolowane schizonty w kompletnych nośnikach RPMI i zwiększ całkowitą objętość do 40 mililitrów. Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić schizont w 10 mililitrach kompletnej pożywki RPMI. Następnie przenieś jeden mililitr tego roztworu do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej dla każdej transfekcji i osadzaj zainfekowane komórki przez odwirowanie w temperaturze 16 000 G przez pięć sekund.Następnie połącz 100 mikrolitrów buforu do elektroporacji w temperaturze pokojowej z pięcioma mikrogramami docelowego plazmidowego DNA w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Po odwirowaniu zakażonych komórek usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić komórki w przygotowanym roztworze nukleofektora wraz z plazmidowym DNA. Następnie przenieś zawiesinę do elektroporacji, kuwet i transfektu za pomocą odpowiedniego programu nukleofektorowego.Następnie dodaj 100 mikrolitrów kompletnego nośnika RPMI do kuwety. Przenieś cały roztwór do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i umieść ją na lodzie. Sprawdź poziom parazytemii u myszy zaszczepionych transfekowanym schizontem codziennie od dwóch dni po inokulacji.Po potwierdzeniu zakażenia należy rozpocząć wybór leku od podania leku doustnie i picia wody oferowanej ad libitum. Monitorować parazytemię za pomocą rozmazów krwi, począwszy od sześciu dni po rozpoczęciu leczenia pirometyminą. Gdy parazytemia osiągnie co najmniej 1%, przenieś pasożyty do naiwnych myszy B6 w celu wytworzenia zapasów pasożytów we krwi.Gdy pasożyt osiągnie od 2% do 5%, generuj zapasy i przechowuj je w kriokonserwacji. Dzień przed zakażeniem komarami należy oddzielić samice komarów, umieszczając rękawicę wypełnioną wodą podgrzaną do 37 stopni Celsjusza na klatce zawierającej zarówno samce, jak i samice komarów. Użyj aspiratora do owadów, aby usunąć samice komarów przyciągnięte do źródła ciepła i przenieś je do mniejszej klatki w celu infekcji.W dniu żerowania komarów i infekcji określ pasożyt u zakażonych myszy B6. Parazytemia od 2% do 5% jest optymalna dla infekcji komarami. Po zweryfikowaniu parazytemii przenieś infekcję na samice komarów, umieszczając znieczulone myszy na samicach komarów w klatce w pozycji leżącej mostka.Ręcznie rozłóż przednie i tylne nogi, aby zapewnić jak największą powierzchnię do żerowania komarów. Pozostaw zainfekowane myszy w każdej klatce na 15 minut, sprawdzając co pięć minut, czy myszy nie są obudzone. Po zakończeniu karmienia i uśpieniu myszy należy je bezpiecznie zutylizować, postępując zgodnie z wytycznymi instytucji.Aby zweryfikować powodzenie infekcji u komarów, odizoluj jelita środkowe komarów, usuwając końcowy segment brzuszny za pomocą kleszczy 10 dni po zakażeniu. Następnie obejrzyj jelita środkowe w spolaryzowanym świetle, aby wykryć obecność oocyst. Po 18 dniach od zakażenia przeprowadź sekcję od pięciu do 10 komarów, aby ocenić liczbę obecnych sporozoitów.Aby wyizolować i policzyć sporozoity, ostrożnie usuń głowę komara, jednocześnie wywierając nacisk na klatkę piersiową kleszczami lub cienką igłą preparacyjną. Gruczoły ślinowe pozostaną przyczepione do usuniętej głowy. Następnie usuń wszelkie dodatkowe resztki komarów z gruczołów ślinowych i umieść je w probówce z mikrowirówką zawierającą 400 mikrolitrów pożywki do preparowania komarów.Następnie zakłócić izolowane gruczoły ślinowe, przepuszczając je przez strzykawkę z igłą o rozmiarze 30 od 15 do 20 razy, Następnie umieść 10 mikrolitrów uszkodzonych gruczołów ślinowych w pożywce do preparowania komarów do hemocytometru i policz. Na koniec ponownie zawiesić gruczoły ślinowe w pożądanym stężeniu pożywki do preparowania komarów lub PBS do wstrzykiwania myszom lub długotrwałej kriokonserwacji. Podobnie jak w przypadku mikroskopii, przedstawiono obrazy przedstawiające dojrzałe i niedojrzałe P.berghei schizont w pasożytniczych hodowlach krwi myszy.Podobnie jak w przypadku zdjęć mikroskopowych głowy komara z nienaruszonymi gruczołami ślinowymi podczas sekcji, oraz wypreparowanego gruczołu ślinowego w mniejszym i większym powiększeniu. Generowanie sygnału zielonej fluorescencji w PB, zakażonym GFP 11 HEPA GFP od jednej do 10 komórek gospodarza wskazywało na lizę wakuoli parazytoforycznej. Ważne jest, aby ostrożnie usunąć warstwę szesonu bez zakłócania interfejsu gradientu.Wymaga to również trochę praktyki, aby niezawodnie usunąć gruczoły ślinowe wraz z głową podczas izolacji zarodników światłem. Po izolacji, transgeniczne sporozoity mogą być kriokonserwowane lub używane świeże do badań infekcji in vivo lub in vitro.

generating-genetically-modified-plasmodium-berghei-sporozoites

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komary z gatunku Anopheles stephensi są wektorami malarii zamieszkującymi Indie oraz cały obszar Azji. Niniejszy film demonstruje technikę wykonywania mikroiniekcji u tego gatunku z wykorzystaniem transgenów, które nadadzą komarowi odporność na malarię. Większość metodologii przedstawionej w tym filmie ma zastosowanie w technikach mikroiniekcji u innych gatunków komarów.

Iniekcja embrionów An. stephensi w celu wytworzenia komarów odpornych na malarię

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

W tym filmie opisujemy nukleofekcję, procedurę transfekcji opartą na elektroporacji, polegającą na dostarczeniu fluorescencyjnego plazmidowego DNA kodującego białko reporterowe do sporozoitowej formy pasożyta Eimeria kurczaka.

Nukleofekcja form pasożytniczych: metoda transfekcji oparta na elektroporacji polegająca na dostarczaniu plazmidów kodujących białka fluorescencyjne do jądra sporozoitu

Ten film demonstruje generowanie eksperymentalnego mysiego modelu malarii mózgowej. Sporozoity wyizolowane z samic komarów zakażonych Plasmodium berghei są wstrzykiwane do uwięzionych żył ogonowych myszy, co prowadzi do przerwania bariery krew-mózg i zapalenia mózgu, powodując malarię mózgową. Ten zakażony model myszy stanowi cenne narzędzie do badania in vivo patologii mikrokrążenia związanej z malarią mózgową.

Wygenerowanie mysiego modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem sporozoitów pochodzących od komarów gospodarzy

Ten film demonstruje test do immunizacji modelu myszy żywymi, atenuowanymi sporozoitami. Osłabione promieniowaniem sporozoity Plasmodium są wstrzykiwane do grzbietowej strony ucha myszy. Po wstrzyknięciach w wielu miejscach na obu uszach mysz może dojść do siebie.

Immunizacja śródskórna żywymi atenuowanymi sporozoitami w modelu mysim

Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i drenowania węzłów chłonnych po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów Plasmodium. Cytometria przepływowa pobranych komórek zapewnia wiarygodny test charakteryzujący reakcję zapalną skóry i węzłów chłonnych drenujących na pasożyta.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Opisujemy metodę generowania mutantów warunkowego knockdown opartych na glmS w Plasmodium falciparum przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9.

Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Rozwój płciowy zarodźca zachodzi w jelicie środkowym komara. Celowanie w stadia płciowe pasożyta jest obiecującą strategią blokowania transmisji. Opracowaliśmy Ookluc, transgeniczny P. berghei wykazujący ekspresję nanolucyferazy po utworzeniu zygoty, umożliwiający wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków blokujących transmisję. W tym artykule szczegółowo opisano metody badań przesiewowych przy użyciu Ookluc.

Ookluc: Linia Plasmodium berghei do identyfikacji związków blokujących transmisję

Poznaj metodę wytwarzania genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei w celu badania biologii malarii. Ta technika wspiera rozwój szczepionek przeciwko malarii i pozwala zrozumieć interakcje pasożyta z gospodarzem.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Przeglądaj więcej filmów