Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Obecnie mamy ograniczoną wiedzę na temat biologii zakażenia wątroby przez zarodźc. Ten protokół pomógł nam wygenerować wiele linii transgenicznych, które pomogły odpowiedzieć na kilka krytycznych pytań dotyczących biologii organizmu. Podstawowa wiedza na temat pasożyta i jego biologii jest niezbędna do opracowania nowych narzędzi i podejść do zwalczania zakażenia malarią.

Metoda transgenezy, którą tutaj opisujemy, pomogła nam rozszyfrować niektóre kluczowe i złożone biologie organizmu, a także gospodarza. Tę procedurę zademonstruje Carson Bowers, mój kierownik laboratorium. Po wygenerowaniu myszy zakażonych P.Bergehei i poddaniu ich eutanazji, należy pobrać dwa mililitry krwi od dwóch zakażonych myszy do pięciu mililitrów roztworu Elsevier w sterylnym środowisku.

Odwirować krew o stężeniu 450 G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad ogniwa w 10 mililitrach kompletnego podłoża RPMI. Ponownie odwiruj zawiesinę komórek i ponownie zawieś osad w 25 mililitrach kompletnego podłoża RPMI.

Przenieść zawiesinę komórek do kolby hodowlanej T75 z nasadką filtrującą i inkubować, delikatnie wstrząsając, aby utrzymać komórki w zawiesinie. Pod koniec inkubacji zebrać 500 mikrolitrów próbki. Odwirować i ponownie zawiesić osad w 10 mikrolitrach kompletnego podłoża RPMI.

Następnie przygotuj cienki rozmaz krwi. Barwić rozmaz krwi barwnikiem Giemsa i określić częstotliwość występowania schizontów. Aby uzyskać optymalną skuteczność transfekcji, 60 do 70% pasożytów powinno znajdować się w stadium schizontu.

Przygotować gradientowy bufor wirowy, odtwarzając 13 mililitrów pożywki wyjściowej o gradiencie gęstości w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Przenieś 25 mililitrów posiewu krwi do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie ostrożnie ułóż 20 mililitrów gradientowego buforu wirującego na dnie probówki wirówkowej, używając wąskiej szklanej pipety, aby utworzyć kolumnę gradientową i zapewnić wyraźny podział między buforem a pożywką.

Odwirować przygotowany bufor i pożywkę przez 20 minut w temperaturze 450 G, bez przerwy, w temperaturze pokojowej. Za pomocą pipety pastwiskowej ostrożnie usunąć warstwę schizontu na styku pożywki hodowlanej i buforu wirowania gradientowego. Umieść go w nowej 50-mililitrowej probówce wirówkowej.

Ponownie zawieś izolowane schizonty w kompletnych nośnikach RPMI i zwiększ całkowitą objętość do 40 mililitrów. Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić schizont w 10 mililitrach kompletnej pożywki RPMI. Następnie przenieś jeden mililitr tego roztworu do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej dla każdej transfekcji i osadzaj zainfekowane komórki przez odwirowanie w temperaturze 16 000 G przez pięć sekund.

Następnie połącz 100 mikrolitrów buforu do elektroporacji w temperaturze pokojowej z pięcioma mikrogramami docelowego plazmidowego DNA w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Po odwirowaniu zakażonych komórek usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić komórki w przygotowanym roztworze nukleofektora wraz z plazmidowym DNA. Następnie przenieś zawiesinę do elektroporacji, kuwet i transfektu za pomocą odpowiedniego programu nukleofektorowego.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów kompletnego nośnika RPMI do kuwety. Przenieś cały roztwór do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i umieść ją na lodzie. Sprawdź poziom parazytemii u myszy zaszczepionych transfekowanym schizontem codziennie od dwóch dni po inokulacji.

Po potwierdzeniu zakażenia należy rozpocząć wybór leku od podania leku doustnie i picia wody oferowanej ad libitum. Monitorować parazytemię za pomocą rozmazów krwi, począwszy od sześciu dni po rozpoczęciu leczenia pirometyminą. Gdy parazytemia osiągnie co najmniej 1%, przenieś pasożyty do naiwnych myszy B6 w celu wytworzenia zapasów pasożytów we krwi.

Gdy pasożyt osiągnie od 2% do 5%, generuj zapasy i przechowuj je w kriokonserwacji. Dzień przed zakażeniem komarami należy oddzielić samice komarów, umieszczając rękawicę wypełnioną wodą podgrzaną do 37 stopni Celsjusza na klatce zawierającej zarówno samce, jak i samice komarów. Użyj aspiratora do owadów, aby usunąć samice komarów przyciągnięte do źródła ciepła i przenieś je do mniejszej klatki w celu infekcji.

W dniu żerowania komarów i infekcji określ pasożyt u zakażonych myszy B6. Parazytemia od 2% do 5% jest optymalna dla infekcji komarami. Po zweryfikowaniu parazytemii przenieś infekcję na samice komarów, umieszczając znieczulone myszy na samicach komarów w klatce w pozycji leżącej mostka.

Ręcznie rozłóż przednie i tylne nogi, aby zapewnić jak największą powierzchnię do żerowania komarów. Pozostaw zainfekowane myszy w każdej klatce na 15 minut, sprawdzając co pięć minut, czy myszy nie są obudzone. Po zakończeniu karmienia i uśpieniu myszy należy je bezpiecznie zutylizować, postępując zgodnie z wytycznymi instytucji.

Aby zweryfikować powodzenie infekcji u komarów, odizoluj jelita środkowe komarów, usuwając końcowy segment brzuszny za pomocą kleszczy 10 dni po zakażeniu. Następnie obejrzyj jelita środkowe w spolaryzowanym świetle, aby wykryć obecność oocyst. Po 18 dniach od zakażenia przeprowadź sekcję od pięciu do 10 komarów, aby ocenić liczbę obecnych sporozoitów.

Aby wyizolować i policzyć sporozoity, ostrożnie usuń głowę komara, jednocześnie wywierając nacisk na klatkę piersiową kleszczami lub cienką igłą preparacyjną. Gruczoły ślinowe pozostaną przyczepione do usuniętej głowy. Następnie usuń wszelkie dodatkowe resztki komarów z gruczołów ślinowych i umieść je w probówce z mikrowirówką zawierającą 400 mikrolitrów pożywki do preparowania komarów.

Następnie zakłócić izolowane gruczoły ślinowe, przepuszczając je przez strzykawkę z igłą o rozmiarze 30 od 15 do 20 razy, Następnie umieść 10 mikrolitrów uszkodzonych gruczołów ślinowych w pożywce do preparowania komarów do hemocytometru i policz. Na koniec ponownie zawiesić gruczoły ślinowe w pożądanym stężeniu pożywki do preparowania komarów lub PBS do wstrzykiwania myszom lub długotrwałej kriokonserwacji. Podobnie jak w przypadku mikroskopii, przedstawiono obrazy przedstawiające dojrzałe i niedojrzałe P.berghei schizont w pasożytniczych hodowlach krwi myszy.

Podobnie jak w przypadku zdjęć mikroskopowych głowy komara z nienaruszonymi gruczołami ślinowymi podczas sekcji, oraz wypreparowanego gruczołu ślinowego w mniejszym i większym powiększeniu. Generowanie sygnału zielonej fluorescencji w PB, zakażonym GFP 11 HEPA GFP od jednej do 10 komórek gospodarza wskazywało na lizę wakuoli parazytoforycznej. Ważne jest, aby ostrożnie usunąć warstwę szesonu bez zakłócania interfejsu gradientu.

Wymaga to również trochę praktyki, aby niezawodnie usunąć gruczoły ślinowe wraz z głową podczas izolacji zarodników światłem. Po izolacji, transgeniczne sporozoity mogą być kriokonserwowane lub używane świeże do badań infekcji in vivo lub in vitro.