Name: Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Odkryj protokół wytwarzania endodermalnych organoidów wątrobowych w ciągu dwóch tygodni z zachowaniem funkcjonalności przez ponad rok. Ta metoda wspiera badania nad biologią wątroby i medycyną regeneracyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez Turecką Radę Badań Naukowych i Technologicznych (TÜBİTAK) w ramach projektów SBAG-115S465 i SBAG-213S182. Rysunek 1 został wygenerowany przy użyciu BioRender.

<ol><li>Huch, M., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Marsee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+consensus+on+definition+and+nomenclature+of+hepatic%2C+pancreatic%2C+and+biliary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+and+reproducible+production+of+liver+buds+entirely+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+organoids+for+the+analysis+of+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases.</a> JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).</li>
<li>Ramli, M. N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Akbari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((long-term+culture+of+endoderm-derived+hepatic+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Meisenheimer, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proluciferin+acetals+as+bioluminogenic+substrates+for+cytochrome+P450+activity+and+probes+for+CYP3A+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition.</a> Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).</li>
<li>Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+ADME+evaluation%3A+dialing+in+CYP+selectivity+with+luminogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).</li>
<li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminogenic+cytochrome+P450+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Luminogenic cytochrome P450 assays.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li>
<li>Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+liver+medicine+using+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-generation liver medicine using organoid models.</a> Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+organization+in+hepatocyte+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological organization in hepatocyte organoid cultures.</a> American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).</li>
<li>Shinozawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+drug-induced+liver+injury+screen+using+human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids.</a> Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatobiliary+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów. Esra Erdal jest współzałożycielką firmy biotechnologicznej ORGANO-ID.

Niniejszy protokół opisuje kompleksową metodę wytwarzania, namnażania i zamrażania/rozmrażania organoidów wątrobowych, zaczynając od iPSC. Protokół ten obejmuje wszystkie etapy, w tym hodowlę iPSC na paszy i hodowli bezkarmowej, 2-wymiarowe różnicowanie endodermy, wzbogacanie komórek progenitorowych w FACS i tworzenie organoidów oraz generowanie organoidów zyskujących funkcję. Ponadto znajdują się tam również szczegółowe instrukcje dotyczące walidacji i charakterystyki organoidów. Główną przeszkodą w szerokim zastosowani...

Organoidy to zminiaturyzowane struktury podobne do narządów hodowane w trójwymiarowych warunkach hodowli, które naśladują mikrośrodowisko narządu i obejmują wewnętrzne czynniki niezbędne do samoorganizacji i samoodnowy w samym rozwoju narządów. Organoidy mogą pochodzić zarówno z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), jak i dorosłych komórek pochodzących z tkanek (komórek macierzystych lub progenitorowych)1. Chociaż ich dokładna organizacja narządowa i funkcjonalne podobieństwo do konkretnego narządu sprawiają, że są one cennymi narzędziami do modelowania chorób, nadal wymagają dalszych ulepszeń w zakresie standaryzacji w hodowli. W szczególności opublikowano kilka protokołów wytwarzania organoidów wątrobowych, które różnią się złożonością i odtwarzalnością2. Na przykład organoidy pączków wątroby opracowane przez Takebe i wsp. mają postać gęstych, wielokomórkowych struktur zawierających następujące indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC): komórki progenitorowe endodermy wątroby, ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i mezenchymalne komórki macierzyste (MSC). Organoidy te nie mają jednak długoterminowej zdolności do samoodnawianiasię 3,4.
Z perspektywy historycznej, Huch i in. po raz pierwszy opisali produkcję ludzkich organoidów nabłonka wątroby pochodzących z dorosłej tkanki, w której komórki polaryzują się i specjalizują w odtwarzaniu aspektów natywnego nabłonka5. Następnie Guan i in. wykorzystali organoidy wątrobowe pochodzące z iPSC do modelowania zespołu Alagille'a (ALGS), rzadkiego zaburzenia genetycznego związanego z redukcją dróg żółciowych w wątrobie6. Oba te organoidy mają zdolność samoodnawiania się i mogą uzyskiwać dojrzałe funkcje hepatocytów, takie jak wydzielanie żółci i albuminy, magazynowanie glikogenu i detoksykacja leków specyficzna dla wątroby. W niedawnym badaniu Ramli i in. wprowadzili model organoidu wątroby pochodzący z PSC zawierający funkcjonalne sieci kanalików żółciowych między spolaryzowanymi komórkami podobnymi do hepatocytów (HLC), które opróżniają leki cholesterolostatyczne do torbieli żółciowych złożonych z komórek podobnych do cholangiocytów (CLC)7.
W badaniu przedstawiono unikalną kulturę do generowania endodermalnych organoidów wątrobowych pochodzących z iPSC, zwanych eHEPOs. Opisano krok po kroku hodowlę iPSC i różnicowanie w endodermę, a także zademonstrowano wytwarzanie eHEPO ze wzbogaconych progenitorów EpCAM+. Na koniec opisano charakterystykę funkcjonalności i organizacji strukturalnej eHEPO, a także krioprezerwację organoidów.

<table><tbody><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>37 &stopnie; C Łaźnia wodna</td><td>N&uuml; Ve</td><td>210.NB9</td><td></td></tr><tr><td>37 &stopnie; C, inkubator 5 % CO2</td><td>Memmert powiedział:</td><td>INCO 153 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>70 &mikro; m oraz 40 i mikro; m Sitko komórkowe</td><td>Sokół</td><td>352350/ 352340</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Sigma</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>A1AT</td><td>Księga Abcam</td><td>ab166610 powiedział:</td><td>Rozcieńczenie: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>A-83.01 (inhibitor TGF-&beta)</td><td>Tocris Biosciene</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Isolab (Laboratorium Isolab)</td><td>9,01,026</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepne szkiełko mikroskopowe</td><td>Wiązanie histobondem</td><td>C981040</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany aparat DMEM-F12</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>AFP</td><td>Księga Abcam</td><td>ab3980 powiedział:</td><td>Rozcieńczenie: 1/25 (IHC)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>EMS</td><td>10200</td><td></td></tr><tr><td>ALB</td><td>Księga Abcam</td><td>ab10241 powiedział:</td><td>Rozcieńczenie: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>Mąka Alexa 488 (mysz)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Mąka Alexa 488 (Królik)</td><td>Invitrogen</td><td>A110034</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Mąka Alexa 594 (mysz)</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Mąka Alexa 594 (Królik)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Nr kat. A11037</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania amoniaku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK-310</td><td></td></tr><tr><td>Kloryd amonu</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-202936 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement 50x</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Forma bazowa</td><td>Sakura Sakura</td><td>4216</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF (Fundusz Finansowy)</td><td>Peprotech</td><td>100-18 mld</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczeństwo biologiczne, KLASA II, SZAFA BEZPIECZEŃSTWA</td><td>Thermo</td><td>BEZPIECZNY 2020</td><td></td></tr><tr><td>Pipety kalibrowane</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Choliglicylamamidofluoresceina</td><td>Corning</td><td>451041</td><td></td></tr><tr><td>Bufor cytrynianowy pH 6,0</td><td>Bio-optica (biooptyka)</td><td>Zobacz materiał 15-M103</td><td></td></tr><tr><td>CK-18 powiedział:</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-51582</td><td>Rozcieńczenie: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>CK-19 powiedział:</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6278 powiedział:</td><td>Rozcieńczenie: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>Zobacz materiał LSM880</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice kriogeniczne i ochrona oczu</td><td>Kriokit</td><td>5274</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Księga Leica</td><td>CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>Probówki kriowialne</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Roche</td><td>11718096001</td><td></td></tr><tr><td>DAPT (Język angielski)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5942 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał D4902</td><td></td></tr><tr><td>Usuwać&nbsp;</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie E-CAD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-8426 powiedział:</td><td>Rozcieńczenie: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy</td><td>Zeiss</td><td>Sigma500 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA</td><td>Fortis nauki przyrodnicze bethyl</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do osadzania Embed 812</td><td>EMS</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>Entellan (Entellan)</td><td>Merck</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y %1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110332</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (Protokół EpCAM)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>Rozcieńczenie: 1/11 (FACS)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1,00,98,32,511</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>26010066</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina (FSK)</td><td>Tocris Biosciene</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania (Mr. Frosty)</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażanie podłoża</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Isolab (Laboratorium Isolab)</td><td>084.01.001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd gluterowy %25, klasa EM</td><td>EMS</td><td>16210-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kozioł Anty-Myszy HRP</td><td>Rybak termiczny</td><td>62-6520</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000 (IHC)</td></tr><tr><td>Kozioł anty-królik HRP</td><td>Rybak termiczny</td><td>31460</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000 (IHC)</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>162-10-072</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksyliną</td><td>Milipory</td><td>HX86017674</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HNF-4&alfa;</td><td>Księga Abcam</td><td>ab55223 powiedział:</td><td>Rozcieńczenie: 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>Lód i suchy lód</td><td>domowej roboty</td><td>domowej roboty</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (65 &deg; C)</td><td>N&uuml; Ve</td><td>Norma EN 400</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>Leu15 Gastrin I człowiek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał G9145</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>Technika Bertholda</td><td>LB 960</td><td></td></tr><tr><td>Mistrz mieszanki&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>43676659</td><td></td></tr><tr><td>Matryca Matrigel, kwalifikowana do badania klinicznego zaleceń macierzystych ESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Matryca Matrigel, wolna od czerwieni fenolowej</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Axygen (Axigen)</td><td>321-02-501</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>AXIO VERT A1</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze mikrotomu</td><td>Pióro</td><td>S35, C35</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 powiedział:</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>SC-05850 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Wielodołkowe płytki do hodowli zawiesiny</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>83,39,21,500</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2 100x</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna buforowana formalina %10</td><td>Tekkim</td><td>TK.60161.05001</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PAŹ</td><td>Tka tkankowa</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tetrtlenek osmu</td><td>EMS</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów P450-Glo&nbsp;</td><td>Preparat Promega</td><td>Zobacz materiał V9001</td><td></td></tr><tr><td>Pióro papkowe</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Tekkim</td><td>TK.200661.01002</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw plam PAS</td><td>Księga Abcam</td><td>ab150680 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>be17-516 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosfotungustynowy</td><td>Teda Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>Przystawka do pipet</td><td>Axygen (Axigen)</td><td>Motopet-1</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek varioskan flash&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>5250040</td><td></td></tr><tr><td>Przedłuż mocowanie zapobiegające blaknięciu</td><td>Invitrogen</td><td>Zobacz materiał P36980 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu, klasa EM</td><td>EMS</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>System Real Time PCR</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>7500 Szybki&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka aktywina A</td><td>R& D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki BMP7</td><td>Peprotech</td><td>120-03</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF19</td><td>Peprotech</td><td>100-32</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor kinazy Rho, dichlorowodorek Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 1,5 ml wolna od RNaz/DNaz</td><td>Axygen (Axigen)</td><td>31108101</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrów wolne od RNaz/DNaz</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy</td><td>Księga Leica</td><td>Zobacz materiał RM 2245</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Średni</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka kondycjonowana Rspo1</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec slajdów</td><td>Bio-optica (biooptyka)</td><td>15-MEQ001 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Sorenson' s Bufor fosforanowy</td><td>EMS</td><td>11600-10</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Thermo</td><td>MÓJ SPIN 6</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne</td><td>Sokół</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta na tkanki</td><td>Księga Leica</td><td>3802240</td><td></td></tr><tr><td>Trymer</td><td>Księga Leica</td><td>EM TRIM2</td><td></td></tr><tr><td>Tryton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td></td></tr><tr><td>Enzym ekspresowy TrypLE</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Księga Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranyoctanu</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Wir</td><td>Thermo</td><td>88880018</td><td></td></tr><tr><td>Białko fuzyjne Wnt Surrogate-Fc</td><td>Odporność immunologiczna</td><td>N001 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>16446</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td>Rozcieńczenie: 1/400 (IF)</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Generation of Functional Endodermal Hepatic Organoids

Technologia organoidów pozwoliła nam wygenerować in vitro różnorodne mini struktury przypominające ludzkie narządy, takie jak wątroba, mózg i jelita. Niezwykłe postępy w modelach organoidowych otworzyły niedawno nową erę eksperymentalną dla różnych zastosowań w modelowaniu chorób, biologii rozwojowej i odkrywaniu leków. Dorosłe komórki macierzyste lub organoidy wątrobowe pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) regulują wytwarzanie hepatocytów do wykorzystania w różnych zastosowaniach. W tym miejscu przedstawiamy solidny i powtarzalny protokół generowania organoidów wątrobowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Protokół ten ma zastosowanie do komórek zdrowych i pochodzących od pacjentów. Aby uzyskać organoidy wątrobowe 3D pochodzące z endodermy (eHEPO), iPSC najpierw bezpośrednio różnicowano w komórki endodermalne, a następnie wykorzystano komórki EpCAM (EpCAM+) wzbogacone w FACS do ustanowienia organoidów wątrobowych przy użyciu pożywki ekspansyjnej. Zapewniamy szybką i wydajną metodę generowania organoidów wątrobowych w ciągu 2 tygodni. Wygenerowane organoidy naśladują podstawowe właściwości i funkcje hepatocytów, takie jak wydzielanie albuminy, magazynowanie glikogenu i aktywność enzymu cytochromu P450. Oprócz podobieństw ekspresji genów specyficznych dla wątroby, eHEPO zawierają spolaryzowane komórki nabłonkowe z kanalikami żółciowymi pomiędzy nimi. Ponadto eHEPO mogą być ekspandowane i szeregowe pasaże długoterminowe (1 rok) bez utraty zdolności do różnicowania się w dojrzałe hepatocyty. W ten sposób eHEPO stanowią alternatywne źródło do produkcji funkcjonalnych hepatocytów.

W pierwszej kolejności hodowano ludzkie fibroblasty lub monocyty krwi obwodowej (PBMC), które następnie przekształcono w iPSC poprzez reprogramowanie episomalne. Aby uzyskać zdrowe iPSC, niezbędne było zastosowanie świeżej surowicy knockout. Następnie iPSC wysiano na płytki hodowlane pokryte BMM, osiągając 50%-60% konfluencji. Posiadanie kolonii iPSC o małym lub średnim rozmiarze poprawiło wydajność różnicowania. Kolejno iPSC różnicowano w kierunku ostatecznej endodermy przez 5 dni, stosując pożywkę zawierającą ...

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Organoid technology has allowed us to generate a variety of human organ-like mini structures, such as for the liver, brain, and intestine, in vitro. The ...

Nasze badania mają na celu opracowanie istotnych dla człowieka modeli wątroby in vitro do testowania skuteczności i bezpieczeństwa leków, ściśle naśladując zdrowe i chore tkanki wątroby w badaniach przedklinicznych. Odtworzenie pełnej złożoności wątroby, osiągnięcie długoterminowej funkcjonalności, standaryzacja protokołów i skalowanie produkcji organoidów do zastosowań o wysokiej przepustowości pozostają głównym wyzwaniem eksperymentalnym w badaniach nad organoidami. Niedawno modelowaliśmy zwłóknienie wątroby na podstawie zdrowych organoidów wątrobowych i ustaliliśmy modele rzadkich chorób wątroby, w tym cytrulinemii i niedoboru karboksylazy pirogronianowej, na podstawie komórek pochodzących od pacjenta. W przeciwieństwie do innych metod, nasz protokół eHEPO zapewnia funkcjonalne organoidy wątroby szybko i na dużą skalę, wspierając długoterminową funkcjonalność i wiele testów z jednej spójnej populacji wyjściowej.[Narrator] Na początek dodaj 6 mililitrów zimnego DMEM / F-12 do 15-mililitrowej stożkowej tuby. Natychmiast dodaj 80 mikrolitrów matrycy membrany podstawnej FOD lub BMM do probówki i dobrze wymieszaj. Pokryj płytkę studzienkową poddaną działaniu kultur tkankowych roztworem BMM i dozuj roztwór, aby pokryć powierzchnię płytki studzienki. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37° Celsjusza przez co najmniej godzinę. Weź indukowalną pluripotencjalną komórkę macierzystą lub płytkę IPSC i odessaj pożywkę specyficzną dla IPSC. Przepłukać płytkę za pomocą DMEM/F-12 lub DPBS i dodać 1 mililitr specyficznego enzymu do jednego dołka płytki 6-dołkowej. Po jednej minucie inkubacji odessać enzym i inkubować płytkę w temperaturze 37 ° Celsjusza przez pięć do siedmiu minut. Następnie dodaj 1 mililitr podgrzanej pożywki IPSC do płytki i delikatnie postukaj w bok, aby oderwać niezróżnicowane agregaty kolonii od powierzchni płytki. Delikatnie wymieszaj zawiesinę za pomocą 5-mililitrowej pipety serologicznej, a następnie wysiew zawiesiny komórek o pożądanej gęstości do dołka pokrytego BMM. Inkubuj komórki w temperaturze 37 ° Celsjusza przez trzy do pięciu dni, aby osiągnąć konfluencję 70%. Zastąp pożywkę IPSC pożywką endodermą przed rozpoczęciem różnicowania. Komórki po różnicowaniu nabierają kolczastego kształtu, co wskazuje na interakcję komórka-komórka. Przepłukać komórki endodermy PBS. Dodaj 300 mikrolitrów trypsyny. I inkubuj komórki przez pięć minut w inkubatorze. Dodaj 3 mililitry zimnego DMEM/F-12 do komórek i pipetuj końcówkami filtrującymi o pojemności 1,000 mikrolitrów, aby wygenerować pojedyncze komórki. Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwirować komórki przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu przemyć osad 10 mililitrami buforu FACS. Aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową, przefiltruj komórki za pomocą sitka o siatku o wielkości 100 mikrometrów, a następnie sitka o siatku o oczkach 40 mikrometrów przed odwirowaniem zawiesiny komórek przez pięć minut. Ponownie zawiesić 15 milionów komórek za pomocą 105 mikrolitrów buforu FACS i dodać 45 mikrolitrów FcR i 15 mikrolitrów EpCAM do zawiesiny. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 4° Celsjusza, chroniąc probówkę przed światłem. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu FACS, aby przepłukać zawiesinę komórek. Po odwirowaniu komórek ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach buforu FACS i dodaj 0,5 mikromola na mililitr DAPI do zawiesiny komórek w celu ilościowego określenia martwych komórek. Po posortowaniu komórek odwirować komórki o masie 300 x g przez pięć minut. Usunąć supernatant. I ponownie zawiesić od 3 000 do 5 000 ogniw w 20 mikrolitrach BMM. Zasiać komórki, dodając kroplę BMM do środka każdej 48-dołkowej płytki i inkubować komórki przez dwie minuty w temperaturze 37 ° Celsjusza, aż BMM zestale się. Nałożyć kroplę na podłoże rozprężne. Aby rozdzielić kroplę organoidu, wyrzuć podłoże organoidowe i dodaj 500 mikrolitrów zimnego Ad-DMEM/F-12 do studzienki. Użyj końcówek filtra o pojemności 1,000 mikrolitrów, aby energicznie pipetować kropelki BMM. Zbierz maksymalnie 10 kropelek BMM do 15-mililitrowych stożkowych probówek i dodaj 5 mililitrów zimnego Ad-DMEM/F-12. Umieść probówkę na lodzie na trzy do pięciu minut. Odwirować komórki przy 200 x g przez pięć minut w temperaturze 4° Celsjusza i wyrzucić supernatant do momentu, aż pozostanie 1 mililitr supernatantu. Energicznie pipetować granulkę komórkową 30 do 40 razy za pomocą końcówek filtrujących o pojemności 200 mikrolitrów. Po dysocjacji mechanicznej dodać 5 mililitrów zimnego Ad-DMEM / F-12 przed odwirowaniem komórek przez pięć minut. Odrzucić supernatant. I umieść zawiesinę na lodzie. Wysiewaj 50-mikrolitrową kroplę BMM. I dodaj 25 nanogramów na mililitr BMP7 do podłoża rozszerzającego. Po trzech dniach hodowli zastąp pożywkę pożywką różnicującą i hoduj komórki przez co najmniej 14 dni. Przeprowadzono analizę barwienia immunologicznego w celu sprawdzenia, czy organoidy pochodzące z komórek EpCAM+ są zaangażowane w linię wątrobową. Obecność komórek CK19+ i HNF4ɑ+ wskazuje, że w organoidach obecne są komórki progenitorowe hepatoblastów i dróg żółciowych. Dodatkowo organoidy wyrażające markery tkanki nabłonkowej, takie jak komórki E-CAD+ i sześcienne lub wielościenne komórki nabłonkowe eksprymujące ZO-1, wskazują na obecność ścisłych połączeń między komórkami. Immunohistochemia wykazała, że komórki E-CAD+ wykazywały wielokątną strukturę nabłonkową, odzwierciedlającą fenotyp podobny do hepatocytów. Obrazy eHEPO z transmisyjnej mikroskopii elektronowej są pokazane tutaj. Białe kółka wskazują międzykomórkowe kompleksy połączeniowe. Czarne strzałki pokazują zróżnicowanie powierzchni wierzchołkowej. A czerwona strzałka pokazuje poprzeczny przekrój mikrokosmków. Analiza qPCR wykazała, że organoidy uzyskały dojrzałe markery hepatocytów, takie jak ALB, A1AT, CYP3A4 i CYP3A7. Zabarwiony na różowo obszar w barwieniu PAS wskazuje na zdolność organoidów do magazynowania glikogenu. Ponadto nasza analiza wykazała zdolność organoidów do wydzielania ALB do pożywki hodowlanej, eliminowania amoniaku z pożywek hodowlanych, aktywność enzymu CYP3A4 i zdolność transportu kwasów żółciowych.

generation-of-functional-endodermal-hepatic-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

Ten protokół opisuje produkcję mysiego pozawątrobowego przewodu żółciowego 3-wymiarowego systemu organoidowego. Te organoidy żółciowe można utrzymywać w kulturze w celu badania biologii cholangiocytów. Organoidy żółciowe wyrażają markery zarówno komórek progenitorowych, jak i żółciowych i składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonka.

Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Długoterminowy system hodowli organoidów 3D ex vitro został stworzony z mysich hepatocytów. Organoidy te mogą być pasażowane i manipulowane genetycznie przez infekcję lentiwirusem o konstrukcji shRNA/ektopowej, transfekcję siRNA i inżynierię CRISPR-Cas9.

Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów (HLC) poprzez ciągłe uzupełnianie Activiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC do ostatecznej endodermy (DE).

Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

W tym miejscu opisano szczegółowe metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania ludzkich organoidów jelita cienkiego i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metody te mają na celu poprawę odtwarzalności, rozszerzenie skalowalności i skrócenie czasu pracy wymaganego do posiewu i pasażowania organoidów.

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Zapewniamy kompleksowy przegląd i udoskonalenie istniejących protokołów tworzenia organoidów raka wątrobowokomórkowego (HCC), obejmując wszystkie etapy hodowli organoidów. System ten służy jako cenny model do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i oceny skuteczności kandydatów na leki.

Opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku

Organoidy rewolucjonizują spersonalizowane modelowanie tkanek do rozwoju narządów, odkrywania leków i badań nad chorobami. Inżynieria organoidowa się naprzód w tworzeniu skomplikowanych tkanek syntetycznych. Celem jest zintegrowanie morfogenezy, technologii asembloidów i biomatryc w celu poczynienia postępów w inżynierii tkankowej. Protokół ten pomaga w modelowaniu organogenezy wątroby i ustalaniu wytycznych dotyczących budowy tkanek syntetycznych.

Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Odkryj protokół wytwarzania endodermalnych organoidów wątrobowych w ciągu dwóch tygodni z zachowaniem funkcjonalności przez ponad rok. Ta metoda wspiera badania nad biologią wątroby i medycyną regeneracyjną.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Przeglądaj więcej filmów