Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Nasze badania mają na celu opracowanie istotnych dla człowieka modeli wątroby in vitro do testowania skuteczności i bezpieczeństwa leków, ściśle naśladując zdrowe i chore tkanki wątroby w badaniach przedklinicznych. Odtworzenie pełnej złożoności wątroby, osiągnięcie długoterminowej funkcjonalności, standaryzacja protokołów i skalowanie produkcji organoidów do zastosowań o wysokiej przepustowości pozostają głównym wyzwaniem eksperymentalnym w badaniach nad organoidami. Niedawno modelowaliśmy zwłóknienie wątroby na podstawie zdrowych organoidów wątrobowych i ustaliliśmy modele rzadkich chorób wątroby, w tym cytrulinemii i niedoboru karboksylazy pirogronianowej, na podstawie komórek pochodzących od pacjenta. W przeciwieństwie do innych metod, nasz protokół eHEPO zapewnia funkcjonalne organoidy wątroby szybko i na dużą skalę, wspierając długoterminową funkcjonalność i wiele testów z jednej spójnej populacji wyjściowej.

[Narrator] Na początek dodaj 6 mililitrów zimnego DMEM / F-12 do 15-mililitrowej stożkowej tuby. Natychmiast dodaj 80 mikrolitrów matrycy membrany podstawnej FOD lub BMM do probówki i dobrze wymieszaj. Pokryj płytkę studzienkową poddaną działaniu kultur tkankowych roztworem BMM i dozuj roztwór, aby pokryć powierzchnię płytki studzienki. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37° Celsjusza przez co najmniej godzinę. Weź indukowalną pluripotencjalną komórkę macierzystą lub płytkę IPSC i odessaj pożywkę specyficzną dla IPSC. Przepłukać płytkę za pomocą DMEM/F-12 lub DPBS i dodać 1 mililitr specyficznego enzymu do jednego dołka płytki 6-dołkowej. Po jednej minucie inkubacji odessać enzym i inkubować płytkę w temperaturze 37 ° Celsjusza przez pięć do siedmiu minut. Następnie dodaj 1 mililitr podgrzanej pożywki IPSC do płytki i delikatnie postukaj w bok, aby oderwać niezróżnicowane agregaty kolonii od powierzchni płytki. Delikatnie wymieszaj zawiesinę za pomocą 5-mililitrowej pipety serologicznej, a następnie wysiew zawiesiny komórek o pożądanej gęstości do dołka pokrytego BMM. Inkubuj komórki w temperaturze 37 ° Celsjusza przez trzy do pięciu dni, aby osiągnąć konfluencję 70%. Zastąp pożywkę IPSC pożywką endodermą przed rozpoczęciem różnicowania. Komórki po różnicowaniu nabierają kolczastego kształtu, co wskazuje na interakcję komórka-komórka. Przepłukać komórki endodermy PBS. Dodaj 300 mikrolitrów trypsyny. I inkubuj komórki przez pięć minut w inkubatorze. Dodaj 3 mililitry zimnego DMEM/F-12 do komórek i pipetuj końcówkami filtrującymi o pojemności 1,000 mikrolitrów, aby wygenerować pojedyncze komórki. Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwirować komórki przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu przemyć osad 10 mililitrami buforu FACS. Aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową, przefiltruj komórki za pomocą sitka o siatku o wielkości 100 mikrometrów, a następnie sitka o siatku o oczkach 40 mikrometrów przed odwirowaniem zawiesiny komórek przez pięć minut. Ponownie zawiesić 15 milionów komórek za pomocą 105 mikrolitrów buforu FACS i dodać 45 mikrolitrów FcR i 15 mikrolitrów EpCAM do zawiesiny. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 4° Celsjusza, chroniąc probówkę przed światłem. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu FACS, aby przepłukać zawiesinę komórek. Po odwirowaniu komórek ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach buforu FACS i dodaj 0,5 mikromola na mililitr DAPI do zawiesiny komórek w celu ilościowego określenia martwych komórek. Po posortowaniu komórek odwirować komórki o masie 300 x g przez pięć minut. Usunąć supernatant. I ponownie zawiesić od 3 000 do 5 000 ogniw w 20 mikrolitrach BMM. Zasiać komórki, dodając kroplę BMM do środka każdej 48-dołkowej płytki i inkubować komórki przez dwie minuty w temperaturze 37 ° Celsjusza, aż BMM zestale się. Nałożyć kroplę na podłoże rozprężne. Aby rozdzielić kroplę organoidu, wyrzuć podłoże organoidowe i dodaj 500 mikrolitrów zimnego Ad-DMEM/F-12 do studzienki. Użyj końcówek filtra o pojemności 1,000 mikrolitrów, aby energicznie pipetować kropelki BMM. Zbierz maksymalnie 10 kropelek BMM do 15-mililitrowych stożkowych probówek i dodaj 5 mililitrów zimnego Ad-DMEM/F-12. Umieść probówkę na lodzie na trzy do pięciu minut. Odwirować komórki przy 200 x g przez pięć minut w temperaturze 4° Celsjusza i wyrzucić supernatant do momentu, aż pozostanie 1 mililitr supernatantu. Energicznie pipetować granulkę komórkową 30 do 40 razy za pomocą końcówek filtrujących o pojemności 200 mikrolitrów. Po dysocjacji mechanicznej dodać 5 mililitrów zimnego Ad-DMEM / F-12 przed odwirowaniem komórek przez pięć minut. Odrzucić supernatant. I umieść zawiesinę na lodzie. Wysiewaj 50-mikrolitrową kroplę BMM. I dodaj 25 nanogramów na mililitr BMP7 do podłoża rozszerzającego. Po trzech dniach hodowli zastąp pożywkę pożywką różnicującą i hoduj komórki przez co najmniej 14 dni. Przeprowadzono analizę barwienia immunologicznego w celu sprawdzenia, czy organoidy pochodzące z komórek EpCAM+ są zaangażowane w linię wątrobową. Obecność komórek CK19+ i HNF4ɑ+ wskazuje, że w organoidach obecne są komórki progenitorowe hepatoblastów i dróg żółciowych. Dodatkowo organoidy wyrażające markery tkanki nabłonkowej, takie jak komórki E-CAD+ i sześcienne lub wielościenne komórki nabłonkowe eksprymujące ZO-1, wskazują na obecność ścisłych połączeń między komórkami. Immunohistochemia wykazała, że komórki E-CAD+ wykazywały wielokątną strukturę nabłonkową, odzwierciedlającą fenotyp podobny do hepatocytów. Obrazy eHEPO z transmisyjnej mikroskopii elektronowej są pokazane tutaj. Białe kółka wskazują międzykomórkowe kompleksy połączeniowe. Czarne strzałki pokazują zróżnicowanie powierzchni wierzchołkowej. A czerwona strzałka pokazuje poprzeczny przekrój mikrokosmków. Analiza qPCR wykazała, że organoidy uzyskały dojrzałe markery hepatocytów, takie jak ALB, A1AT, CYP3A4 i CYP3A7. Zabarwiony na różowo obszar w barwieniu PAS wskazuje na zdolność organoidów do magazynowania glikogenu. Ponadto nasza analiza wykazała zdolność organoidów do wydzielania ALB do pożywki hodowlanej, eliminowania amoniaku z pożywek hodowlanych, aktywność enzymu CYP3A4 i zdolność transportu kwasów żółciowych.