Name: Test wychwytu przeciwciał do śledzenia endocytozy Notch/Delta podczas asymetrycznego podziału radialnych progenitorów gleju danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Odkryj test wychwytu przeciwciał do śledzenia endocytozy Notch/DeltaD w radialnych progenitorach gleju danio pręgowanego. Ta metoda umożliwia badanie sygnałowania komórkowego podczas asymetrycznego podziału w rozwoju mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt był wspierany przez NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation oraz Chan Zuckerberg Biohub.

Do badania użyliśmy linii AB typu dzikiego i linii transgenicznej Tg [ef1a:Myr-Tdtomato]. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco w USA (numer zatwierdzenia: AN179000).
1. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego
<ol>
	Po <li>południu przed godziną 17:00 należy ustawić zbiorniki do przechodzenia przez ryby z jedną samicą ryby typu dzikiego i jednym samcem Tg [ef1a:Myr-Tdtomato], używając przegród do oddzielenia ich w każdym zbiorniku.</li>
	<li>Następnego dnia rano należy usunąć przegrody ze wszystkich przejeżdżających zbiorników przed godziną 11:00. Zachowaj ciszę i nie przeszkadzaj rybom podczas krycia. Tarło następuje zwykle w ciągu 30 minut po usunięciu przegród. Zapłodnione jaja pozostają na dnie zbiornika.
	<ol>
		<li>Zbieraj zapłodnione jaja ze zbiorników za pomocą filtra siatkowego. Przenieś jaja, zmywając je na szalkę Petriego pełną wody jajecznej i zbadaj zarodki pod mikroskopem preparacyjnym w powiększeniu od 10 do 20 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść zapłodnione zarodki na czystą szalkę Petriego zawierającą około 20 ml pożywki zarodkowej (100 ml 1000 x roztworu podstawowego zawiera 29,4 g NaCl, 1,27 g KCl, 4,85 g CaCl 2,2H2O i 8,13 gMgSO4,7H2O) za pomocą szklanych pipet Pasteura o dużej średnicy. Przechowywać zarodki w temperaturze 28 °C. Przechowywać 50 zapłodnionych zarodków na szalce Petriego w 30 ml pożywki dla zarodków w temperaturze 28,5 °C. 
	UWAGA: Jedna para ryb zwykle produkuje 100-300 zarodków, a wskaźnik zapłodnienia i przeżywalności zdrowych zarodków wynosi ponad 95% dla każdego krycia.</li>
	<li>Następnego dnia rano wyjmij zarodki z inkubatora o godzinie 8:00, kiedy zarodki osiągną etap rozwojowy ~18-20 godzin po zapłodnieniu (hpf). Obserwuj je pod mikroskopem epifluorescencyjnym w 20-krotnym powiększeniu, początkowo używając światła białego. W tym czasie zarodki danio pręgowanego znajdują się w stadium 20 somitów.
	<ol>
		<li>Wyrzuć martwe zarodki, które są mętne lub pęknięte pod mikroskopem, za pomocą szklanej pipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz świetlówkę i wybierz ustawienie filtra RFP mikroskopu. Następnie wybierz zarodki o silnej czerwonej fluorescencji i przenieś je do nowego naczynia z wodą jajeczną.
	<ol>
		<li>Odkorówkę zarodków należy usunąć ręcznie za pomocą dwóch cienkich kleszczyków (końcówki kleszczy powinny być ostre i nieuszkodzone) w białym świetle (tabela materiałów).</li>
		<li>Przytrzymaj kosmówkę jedną parą kleszczy i rozerwij kosmówkę drugą parą kleszczy. Ostrożnie otwórz rozdarcie za pomocą kleszczy i spraw, aby była wystarczająco duża, aby zarodek mógł przez nią przejść, delikatnie popychając zarodek końcówkami innych kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść zdekorionowane zarodki na nową szalkę Petriego ze świeżą pożywką embrionalną w celu szybkiego spłukania przed mikrowstrzyknięciem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikroiniekcji
<ol>
	<li>Użyj kapilar (1,2 mm średnicy, 0,9 mm średnicy, z filamentem) do wyciągania cienkich igieł iniekcyjnych na ściągaczu. Zaprojektuj i zoptymalizuj program ciągnięcia zgodnie z instrukcją.</li>
	<li>Otwórz końcówkę igły za pomocą kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym. Średnica końcówki powinna wynosić około 10 μm, a kąt stożka około 30°.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem należy skoniugować mysie przeciwciało monoklonalne anty-Dld z przeciwciałem anty-Mysiem-IgG-Atto647N.
	<ol>
		<li>W każdym eksperymencie iniekcyjnym należy zmieszać 0,5 μl przeciwciała anty-Dld (0,5 mg/ml) z 2 μl przeciwciała anty-mysiego IgG-Atto647N (1 mg / ml), pipetując 5-10 razy. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut (lub na lodzie przez 2-3 godziny).</li>
		<li>Po inkubacji dodać 2,5 μl buforu blokującego (10 mg/ml mysiej IgG) i 0,5 μl 0,5% czerwieni fenolowej do mieszaniny przeciwciał i pipetować 10x, aby dokładnie wymieszać, aby zablokować wszelkie niesprzężone przeciwciała pozostające w mieszaninie. 
		UWAGA: Do każdej próby należy przygotować jedną dodatkową mieszaninę bez przeciwciała anty-Dld i użyć jej jako kontroli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w pożywce zarodkowej. Podgrzewać mieszaninę zawierającą agarozę w temperaturze 70 °C, aż mieszanina stanie się przezroczysta.
	<ol>
		<li>Podwielokrotność roztworu agarozy rozmieścić w probówkach do mikrowirówek o objętości 2 ml. Przechowywać podwielokrotności w bloku grzewczym w temperaturze ~40 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opłucz zarodek w probówce zawierającej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia przez 3 s.</li>
	<li>Umieść zarodek na odwróconej plastikowej pokrywce szalki Petriego razem z pojedynczymi kroplami agarozy (~30-40 μL), aby zamontować każdy zarodek osobno na pokrywie, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Połóż zarodki płasko bocznie w agarozie i utrzymuj tę pozycję, aż agaroza zestali się w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zamontuj 12 zarodków w trzech rzędach jeden po drugim, jak powyżej. Przykryj wszystkie zamontowane zarodki w agarozie pożywką jajową.</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja
<ol>
	<li>Umieść osadzone zarodki pod mikroskopem stereoskopowym i zalej agarozę wodą jajeczną</li>.
	<li>Ustaw wtryskiwacz ciśnienia powietrza razem z mikromanipulatorami, umieszczając je blisko mikroskopów, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Użyj stalowej butli gazowej zawierającej gazowy azot (N2) pod wysokim ciśnieniem jako źródło powietrza.
	<ol>
		<li>Zawór gazowy należy otworzyć dopiero po zamontowaniu zarodków w agarozie. Następnie załaduj przygotowaną szklaną igłę z 2 μl mieszaniny przeciwciał na mikromanipulatorze, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1, podczas korzystania z przedniego modułu napełniającego mikrowtryskiwacza.</li>
		<li>Dostosuj ciśnienie wejściowe do ~80-90 psi, a ciśnienie wtrysku do ~20 psi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skalibruj objętość wtrysku za pomocą mikrometru pod mikroskopem, jak opisano wcześniej15. Ustaw czas strojenia na czas strojenia od 10 ms do 120 ms, w zależności od wielkości otworu igły. Dostarczyć każdy impuls wstrzyknięcia, stukając w łopatkę. Dostosuj objętość wstrzyknięcia każdej dawki do ~4-5 nL.</li>
	<li>Wbić końcówkę igły do mikroiniekcji przez grzbietową płytkę dachową tylnego odcinka mózgowia z tyłu do punktu zawiasu r0/r1 i wstrzyknąć około 10 nL (dwa lub trzy impulsy) mieszaniny przeciwciał bez uderzania w tkankę mózgową. Obserwuj przepływ czerwonych płynów w komorze mózgu. 
	UWAGA: Komora tyłomózgowia znajduje się za granicą tyłomózgowia śródmózgowia. Wstrzyknięta mieszanina przeciwciał zawierających czerwień fenolową natychmiast wypełnia komorę mózgu od tyłomózgowia do przodomózgowia poprzez dyfuzję z płynem mózgowo-rdzeniowym.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy szybko usunąć końcówkę igły z zarodka, obracając pokrętło mikromanipulatora. Aby wstrzyknięcie było udane, czerwony barwnik z wstrzykniętej mieszaniny pozostaje stabilnie w komorze mózgu, nie przeciekając do otaczającej agarozy.</li>
	<li>Przesuń płytkę montażową pod mikroskopem, aby zlokalizować inny zamontowany zarodek w odpowiedniej pozycji do powtórzeń.
	<ol>
		<li>Po wstrzyknięciu sześciu do ośmiu zarodków obierz agarozę nożem mikrochirurgicznym, aby uwolnić zarodki z osadzonej agarozy. Przenieś zarodki z mikrowstrzykniętymi zarodkami do świeżego naczynia z 30 ml pożywki dla zarodków i umieść je w temperaturze pokojowej do następnych kroków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Montaż i obrazowanie poklatkowe na żywo
<ol>
	<li>Po 30 minutach przenieść wybrane zarodki do 10 ml pożywki zarodkowej. Dodać 420 μl wywaru trikainowego (4 mg/ml) do 10 ml podłoża zarodkowego, aby znieczulić zarodki.</li>
	<li>Aby zamontować zarodki, przygotuj 0,8% agarozy o niskiej temperaturze topnienia zawierającej takie samo stężenie trikainy w probówce. Przechowywać podwielokrotności w bloku grzewczym w temperaturze ~40 °C.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety zanurz wstrzyknięte zarodki w ciepłej agarozie na 3 sekundy. Następnie natychmiast wyjmij zarodki z agarozy za pomocą tej samej szklanej pipety i umieść zarodki na środku 35-milimetrowych szklanych szalek hodowlanych z kroplą agarozy z probówki. Umieść tylko jeden zarodek na kroplę na szklance.</li>
	<li>Delikatnie ułóż zarodki za pomocą sondy światłowodowej lub końcówki ładującej, aby grzbietowa strona embrionalnego mózgu znajdowała się jak najbliżej szklanego dna. Delikatnie dostosuj pozycję zarodka, aby przedłużyć zarodek bez zwijania się, gdy agaroza stopniowo krzepnie.</li>
	<li>Następnie sprawdź pozycję zarodka, odwracając szklane dno naczynia. Upewnij się, że pod mikroskopem można zobaczyć całe grzbietowe przodomózgowie z prawidłowo zamontowanymi zarodkami.</li>
	<li>Dodać 2-3 ml podgrzanej pożywki embrionalnej o temperaturze 28,5 °C zawierającej trikainę, aby przykryć zarodek. Umieść naczynie prawidłowo na stoliku mikroskopu konfokalnego o kontrolowanej temperaturze, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 1. Ustawić temperaturę komory obrazowania na 28,5 °C. Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania.</li>
	<li>Wykonuj poklatkowe obrazowanie na żywo z ustalonym odstępem czasu, korzystając z obiektywu 40-krotnego zanurzenia w wodzie.
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania do obrazowania i sterowania mikroskopem (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.</li>
		<li>Wybierz kanały obrazowania 564 nm i 647 nm do obrazowania fluorescencji błony transgenicznego danio pręgowanego MyR-Tdtomato i endosomalnego anty-Dld-Atto647N w komórce (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Ustaw moc lasera na 30% dla obu kanałów. Użyj czasu naświetlania na płaszczyznę z wynoszącego 200 ms dla każdego kanału.</li>
		<li>Dla każdego zamontowanego zarodka danio pręgowanego należy zastosować krok Z skanowania wynoszący 1 μm dla łącznie 20 płaszczyzn Z i cykl skanowania obejmujący 100 ram czasowych.</li>
		<li>Ustaw odstęp czasu między każdym cyklem skanowania na 20 s a trybem skanowania jako kanał, wycinek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Baonza, A., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+directly+controls+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).</li>
<li>Chitnis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChitnis%2C+A+%22Developmental+Dynamics%22">Developmental Dynamics</a>. 235 (4), 886-894 (2006).</li>
<li>Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+trafficking+during+mitosis+and+notch-dependent+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+and+Subcellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division.</a> Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).</li>
<li>Le Borgne, R., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+endocytosis+makes+delta+signal+better%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: endocytosis makes delta signal better.</a> Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).</li>
<li>Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+endocytosis+is+induced+by+ligand+and+is+required+for+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-1+signalling+requires+ligand-induced+proteolytic+release+of+intracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain.</a> Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).</li>
<li>Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Delta+and+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division.</a> Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).</li>
<li>Derivery, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+by+spindle+asymmetry+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division.</a> Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).</li>
<li>Matsuda, M., Chitnis, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Notch+determines+endocytosis+of+specific+Delta+ligands+in+zebrafish+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue.</a> Development. 136 (2), 197-206 (2009).</li>
<li>Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).</li>
<li>Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralineage+directional+Notch+signaling+regulates+self-renewal+and+differentiation+of+asymmetrically+dividing+radial+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia.</a> Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+engage+cytoplasmic+Par-3+that+recruits+dynein+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division.</a> Science Advances. 7 (24), (2021).</li>
<li>Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+analysis+for+cryosectioned+and+immunostained+tissue+samples+with+or+without+label+retention+expansion+microscopy+%28LR-ExM%29+by+JACoP%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP.</a> Bio-Protocol. 12 (5), 4336(2022).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1218(2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+the+injection+volume+for+microinjection+of+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+multicolor+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy test wychwytu przeciwciał do znakowania i obrazowania endosomalnego transportu Notch/Delta u promienistych komórek progenitorowych gleju danio pręgowanego z wysoką skutecznością. W porównaniu z poprzednimi metodami stosowanymi do śledzenia znakowanego przeciwciała anty-DeltaD w komórkach Drosophila SOP 7,8, nasza metoda wykorzystywała mikroiniekcję zamiast inkubacji próbek w sprzężonym przeciwciałie. Fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała anty-Dld ...

Sygnalizacja Notch kontroluje decyzje dotyczące losu komórek i ich wzorce podczas rozwoju u metazoans1, a ostatnie badania wykazały, że sygnalizacja Notch w podziale komórek macierzystych zależy głównie od transportu endocytarnego2,3. Endocytozowany Notch/Delta może aktywować sygnalizację Notch w jądrze i wzmacniać transkrypcję docelowych genów Notch4,5,6. Kierunkowy transport endosomalny Notch/Delta został po raz pierwszy zaobserwowany w komórkach prekursorowych narządów zmysłów (SOP) Drosophila podczas asymetrycznego podziału komórkowego (ACD), co spowodowało wyższą aktywność sygnalizacyjną Notch w pIIa niż w pIIb7,8. Testy wychwytu przeciwciał z przeciwciałami anty-Delta i anty-Notch zastosowano do monitorowania procesu endocytarnego w mitotycznych komórkach SOP. Endosomy Notch/DeltaD przemieszczają się wraz z białkiem motorycznym kinezyny do wrzeciona centralnego podczas cytokinezy i są asymetrycznie translokowane do komórki pIIa z powodu antyrównoległego układu asymetrycznego wrzeciona centralnego w ostatnim momencie podziału komórki3,8. Badania te rzuciły światło na mechanizmy molekularne regulujące asymetryczny podział w komórkach SOP Drosophila, ale nie jest jasne, czy podobne procesy endocytarne występują w progenitorach promieniowych gleju kręgowców (RGP).
Ponadto, mechanizmy molekularne, które regulują asymetryczną sygnalizację Notch/DeltaD podczas podziału RGP kręgowców, nie są dobrze poznane. U danio pręgowanego doniesiono, że interakcja Notch i Delta ułatwia endocytozę ligandu DeltaD9. Nie wiadomo, czy endocytoza DeltaD może wpływać na wybór losu komórek potomnych w rozwijającym się mózgu kręgowców. Ostatnie badania pokazują, że wstrzyknięcie fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał anty-DeltaD do cewy nerwowej może oznaczać endosomy Sara specyficznie w komórkach neuronabłonkowych, a endosomy anty-DeltaD zawierające Sara preferencyjnie segregują się w proliferujące komórki potomne10. Sugeruje się, że sygnalizacja Notch z endosomów może regulować los komórek potomnych. Poprzednie wyniki wykazały, że większość komórek RGP danio pręgowanego w rozwijającym się przodomózgowiu przechodzi ACD, a determinacja losu komórek potomnych zależy od wewnątrzliniowej sygnalizacji Notch/DeltaD11. Aby wyjaśnić naturę wewnątrzliniowej sygnalizacji Notch/DeltaD w RGP danio pręgowanego, opracowaliśmy test wychwytu przeciwciał anty-DeltaD w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego. Korzystając z tego protokołu, z powodzeniem przeprowadziliśmy znakowanie na żywo i obrazowanie transportu endocytarnego DeltaD w mitotycznych RGP.
Fluorescencyjnie znakowane przeciwciało anty-DeltaD jest skutecznie internalizowane do RGP wzdłuż komory przodomózgowia. Znacznie ułatwiło to odkrycie kierunkowego transportu endosomów DeltaD w asymetrycznie dzielących się RGPs12,13. W porównaniu z poprzednimi protokołami wychwytu przeciwciał opracowanymi dla kultur Drosophila notum i rdzenia kręgowego danio pręgowanego10, protokół ten osiągnął długotrwałe i wysoce skuteczne znakowanie anty-DeltaD w warstwie komórek komory mózgu, w szczególności przy użyciu mniej niż 10 nL mieszaniny przeciwciał z mikrowstrzyknięciami. Wstrzyknięcie do komory tyłomózgowia jest bardzo wygodne do stosowania testu wychwytu przeciwciał w rozwijającym się mózgu, ponieważ komora tylnomózgowia jest dobrze rozszerzona w zarodkach danio pręgowanego i wypełniona płynem mózgowo-rdzeniowym we wczesnym stadium rozwoju14. Poprzez wstrzyknięcie mieszaniny przeciwciał do komory tyłomózgowia bez uszkodzenia jakichkolwiek kluczowych rozwijających się tkanek, protokół zminimalizował możliwe uszkodzenia strefy obrazowania w przodomózgowiu tak bardzo, jak to możliwe. Zmniejszona dawka wstrzykniętego przeciwciała pierwotnego pozwoliła również uniknąć potencjalnych skutków ubocznych zakłócania endogennej sygnalizacji Delta-Notch in vivo. Protokół ten można łatwo połączyć z innymi zaburzeniami farmakologicznymi lub genetycznymi, stosowanymi na różnych etapach rozwoju i prawdopodobnie dostosowanymi do dorosłego mózgu, a także ludzkich organoidów mózgowych 2D / 3D pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Podsumowując, protokół umożliwił zrozumienie, w jaki sposób i kiedy podczas ACD powstaje asymetria sygnalizacji Notch. Głównym wyzwaniem dla pomyślnego wdrożenia tego protokołu jest osiągnięcie precyzyjnego dostarczania odpowiednich stężeń przeciwciała w oparciu o określone warunki eksperymentalne.

<table><tbody><tr><td>Naczynie hodowlane ze szklanym dnem 35 mm&nbsp;</td>Wtryskiwacz ciśnienia powietrza <td>MatTek corporation</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse-IgG-Atto647N&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50185</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary, 1,2 mm OD, 0,9 mm ID, z filamentem</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-6</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 Wirujący dysk/szybkobieżny szerokokątny</td><td>nikin</td><td>N/A</td><td>Nikon&nbsp; Mikroskop fluorescencyjny odwrócony Ti z dużym polem widzenia CSU-W1 konfokalny.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pęseta medyczna Dumont Style 5</td> Thomas <td>Scientific</td><td>72877-D</td><td></td></tr><tr><td>Flaming-Brown P897 ściągacz</td><td>Sutter Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Mikromanipulatory</td><td></td> Sigma-Aldrich M2773 <td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-DLD&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB_1268496</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący IgG myszy firmy Zenon</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z25008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000&nbsp; &nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>N/A</td> Tricaine Sigma-Aldrich <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>UltraPureTM agaroza o niskiej temperaturze topnienia&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr></tbody></table>

test wychwytu przeciwciał do śledzenia endocytozy notch/delta podczas asymetrycznego podziału radialnych progenitorów gleju danio pręgowanego

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

Asymetryczny podział komórek (ACD), który wytwarza dwie komórki potomne o różnych losach, ma fundamentalne znaczenie dla generowania różnorodności komórkowej. W rozwijających się narządach zarówno bezkręgowców, jak i kręgowców, asymetrycznie dzielący się przodkowie generują samoodnawiającą się i różnicującą się córkęNotch lo. W embrionalnym mózgu danio pręgowanego promieniste komórki progenitorowe gleju (RGP) - główne nerwowe komórki macierzyste kręgowców - w większości przechodzą ACD, aby urodzić jeden RGP i jeden różnicujący się neuron. Przejrzystość optyczna i łatwa dostępność zarodków danio pręgowanego sprawiają, że idealnie nadają się one do obrazowania poklatkowego in vivo, aby bezpośrednio wizualizować, jak i kiedy asymetria sygnalizacji Notch jest ustalana podczas ACD. Ostatnie badania wykazały, że dynamiczna endocytoza liganda Notch DeltaD odgrywa kluczową rolę w określaniu losu komórki podczas ACD, a proces ten jest regulowany przez ewolucyjnie konserwatywny regulator polarności Par-3 (znany również jako Pard3) i kompleks motoryczny dyneiny. Aby zobrazować wzorce transportu in vivo endosomów sygnalizacyjnych Notch w mitotycznych RGP, opracowaliśmy ten test wychwytu przeciwciał. Korzystając z testu, odkryliśmy dynamikę endosomów zawierających DeltaD podczas podziału RGP.

Na Rysunku 2A zarodki wstrzyknięte z Atto647N, bez wiązania z przeciwciałem pierwotnym, wykazywały fluorescencję tła w komorze mózgu. W komórkach można zaobserwować bardzo niewiele pochłoniętych cząsteczek fluorescencyjnych. Zarodki rybek zebrafish, którym wstrzyknięto anti-Dld-Atto647N, wykazały duże ilości zinternalizowanych cząsteczek fluorescencyjnych w większości komórek rozwijającego się przodomózwia (Rysunek 2A, panel prawy). Po powiększeniu obrazu w celu...

Ta praca rozwija test wychwytu przeciwciał do obrazowania wewnątrzliniowej sygnalizacji Notch/DeltaD w dzielących się radialnych progenitorach gleju embrionalnej mózgu danio pręgowanego.

Test wychwytu przeciwciał do śledzenia endocytozy Notch/Delta podczas asymetrycznego podziału radialnych progenitorów gleju danio pręgowanego

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

Sygnalizacja karbu kontroluje decyzję i wzorzec siarczanów podczas rozwoju w metazoanach. Opracowaliśmy test wychwytu przeciwciał do znakowania ligandu delta-D i obrazowania jego transportu endocytarnego w promieniowych progenitorach gleju w rozwijającym się przodomózgowiu zebry. Ukryte wstrzyknięcie do komory mózgu danio pręgowanego umożliwia selektywny wychwyt anty-Dld-Atto-647N przez miotototyczne promieniste komórki progenitorowe gleju wyściełające komory mózgu w rozwoju z wysoką wydajnością i długotrwałymi efektami.Protokół ten można łatwo połączyć z innymi zaburzeniami farmakologicznymi lub genetycznymi stosowanymi na różnych etapach rozwoju i prawdopodobnie dostosowanymi do dorosłego mózgu, a także ludzkich organoidów mózgowych 2D lub 3D pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po wygenerowaniu zapłodnionych zarodków i inkubacji przez 18 do 20 godzin należy je wyjąć z inkubatora. Obserwuj je pod mikroskopem epifluorescencyjnym, używając najpierw białego światła w 20-krotnym powiększeniu.Wyrzuć martwe zarodki, które wydają się mętne lub pęknięte pod mikroskopem, za pomocą szklanej pipety. Następnie włącz świetlówkę i wybierz ustawienie filtra RFP mikroskopu. Wybierz zarodki o silnej czerwonej fluorescencji i przenieś je do nowego naczynia z wodą jajeczną.Teraz ręcznie usuń zarodki za pomocą dwóch cienkich kleszczyków w białym świetle. Przytrzymaj kosmówkę jedną parą kleszczy i rozerwij kosmówkę drugą parą kleszczy. Ostrożnie otwórz rozdarcie za pomocą kleszczy i spraw, aby była wystarczająco duża, aby zarodek mógł przez nią przejść, delikatnie popychając zarodek końcówkami innych kleszczy.Przenieść zdekorionowane zarodki na nową szalkę Petriego ze świeżą pożywką embrionalną w celu szybkiego spłukania przed mikrowstrzyknięciem. Po naciągnięciu cienkich igieł iniekcyjnych na ściągacz, otwórz końcówkę igły za pomocą kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym. Spraw, aby średnica końcówki wynosiła około 10 mikrometrów, a kąt stożka około 30 stopni.Teraz wymieszaj 0,5 mikrolitra przeciwciała anty-Dld z dwoma mikrolitrami przeciwciała anty mysiego LG Atto-647N, pipetując od pięciu do 10 razy w celu ich koniugacji i inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Pod koniec inkubacji dodać 2,5 mikrolitra buforu blokującego i 0,5 mikrolitra 0,5% czerwieni fenolowej do mieszaniny przeciwciał i wymieszać pipetując w celu zablokowania wszelkich niesprzężonych przeciwciał pozostających w mieszaninie. Następnie przygotuj 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia w pożywce zarodkowej.Podgrzej mieszaninę zawierającą agarozę w temperaturze 70 stopni Celsjusza, aż mieszanina stanie się przezroczysta. Po podaniu roztworu agarozy trzymaj je w bloku grzewczym w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Opłucz zarodek w probówce zawierającej 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia przez trzy sekundy.Umieść zarodek na odwróconej plastikowej pokrywce szalki Petriego z pojedynczymi kroplami agarozy, aby zamontować każdy zarodek osobno. Połóż zarodki płasko bocznie w agarozie i utrzymuj tę pozycję, aż agaroza zestali się w temperaturze pokojowej. Przykryj wszystkie zamontowane zarodki w agarozie pożywką jajową.Umieść osadzone zarodki pod mikroskopem stereoskopowym i zalej agarozę wodą jajeczną. Ustaw wtryskiwacz ciśnienia powietrza za pomocą mikromanipulatorów, umieszczając je blisko mikroskopów. Użyj stalowej butli z gazem zawierającej gazowy azot pod wysokim ciśnieniem jako źródła powietrza.Po zamontowaniu zarodków w agarozie otwórz zawór gazowy. Korzystając z modułu napełniania przedniego mikrowtryskiwacza, załaduj przygotowaną szklaną igłę z dwoma mikrolitrami mieszaniny przeciwciał na mikromanipulatorze. Teraz dostosuj ciśnienie wejściowe do 80 do 90 funtów na cal kwadratowy, a ciśnienie wtrysku do 20 funtów na cal kwadratowy.Skalibrować objętość wstrzyknięcia za pomocą mikrometru pod mikroskopem. Ustaw czas trwania strojenia zgodnie z rozmiarem otworu igły od 10 do 120 milisekund. Dotknij łopatki, aby dostarczyć każdy impuls wstrzyknięcia i dostosuj objętość wstrzyknięcia każdej dawki do czterech do pięciu nanolitrów.Następnie wbij końcówkę igły do mikroiniekcji przez grzbietową płytkę dachową tylnej części mózgu, za punktem zawiasu zero-jeden rondimere i wstrzyknij około 10 nanolitrów mieszaniny przeciwciał bez uderzania w tkankę mózgową. Zaobserwowano przepływ czerwonych płynów w komorze mózgu. Po wstrzyknięciu należy szybko usunąć końcówkę igły z zarodka, obracając pokrętło mikromanipulatora.Aby wstrzyknięcie było udane, czerwony barwnik z wstrzykniętej mieszaniny pozostaje stabilnie w komorze mózgu, nie przeciekając do otaczającej agarozy. Przesuń płytkę montażową pod mikroskopem, aby zlokalizować inny zamontowany zarodek w odpowiedniej pozycji do powtórzeń. Po wstrzyknięciu sześciu do ośmiu zarodków obierz agarozę nożem mikrochirurgicznym, aby uwolnić zarodki z osadzonej agarozy.Przenieś mikrowstrzyknięte zarodki do świeżego naczynia z 30 mililitrami pożywki dla zarodków i umieść je w temperaturze pokojowej do następnych kroków. Po 30 minutach przenieś wybrane zarodki do 10 mililitrów pożywki zarodkowej. Aby zmontować zarodki, przygotuj 0,8% agarozę o niskiej temperaturze topnienia zawierającą takie samo stężenie trykana w probówce.Za pomocą szklanej pipety zanurz wstrzyknięte zarodki w ciepłej agarozie na trzy sekundy. Następnie natychmiast usuń zarodki z agarozy za pomocą tej samej szklanej pipety i umieść zarodki na środku 35-milimetrowych szklanych naczyń hodowlanych z kroplą agarozy z probówki. Delikatnie zorientuj zarodki za pomocą sondy światłowodowej lub końcówki ładującej, aby utrzymać grzbietową stronę embrionalnego mózgu jak najbliżej szklanego dna.Delikatnie obróć pozycję zarodka, aby przedłużyć zarodek bez zwijania się, gdy agaroza stopniowo krzepnie. Następnie sprawdź pozycję zarodka, odwracając szklane dno naczynia. Upewnij się, że pod mikroskopem można zobaczyć całe grzbietowe przodomózgowie z prawidłowo zamontowanymi zarodkami.Dodaj dwa do trzech mililitrów podgrzanej pożywki embrionalnej o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza zawierającej trikan, aby przykryć zarodek. Umieść naczynie prawidłowo na stoliku mikroskopu konfokalnego o kontrolowanej temperaturze i dostosuj temperaturę komory obrazowania do 28,5 stopnia Celsjusza. Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania.Zarodki, którym wstrzyknięto Atto-647N, wykazywały fluorescencję tła w komorze mózgu. Zarodki danio pręgowanego, którym wstrzyknięto anty-Dld-Atto-647N, wykazały duże ilości zinternalizowanych cząstek fluorescencyjnych w większości komórek rozwijającego się przodomózgowia. Obrazowanie poklatkowe wykazało ruch wewnątrzkomórkowych endosomów anty-Dld-Atto-647N podczas podziału komórki.Większość mitotycznych promienistych komórek progenitorowych gleju wykazywała asymetryczną przednią lub tylną asymetryczną segregację endosomów anty-Dld-Atto-647N na dwie komórki potomne. Asymetria ustabilizowała się pod koniec anafazy, co spowodowało asymetryczne dziedziczenie endosomów sygnalizujących karb przez komórki potomne. Upewnij się, że igła została włożona do ukrytej komory marki we właściwym miejscu i sprawdź, czy po mikroiniekcji nie ma wycieku.Oprócz znakowania sygnalizacji delta notch, protokół ma zastosowanie do znakowania innych białek błonowych lub białek zewnątrzkomórkowych przy użyciu podobnych strategii, jeśli dostępne jest dobre przeciwciało przeciwko domenie zewnątrzkomórkowej.

antibody-uptake-assay-for-tracking-notchdelta-endocytosis-during

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Ten film demonstruje test wychwytu przeciwciał w celu zobrazowania sygnalizacji Notch/DeltaD u progenitorów gleju radialnego danio pręgowanego. Polega ona na zamontowaniu osadzonych w agarozie zdekorionowanych zarodków danio pręgowanego, wstrzyknięciu roztworu barwnika ukierunkowanego na ligandy DeltaD na RGP oraz obrazowaniu pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu asymetrycznego podziału komórek, potwierdzając aktywację sygnalizacji Notch/DeltaD.

Test wychwytu przeciwciał do obrazowania sygnalizacji Notch/DeltaD w radialnych progenitorach gleju danio pręgowanego

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Opisano nowatorską technikę wykrywania endogennych receptorów o niskiej liczebności obecnych w zarodkach danio pręgowanego. Nazwaliśmy go AFLIP, ponieważ polega na znakowaniu powinowactwa receptora przez jego ligand związany z immunoprecypitacją.

Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Metody immunoznakowania do analizy różnych populacji mikrotubul w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego są tutaj opisane, które mają szerokie zastosowanie do innych tkanek. Pierwszy protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę znakowania immunologicznego stabilnych i dynamicznych mikrotubul. Drugi protokół zapewnia metodę obrazowania i ilościowego oznaczania powstających mikrotubul.

Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) to oparta na biologii chemicznej metoda badania reaktywnej sygnalizacji małocząsteczkowej. Technikę tę można zastosować do żywych ryb na różnych etapach rozwoju. Tutaj łączymy standardowe testy u danio pręgowanego z Z-REX do analizy szlaku sygnałowego.

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Odkryj test wychwytu przeciwciał do śledzenia endocytozy Notch/DeltaD w radialnych progenitorach gleju danio pręgowanego. Ta metoda umożliwia badanie sygnałowania komórkowego podczas asymetrycznego podziału w rozwoju mózgu.

Test wychwytu przeciwciał do śledzenia endocytozy Notch/Delta podczas asymetrycznego podziału radialnych progenitorów gleju danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Test wychwytu przeciwciał do śledzenia endocytozy Notch/Delta podczas asymetrycznego podziału radialnych progenitorów gleju danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów