Name: Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj tomografię krio-STEM do wizualizacji organelli w komórkach in situ. Ta metoda umożliwia uzyskanie obrazów 3D z rozdzielczością nanometryczną w grubych próbkach biologicznych bez inwazyjnego przygotowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni za ciągłe wsparcie ze strony autora i opiekuna pakietu oprogramowania SerialEM, Davida Mastronade i Günthera Rescha. P.K. był finansowany przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF) poprzez stypendium Schrödinger Fellowship J4449-B. Dla celów otwartego dostępu, autorzy zastosowali publiczną licencję CC-BY na prawach autorskich do każdej wersji manuskryptu zaakceptowanej przez autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia. M.E. i S.G.W. potwierdzają finansowanie z Izraelskiej Fundacji Naukowej, grant nr 1696/18, oraz z projektu partnerskiego Unii Europejskiej Horyzont 2020, ImpaCT (grant nr 857203). M.E. dziękuje za dofinansowanie z ERBN w projekcie CryoSTEM (grant nr 101055413). M.E. jest kierownikiem Katedry Profesorskiej Sama i Ayali Zacksów oraz szefem Centrum Obrazowania Nano i Bio-Nano imagingu im. Irvinga i Cherny Moskowitzów. Laboratorium M.E. skorzystało z historycznej hojności rodziny Harolda Perlmana. Doceniamy również finansowanie ze strony Unii Europejskiej. Wyrażone poglądy i opinie są jednak wyłącznie poglądami i opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy i opinie Unii Europejskiej lub Agencji Wykonawczej Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych. Ani Unia Europejska, ani organ przyznający pomoc nie mogą być za nie pociągnięte do odpowiedzialności.

<ol><li>Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+horizons+of+cryo-tomography+to+larger+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding horizons of cryo-tomography to larger volumes.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 155-161 (2018).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Do, M., Isaacson, S. A., McDermott, G., Le Gros, M. A., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+characterizing+cells+using+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Imaging and characterizing cells using tomography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 581, 111-121 (2015).</li>
<li>Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+landscape+by+cryo+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cellular landscape by cryo soft X-ray tomography.</a> Biophysical Reviews. 11 (4), 611-619 (2019).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+nucleation+of+hemozoin+at+the+digestive+vacuole+membrane+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oriented nucleation of hemozoin at the digestive vacuole membrane in Plasmodium falciparum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11188-11193 (2012).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+heme+detoxification+in+the+malaria+parasite+by+in+situ+correlative+X-ray+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Sviben, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuole-like+compartment+concentrates+a+disordered+calcium+phase+in+a+key+coccolithophorid+alga%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A vacuole-like compartment concentrates a disordered calcium phase in a key coccolithophorid alga.</a> Nature Communications. 7, 11228(2016).</li>
<li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. , 329-367 (2016).</li>
<li>Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 249-258 (2019).</li>
<li>Bäuerlein, F. J. B., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+visual+proteomics+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards visual proteomics at high resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 433 (20), 167187(2021).</li>
<li>Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+compositional+contrast+by+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Toward compositional contrast by cryo-STEM.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (19), 3621-3631 (2021).</li>
<li>Elbaum, M., Wolf, S. G., Houben, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> MRS Bulletin. 41 (7), 542-548 (2016).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Houben, L., Weissman, H., Wolf, S. G., Rybtchinski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+ferritin+crystallization+revealed+by+cryo-STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism of ferritin crystallization revealed by cryo-STEM tomography.</a> Nature. 579 (7800), 540-543 (2020).</li>
<li>Li, Y., Huang, W., Li, Y., Chiu, W., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+cryogenic+electron+microscopy+in+materials+science+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience.</a> ACS Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).</li>
<li>Hohmann-Marriott, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nature Methods. 6 (10), 729-731 (2009).</li>
<li>Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy%3A+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Imaging+and+Electron+Physics%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy: biological applications.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 159, 357-386 (2009).</li>
<li>Wolf, S. G., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSTEM+tomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CryoSTEM tomography in biology.</a> Methods in Cell Biology. 152, 197-215 (2019).</li>
<li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+STEM+tomography+acquisition-A+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Optimization of STEM tomography acquisition-A comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li>
<li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li>
<li>Rez, P., Larsen, T., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+theoretical+basis+and+limitations+of+cryo-STEM+tomography+for+thick+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the theoretical basis and limitations of cryo-STEM tomography for thick biological specimens.</a> Journal of Structural Biology. 196 (3), 466-478 (2016).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+remote+data+collection+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63923(2022).</li>
<li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62383(2021).</li>
<li>O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, J. R., Mastronarde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+electron+tomography+of+cells+using+SerialEM+and+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Imaging%3A+Electron+Tomography+and+Related+Techniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale electron tomography of cells using SerialEM and IMOD.</a> Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AreTOMO%3A+An+integrated+software+package+for+automated+marker-free%2C+motion-corrected+cryo-electron+tomographic+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">AreTOMO: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction.</a> Journal of Structural Biology. (6), 100068(2022).</li>
<li>Seifer, S., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClusterAlign%3A+A+fiducial+tracking+and+tilt+series+alignment+tool+for+thick+sample+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Imaging%22%5BJournal%5D)">ClusterAlign: A fiducial tracking and tilt series alignment tool for thick sample tomography.</a> Biological Imaging. 2, 7(2022).</li>
<li>Waugh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+deconvolution+processing+for+STEM+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional deconvolution processing for STEM cryotomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (44), 27374-27380 (2020).</li>
<li>Kirchenbuechler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-STEM+tomography+of+intact+vitrified+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-STEM tomography of intact vitrified fibroblasts.</a> AIMS Biophysics. 2 (3), 259-273 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lazić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+structures+from+iDPC-STEM+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM structures from iDPC-STEM at near-atomic resolution.</a> Nature Methods. 19 (9), 1126-1136 (2022).</li>
<li>Seifer, S., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+STEM+with+simultaneous+phase+and+depth+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Flexible STEM with simultaneous phase and depth contrast.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-12 (2021).</li>
<li>Ophus, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+scanning+transmission+electron+microscopy+%284D-STEM%29%3A+from+scanning+nanodiffraction+to+ptychography+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional scanning transmission electron microscopy (4D-STEM): from scanning nanodiffraction to ptychography and beyond.</a> Microscopy and Microanalysis. 25 (3), 563-582 (2019).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+phase+retrieval+of+biological+specimens+using+cryo-electron+ptychography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography.</a> Nature Communications. 11 (1), 2773(2020).</li>
<li>Nellist, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principles+of+STEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">The principles of STEM imaging.</a> Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging and Analysis. , 91-115 (2011).</li>
<li>Elad, N., Bellapadrona, G., Houben, L., Sagi, I., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+isolated+protein-bound+metal+ions+by+single-particle+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of isolated protein-bound metal ions by single-particle cryo-STEM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (42), 11139-11144 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół powinien pomóc mikroskopistom zajmującym się naukami przyrodniczymi, którzy są zainteresowani uzyskaniem widoku 3D organelli wewnątrzkomórkowych w obszarach komórki, które nie są dostępne dla konwencjonalnej tomografii TEM. Ten sam protokół może być również stosowany do tomografii STEM skrawków z tworzywa sztucznego, ze złagodzonymi ograniczeniami dotyczącymi ekspozycji. Protokół powinien być traktowany jako punkt wyjścia, a nie zbiór sztywnych zasad. Rzeczywiście, siła STEM polega na jego elastyczności; Nie ma jednego właściwego sposobu jego obsługi.
Podkreślamy, że STEM sam w sobie odnosi się tylko do zeskanowanej sondy i nie definiuje powstawania obrazu. Kontrast zależy przede wszystkim od konfiguracji detektorów. Prostsze metody wykorzystują detektory z symetrią osiową, albo dyskiem wyśrodkowanym na osi optycznej, albo otaczającym go pierścieniem. Ogólnie rzecz biorąc, gdy oświetlenie pada bezpośrednio na detektor, rejestrujemy obraz BF, w którym próbka (rozpraszająca elektrony) wydaje się ciemna; I odwrotnie, gdy detektor zbiera tylko rozproszone elektrony, rejestrujemy obraz DF, na którym gęsty próbka wydaje się jasna. Gdy dostępny jest odpowiedni sprzęt, SerialEM może odbierać i nagrywać oba te sygnały jednocześnie. Dostępne są jeszcze bardziej wyrafinowane konfiguracje, od detektorów z wieloma segmentami po w pełni pikselowe kamery. Obrazowanie z kontrastem fazowym można uzyskać, na przykład, oceniając różnicę między elementami detektora poza osią32,33. Zebranie całego wzoru rozpraszania (dyfrakcji) 2D na piksel definiuje metodę znaną jako 4D STEM34, która umożliwia rekonstrukcję wielu kontrastów obrazu na podstawie tych samych oryginalnych danych. Czterowymiarowy STEM umożliwia ptychografię elektronową, która stanowi kolejny sposób na uzyskanie kontrastu fazowego35.
Skupiliśmy się na konkretnej modalności STEM, którą uważamy za najbardziej przydatną do badania organelli i nienaruszonych komórek lub skrawków komórek o grubości mikronów. Wiąże się to w szczególności z zastosowaniem obrazowania BF z małym kątem półzbieżności w oświetleniu i stosunkowo dużym kątem zbierania w detektorze. Mała zbieżność zapewnia dużą głębię ostrości, dzięki czemu cała próbka pozostaje ostra w całej serii pochylenia19. W praktyce, przy dobrym stoliku mikroskopowym, może to również wyeliminować potrzebę regulacji ostrości podczas akwizycji. Cena jest kompromisem w rozdzielczości, jak opisano w sekcji 3 protokołu. Zaproponowaliśmy obrazy 4k z sondą o długości fali ~2 nm, która przy odstępie między pikselami 1 nm osiąga pole widzenia 4 μm. Czytelnik jest jednak gorąco zachęcany do eksperymentowania. Druga kwestia dotyczy strony detektora. Gdy dysk oświetleniowy wypełnia detektor BF na osi, kontrast fazowy jest tłumiony i dominuje kontrast rozpraszania (amplitudy); Ten stan został nazwany niespójnym kontrastem jasnego pola36. Pytanie brzmi, o jaką frakcję należy niedopełnić, a odpowiedź zależy od próbki. Bardzo cienka próbka będzie wykazywać najlepszy kontrast z całkowicie wypełnionym detektorem (tj. kąt zbierania odpowiadający oświetleniu), ale grubsza próbka rozproszy całą intensywność, pozostawiając zaszumiony sygnał o słabym kontraście. Przydatną zasadą jest to, że im grubsza próbka, tym większy zewnętrzny kąt odcięcia detektora BF powinien wynosić21. Rozmiar i położenie detektora są oczywiście stałe, więc rozmiar tarczy dyfrakcyjnej jest regulowany za pomocą długości kamery, jak opisano w rozdziale 1. Jeśli ustawienia wzmacniacza detektora są takie, że sygnał wypełnia zakres dynamiki, ale nie nasyca się przy bezpośrednim oświetleniu (1.12.3), wówczas długość kamery można zwiększać, aż do osiągnięcia rozsądnego natężenia sygnału i kontrastu. Ponownie czytelnik jest zachęcany do eksperymentowania. Sztuka, że tak powiem, tkwi w kątach.
Kolejnym parametrem, nieomówionym w protokole, jest napięcie przyspieszenia mikroskopu. Oddziaływanie świecących elektronów z próbką będzie silniejsze przy niższym napięciu. Przy wszystkich innych równych sobie możemy spodziewać się wyższego kontrastu przy niższym napięciu. Z drugiej strony, to początek wielokrotnego rozpraszania w próbce ogranicza użyteczną grubość próbki, więc wyższe napięcie pozwala na użycie grubszych próbek. Efekty te są jednak dość subtelne. Nasze dotychczasowe doświadczenia z przyspieszeniami 200 kV i 300 kV są podobne.
Biorąc pod uwagę to, czego można oczekiwać od STEM pod względem rozdzielczości, to znowu zależy od próbki i konfiguracji detektora. Stosując podejście oparte na analizie pojedynczych cząstek, jony metali na ferrytynie mogą być lokalizowane przez pierścieniowe ciemne pole STEM z dokładnością do kilku angstremów37. Niedawno uzyskano rozdzielczość subnanometrową dla próbek wirusów i białek przy użyciu obrazów uzyskanych za pomocą zintegrowanego kontrastu różnicowego fazowego (iDPC) STEM32 , a także ptychografii35. W przypadku unikalnych obiektów w grubych próbkach komórkowych i przy opisanych tutaj metodach, tak wysoka rozdzielczość nie jest realistyczna. Optymalna rozdzielczość to średnica sondy, która odnosi się do opisanego kąta półzbieżności. Inne czynniki obniżą rozdzielczość, w szczególności próbkowanie grubych pikseli w celu osiągnięcia dużego pola widzenia, niewspółosiowość w serii nachylenia i rozproszenie wiązki sondy podczas transmisji. Obrazy dobrze wypadają w porównaniu z tomografią przekroju plastycznego. Na przykład przy opisanej tutaj konfiguracji powinno być łatwo dostrzec pusty rdzeń mikrotubul, ale nie poszczególne protofilamenty.
Podsumowując, zarówno metody, jak i sprzęt STEM są w fazie rozwoju. Możemy się spodziewać, że innowacje w obrazowaniu wpłyną również na tomografię, wprowadzając STEM do dziedzin, które nie były dostępne za pomocą innych technik. Spodziewamy się, że szczególnie owocna będzie konwergencja z korelacyjnym obrazowaniem fluorescencji kriogenicznej w oparciu o nowoczesne metody optyczne superrozdzielczościowe. Skala organelli, 100-1000 nm, jest idealnym celem dla tych nowych metod.

Trójwymiarowa (3D) wizualizacja organelli jest najważniejszym zadaniem w nowoczesnej biologii komórki. Biorąc pod uwagę stosowane skale, od dziesiątek nanometrów w przypadku pęcherzyków wydzielniczych do wielu mikronów w jądrze komórkowym, trudno jest znaleźć jedną technikę mikroskopii, która pasowałaby do wszystkich zastosowań. Podczas gdy współczesna mikroskopia fluorescencyjna może objąć większość zakresu pod względem rozdzielczości, pojawiają się tylko znakowane cząsteczki. Teatr komórkowy pozostaje domeną mikroskopii elektronowej. Konwencjonalne metody chemicznego utrwalania, zatapiania tworzyw sztucznych i barwienia metalami ciężkimi są silnie inwazyjne, więc wyniki mogą zależeć od szczegółów przygotowania próbki. Z drugiej strony Cryo-EM jest ograniczony przez konieczność zeszklenia środowiska wodnego; Kryształki lodu, które się tworzą, załamują oświetlenie elektronowe, powodując artefakty kontrastu o wyższym kontraście niż materiał organiczny będący przedmiotem zainteresowania.
W ciągu ostatniej dekady nastąpił wzrost ilości technik obrazowania elektromagnetycznego opracowanych lub dostosowanych do badań komórkowych1. Zamrażanie wysokociśnieniowe w połączeniu z iteracyjnym frezowaniem wiązką jonów (FIB) i seryjnym obrazowaniem powierzchni przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego (tj. FIB-SEM) jest obecnie metodą z wyboru dla dużych próbek2. Kriogeniczna miękka tomografia rentgenowska (cryo-SXT) jest odpowiednia dla próbek o wielkości kilku mikronów, ograniczonych charakterystyczną długością absorpcji miękkiego promieniowania rentgenowskiego w wodzie3,4,5. Skala ta obejmuje wiele nienaruszonych typów komórek, a ilościowy charakter kontrastu absorpcji promieniowania rentgenowskiego dodaje aspekt pomiaru stężenia6 lub spektroskopia7. W połączeniu z uśrednianiem subtomogramowym, kriotransmisyjna tomografia elektronowa (cryo-ET), oparta na mikroskopii elektronowej transmisyjnej z kontrastem fazowym (TEM), oferuje najwyższą rozdzielczość dla makrocząsteczek lub kompleksów8,9,10. Jednak rzadko zdarza się, aby nienaruszone organelle były tak regularne, że można je uśrednić w całości. Co więcej, konwencjonalny tryb szerokokątnego TEM jest ograniczony dla grubości próbki do kilkuset nanometrów przez połączenie nieelastycznego rozpraszania (obejmującego utratę energii) w próbce i aberracji chromatycznej w magnetycznej soczewce obiektywu11,12. Duże rozproszenie energii wymusza użycie filtra energetycznego w celu usunięcia powstałego nieostrego zamglenia, ale czuła próbka nadal ulega uszkodzeniom spowodowanym promieniowaniem, podczas gdy sygnał obrazu staje się wykładniczo słabszy wraz ze wzrostem grubości.
Alternatywny tryb obrazowania, skanowanie transmisji EM (STEM), omija potrzebę filtrowania energii i zachowuje nieelastycznie rozproszone elektrony do tworzenia obrazu, choć obecnie w niższej rozdzielczości niż dla tomografii TEM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W rzeczywistości nie powstaje żaden prawdziwy obraz. Zamiast tego, podobnie jak w skanowaniu EM, pomiary są wykonywane punkt po punkcie, a obraz jest montowany przez komputer. Powiększenie zależy tylko od wielkości kroków skanowania bez zmiany prądów obiektywu. Przy prawidłowym skonfigurowaniu użyteczny zakres grubości próbki do tomografii krio-STEM (CSTET) może osiągnąć 1,5 lub nawet 2 μm, chociaż strefa komfortu, w której użyteczne natężenie sygnału pozostaje znaczną częścią oświetlenia, wynosi około 600-900 nm11,13. To wystarczy, aby zobaczyć dużą część cytoplazmy, a czasami krawędź jądra komórkowego. W praktyce okazuje się, że witryfikacja standardową metodą zanurzania w płynie kriogenicznym nakłada poważniejsze ograniczenie grubości niż obrazowanie STEM. Celem tego artykułu wideo jest ułatwienie włączenia CSTET do skrzynki narzędziowej do obrazowania komórek i organelli w laboratoriach badawczych i placówkach mikroskopowych.
Pierwszym wyzwaniem jest to, że operacje mikroskopowe w CSTET nie są jeszcze ustandaryzowane dla zastosowań w naukach przyrodniczych w taki sposób, jak były dla tomografii krio-TEM. Sprzęt STEM rzadko (jeśli w ogóle) był kierowany na rynek krio-EM. Jednak wraz z najnowszą generacją mikroskopów zmienia się to i wiele istniejących narzędzi można doposażyć. STEM jako technika wystartowała i w dużej mierze przejęła kontrolę nad materiałoznawstwem, gdzie rośnie również zainteresowanie metodami kriogenicznymi i niskodawkowymi14,15. Literatura materiałoznawcza obfituje w akronimy BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM itp., które przyczyniają się do zamieszania. Proponujemy tutaj zalecany punkt wyjścia, który, zgodnie z naszym zbiorowym doświadczeniem w Instytucie Naukowym Weizmanna, zapewnia najbardziej ogólny protokół dla użytecznych wyników opartych na obrazowaniu STEM w jasnym polu (BF)16. W żaden sposób nie wyczerpuje ani nawet nie eksploruje wachlarza możliwości, ale posłuży jako podstawa do dalszych ulepszeń. Chociaż kładziemy nacisk na cryo-STEM, większość protokołu jest równie istotna dla tomografii STEM w temperaturze pokojowej sekcji osadzonych w tworzywie sztucznym.
Istotą STEM jest skanowanie próbki za pomocą skupionej sondy elektronowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), stożka iluminacyjnego, oraz rejestrowanie sygnałów z płaszczyzny dyfrakcyjnej (rozpraszającej) podczas transmisji, piksel po pikselu, w celu wytworzenia obrazów 2D17,18. Próbki amorficzne, w tym większość materiałów komórkowych, będą wytwarzać rozproszony wzór rozpraszania podczas transmisji. Najprostszą praktyczną konfiguracją STEM jest umieszczenie okrągłego detektora do rejestrowania centralnego dysku (tj. oświetlenia sondy, które byłoby transmitowane bez próbki). Próbka rozprasza elektrony z dala od tego stożka oświetleniowego do tego stopnia, że sygnał maleje. W ten sposób powstaje obraz BF - próbka wydaje się ciemna na jasnym tle. Detektor pierścieniowy może być również (lub zamiast) używany do wykrywania rozpraszania od próbki poza stożkiem oświetleniowym. Po usunięciu próbki nie ma sygnału. Gdy próbka jest na miejscu, obiekty wydają się jasne na ciemnym tle na obrazie w ciemnym polu (DF). Nomenklatura STEM (BF, pierścieniowe ciemne pole [ADF], pierścieniowe ciemne pole o wysokim kącie [HAADF] itp.) odnosi się głównie do zakresów kątów zbierania dla detektorów.
Kąt zbieżności oświetlenia stanowi istotną adaptację STEM do tomografii komórkowej. Gdy najwyższym priorytetem jest wysoka rozdzielczość, kąt zbieżności powinien być jak największy. (Jest to podobne do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej; rozdzielczość zależy od średnicy sondy, która skaluje się jako długość fali podzielona przez aperturę numeryczną. Zauważ, że dla EM, odnosimy się do kąta połówkowego lub półzbieżności). Z drugiej strony, gdy priorytetem jest głębia ostrości, kompromis w rozdzielczości daje ogromną przewagę, ponieważ skupiona wiązka pozostaje mniej więcej równoległa na odległość równą dwukrotności długości fali podzielonej przez półkąt do kwadratu. Idealnie byłoby, gdyby cała wolumin komórki pozostał w fokusie19. Na przykład przy 300 keV długość fali elektronu deBroglie'a wynosi 0,002 nm, więc zbieżność 1 mrad daje rozdzielczość 2 nm i głębię ostrości 4 mikrony. W tych warunkach tomografia może być wykonywana nawet bez ustawiania ostrości podczas procesu zbierania danych, ale tylko raz na początku akwizycji. Konwencjonalny STEM zdolny do tomografii może osiągnąć kąt półzbieżności 7 lub 8 mrad; W związku z tym w zasadzie moglibyśmy osiągnąć rozdzielczość rzędu 0,25 nm, ale wtedy o głębokości ogniskowej wynoszącej zaledwie 62 nm. Jest ona zdecydowanie zbyt cienka do obrazowania komórkowego. Bardziej zaawansowane mikroskopy z trzema soczewkami kondensatorowymi oferują ciągłą regulację kąta półzbieżności w znacznym zakresie. W bardziej tradycyjnej konfiguracji z dwoma kondensatorami zbieżność jest ustalana dyskretnie przez otwór kondensatora (C2).
Dla solidnych, osadzonych w plastiku próbek, można zarejestrować serię ogniskowych przy każdym nachyleniu i połączyć je w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości20, ale dla próbek kriogenicznych budżet promieniowania jest zbyt mocno ograniczony. Wreszcie, rozważając zalety obrazowania BF lub DF, w przypadku grubych próbek, należy wziąć pod uwagę skutki wielokrotnego elastycznego rozpraszania w próbce. Sygnał BF jest mniej zniekształcony przez wielokrotne rozpraszanie i wykazuje wyższą rozdzielczość dla grubych próbek16,21.
Przydatną zasadą było ustawienie kątów zbierania kilkakrotnie większych niż zbieżność. Im grubsza próbka, tym większy powinien być krążek zbiorczy. Zbyt mały dysk zapewni niską intensywność sygnału; Zbyt duży dysk spowoduje słaby kontrast obrazu, ponieważ przyczyni się do tego tylko rozpraszanie pod najwyższym kątem. Kąty pobierania powinny być zoptymalizowane dla danej próbki. Kąty detektora w funkcji długości kamery (dyfrakcyjnej) muszą być kalibrowane niezależnie. Mogą być one wygodnie wyświetlane przez oprogramowanie mikroskopu. W praktyce współczynnik od dwóch do pięciu w stosunku półkątów zbierania do oświetlenia, odpowiednio θ do α (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1), jest zalecanym punktem wyjścia dla CSTET próbek komórkowych.
Poniższy protokół opisuje działanie tomografii STEM przy użyciu popularnego oprogramowania SerialEM do sterowania mikroskopem22,23. SerialEM nie jest powiązany z konkretnym producentem i jest szeroko stosowany w tomografii TEM. Większość czynności związanych z przygotowaniem do tomografii można przenieść bezpośrednio z TEM. Strategia SerialEM polega na modelowaniu systemu skanowania jako kamery. Umożliwia to proste przejście z TEM na STEM. Należy jednak pamiętać, że parametry takie jak powiększenie i binning są całkowicie sztuczne. Ważnymi parametrami są pole widzenia w mikronach, liczba pikseli w polu widzenia oraz czas naświetlania. Odstępy między pikselami lub próbkowanie to pole liniowe podzielone przez liczbę pikseli, podczas gdy czas przebywania to liczba pikseli podzielona przez czas ekspozycji.
Minimalna konfiguracja dla STEM i CSTET obejmuje trzy funkcje mikroskopu: generator skanów, detektor STEM i oprogramowanie sterujące tomografią. Protokół odnosi się do nomenklatury FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), ale pojęcia są ogólne. Własnościowe oprogramowanie TFS zostało opisane w JoVE dla TEM24, a operacja STEM jest bardzo podobna.
Zakładamy, że mikroskop został wcześniej ustawiony przez zespół serwisowy lub doświadczony personel i że wyrównanie kolumny można wywołać poprzez wczytanie pliku. Drobne korekty nazywane są wyrównaniem bezpośrednim i mogą być przechowywane w tak zwanych rejestrach FEG (mikroskopy TFS). Wyrównania bezpośrednie obejmują środek obrotu, punkty obrotu, wyrównanie dyfrakcji i kompensację astygmatyzmu kondensatora. Korekty muszą być wykonywane iteracyjnie. Należy pamiętać, że mikroskopy TFS implementują odrębne tryby nanosondy (nP) i mikrosondy (μP); dla danej apertury kondensatora zapewniają one stosunkowo wąskie lub szerokie pole widzenia z równoległym oświetleniem w TEM i mniej lub bardziej zbieżną (ściśle zogniskowaną) wiązką elektronów w STEM, odpowiednio. Inni producenci stosują różne schematy, aby objąć zakres kątów zbieżności.
Przed rozpoczęciem należy wybrać pole widzenia, L, oraz próbkowanie (szerokość pikseli), l, w zależności od badanej próbki. Na przykład dla l = 1 nm/piksel należy wybrać obraz o wymiarach 4 000 x 4 000 pikseli, który pokryje pole widzenia 4 μm2. Rozdzielczość będzie w najlepszym razie dwukrotnie większa niż próbkowanie przestrzenne, więc 2 nm i średnica sondy, d, powinny się do tego pasować. Kalibracja kąta sondy wykracza poza zakres tego protokołu, więc zakładamy, że dostępna jest tabela lub odczyt ekranu. Średnica sondy to w przybliżeniu długość fali elektronu podzielona przez kąt półzbieżności (w radianach): d = λ/θ. Długość fali λ wynosi 0,002 nm dla elektronów 300 keV i 0,0025 nm dla elektronów 200 keV, więc θ 1 mrad zapewni średnicę plamki odpowiednio 2 lub 2,5 nm.
Protokół jest przedstawiany w postępie o rosnącej złożoności. Pierwszym zadaniem jest wytworzenie obrazu STEM, który zależy od oprogramowania producenta mikroskopu, a następnie serii pochylenia, do której wykorzystujemy SerialEM. Wielu czytelników z pewnością zna SerialEM, więc bardziej skomplikowane zadania przyjdą naturalnie. Nie ma potrzeby ścisłego przestrzegania procedur. Osiągnięcia związane z automatyzacją mogą być wdrażane bezpośrednio w odniesieniu do STEM, jak również w odniesieniu do TEM. Doświadczeni użytkownicy prawdopodobnie odwrócą protokół, zaczynając od korelacyjnej rejestracji map fluorescencyjnych i kontynuując konfigurację tomografii wsadowej. Więcej szczegółów można znaleźć w obszernej dokumentacji i bibliotekach samouczków dla samego SerialEM, w tym w niedawnym artykule JoVE na temat najnowszych osiągnięć w automation25.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; SerialEM</td><td>University of Colorado</td><td>Veriosn 4.0</td><td>SerialEM to bezpłatna platforma oprogramowania do sterowania mikroskopem i akwizycji danych.&nbsp;</td></tr><tr>Transmisyjny mikroskop <td></td><td></td><td>elektronowy z funkcją STEM</td><td>Protokół został napisany na podstawie doświadczeń z kilkoma mikroskopami Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica i Tecnai T20-F. W zasadzie powinno to mieć zastosowanie również do innych producentów.</td></tr></tbody></table>

wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-stem

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) opiera się na obrazowaniu próbek biologicznych lub organicznych zanurzonych w ich naturalnym środowisku wodnym; woda jest zestalana w szklance (tj. zeszklona) bez krystalizacji. Metoda cryo-EM jest ostatnio szeroko stosowana do określania struktury makrocząsteczek biologicznych w rozdzielczości bliskiej atomowi. Podejście to zostało rozszerzone na badanie organelli i komórek za pomocą tomografii, ale konwencjonalny tryb obrazowania EM w transmisyjnym polu widzenia ma poważne ograniczenie grubości próbki. Doprowadziło to do praktyki frezowania cienkich lameli za pomocą skupionej wiązki jonów; Wysoką rozdzielczość uzyskuje się poprzez uśrednianie subtomogramu z rekonstrukcji, ale trójwymiarowe relacje poza pozostałą warstwą są tracone. Ograniczenie grubości można obejść poprzez obrazowanie za pomocą skanowanej sondy, podobnie jak w przypadku skaningowego EM lub konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Podczas gdy skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (STEM) w materiałoznawstwie zapewnia rozdzielczość atomową pojedynczych obrazów, wrażliwość kriogenicznych próbek biologicznych na promieniowanie elektronowe wymaga szczególnych rozważań. Protokół ten przedstawia konfigurację do kriotomografii z wykorzystaniem STEM. Podstawowa konfiguracja miejscowa mikroskopu jest opisana zarówno dla systemów dwu-, jak i trzykondensatorowych, podczas gdy automatyzację zapewnia niekomercyjne oprogramowanie SerialEM. Opisano również ulepszenia w zakresie akwizycji wsadowej i wyrównania korelacyjnego z poprzednio uzyskanymi mapami fluorescencji. Jako przykład pokazujemy rekonstrukcję mitochondrium, wskazując błonę wewnętrzną i zewnętrzną oraz granulki fosforanu wapnia, a także otaczające mikrotubule, włókna aktynowe i rybosomy. Tomografia krio-STEM doskonale sprawdza się w odkrywaniu teatru organelli w cytoplazmie, a w niektórych przypadkach nawet na obrzeżach jądra przylegających komórek w hodowli.

Pełny montaż siatki przygotowany w STEM przedstawia obszary z komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania (Rysunek 4). Należy zauważyć, że obraz jest w polu ciemnym, zatem puste otwory wydają się ciemne. Komórki są częściowo jasne w miejscach, gdzie elektrony ulegają rozproszeniu w kierunku detektora HAADF. W najgrubszych częściach, zazwyczaj w centrach lub w pobliżu prętów siatki, kontrast ponownie staje się ciemny. Jest to spowodowane wielokrotnym rozproszeniem, w wyniku którego elektrony osiągają kąty nie rejestrowane przez detektor. W praktyce obszary te będą zbyt grube do przeprowadzenia tomografii.
Kolejny etap obejmuje mapy o pośrednim powiększeniu (Rysunek 10). Są one często nazywane mapami montażowymi o średniej skali lub mapami kwadratowymi, co odnosi się do kwadratów siatki, a nie do kształtu. Nawet w trybie STEM mikroanalizatora o najniższej rozdzielczości będą one pozyskiwane jako obrazy montażowe. Kliknięcie elementu w oknie Nawigatora ładuje obraz mapy do głównego okna. W tym obszarze wybierane są konkretne punkty do pozyskania tomogramu. Należy użyć trybu Preview, aby zlokalizować obszar przy powiększeniu rejestracyjnym. Należy pamiętać, że w zależności od prędkości skanowania może wystąpić przesunięcie boczne między trybami Preview a Record. W tym miejscu można zarejestrować pojedynczą serię pochyleń. Na przykład mitochondria można często zidentyfikować na obrazach w trybach Preview i Record (Rysunek 12).
W przypadku tomografii seryjnej stolik przesuwa się wokół siatki i może nie powrócić dokładnie w to samo miejsce. Mapy kotwiczące są wykorzystywane w celu zapewnienia niezawodnej ponownej identyfikacji pożądanych obszarów rejestracji (Record) poprzez dopasowanie obrazu podglądu (Preview) do obrazu w mniejszym powiększeniu (View), nawet jeśli wystąpiło przesunięcie stolika. PyEM23,24 oferuje szybszą alternatywę, która jest zdecydowanie zalecana, lecz nie stanowi jeszcze części standardowej instalacji.
W podejściu CLEM mapa fluorescencyjna może być wykorzystana do zidentyfikowania obszarów zainteresowania dla tomografii. Obraz fluorescencyjny jest pozyskiwany zewnętrznie i musi zostać zarejestrowany na pełnym montażu siatki. Przydatne jest, aby paski i otwory siatki były widoczne, dlatego przed importem można przygotować kompozyt łączący fluorescencję i pole jasne, na przykład w programie GIMP (https://www.gimp.org) lub ImageJ31 (należy pamiętać, że ImageJ odwraca oś pionową). Gdy zakres dynamiczny fluorescencji jest duży, stworzenie takiego połączenia bez nasycenia może być trudne. W takim przypadku obie mapy można zaimportować osobno, a następnie zarejestrować je razem, jak opisano (Rysunek 13). W ten sposób wskazanie punktu na mapie fluorescencyjnej w oknie Navigator, a następnie wybranie funkcji „Go To XY”, przesuwa stolik do odpowiadającej pozycji na siatce zamontowanej w TEM. Należy pamiętać, że niewielkie niespójności podczas tworzenia montażu (lub mapy fluorescencyjnej, jeśli ona również jest montażem) doprowadzą do niewielkich przesunięć; dlatego dla uzyskania optymalnej precyzji fluorescencję należy ponownie zarejestrować konkretnie względem mapy kwadratowej. Często wystarczy przeprowadzić tę rejestrację „na oko”, na podstawie otworów w folii nośnej lub cech wspólnych z obrazem w polu jasnym.
Rekonstrukcja serii pochyleń pozwala na uzyskanie wolumenu 3D (Rysunek 14). W tym przykładzie rozmiar piksela wynosi 2,042 nm, co przekłada się na pole widzenia o wielkości ~4 µm. Osady fosforanu wapnia (pomarańczowe groty strzałek) są wyraźnie widoczne ze względu na wyższą liczbę atomową w porównaniu do otoczenia. Mikrotubule (czerwone groty strzałek) można śledzić w całym polu widzenia. Ponadto wyraźnie widoczne są wewnętrzna i zewnętrzna błona mitochondrialna (zielone groty strzałek). Aktynę można zaobserwować w postaci wiązek lub pojedynczych filamentów. Aby uzyskać bardziej izotropową rozdzielczość, zrekonstruowany obraz można poddać dekonwolucji.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Porównanie TEM i STEM. W TEM pole widzenia jest oświetlone niemal równoległą wiązką, a soczewka obiektywu tworzy powiększony obraz na kamerze. W przypadku cryo-TEM przysłona obiektywu jest otwarta, aby przepuścić rozproszone fale elektronowe (czerwona przerywana linia), które w połączeniu z defokusem wytwarzają kontrast fazowy poprzez interferencję z falami nierozproszonymi (zielonymi). STEM natomiast skanuje skupioną wiązkę po próbce i zbiera rozproszone elektrony piksel po pikselu. Kilka detektorów może zbierać elektrony rozproszone pod różnymi kątami. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig02.jpg" /> 
Rycina 2:&#160;Przykład zniekształcenia obrazu po lewej stronie wynikający z wysokiej prędkości skanowania. Zwróć uwagę na zniekształcenia zaznaczone żółtymi grotami strzałek, a także na zniekształcone otwory w kształcie owali w Quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig03.jpg" /> 
Rycina 3: Okno dialogowe ustawień montażu dla całego montażu siatki. Wybierz powiększenie oraz liczbę pól w osiach X i Y tak, aby całkowity obszar wyniósł około 2,000 µm, co pozwoli uzyskać mapę większości siatki. Wybierz również opcję Move stage zamiast shifting image oraz Use Montage Mapping zamiast Record parameters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig04.jpg" /> 
Rycina 4: Pełna mapa siatki (GridMap) zarejestrowana przy niskim powiększeniu w trybie STEM. Uszkodzone obszary są całkowicie czarne na obrazie w ciemnym polu. Ciemnoszare obszary są prawdopodobnie zbyt grube i słabo witryfikowane. Obszary stanowiące dobrych kandydatów do tomografii są białe lub jasnoszare w tym skanie. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Proces przesunięcia do znacznika. Rozpoznawalny obiekt zostaje zaznaczony na mapie o niskiej rozdzielczości za pomocą funkcji Add Points (38 na tym obrazie). Zauważ przesunięcie między mapą o niskiej rozdzielczości (zielone koło) a mapą o średniej rozdzielczości (pomarańczowe koło). Następnie obiekt zostaje zaznaczony znacznikiem (zielony krzyżyk, czerwone koło) i uruchamiane jest okno dialogowe Shift to Marker. Wybrana opcja przesuwa wszystkie mapy w powiększeniu 245x o tę samą wartość. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Okno dialogowe konfiguracji serii pochyleń dla serii pochyleń STEM. Zastosowano schemat symetryczny w zakresie od -60° do +60° w krokach co 2°. Pominięto autofokus ze względu na dużą głębię ostrości przy zastosowaniu niskiego kąta zbieżności. Nie ma potrzeby korygowania eukentryczności, ponieważ zostało to wykonane wcześniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig07.jpg" /> 
Rycina 7: Okno dialogowe właściwości pliku dla map o średniej rozdzielczości. Zapisz jako plik stosu MRC, wybierz liczby całkowite i zapisz dodatkowe informacje w pliku metadanych .mdoc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig08.jpg" /> 
Rycina 8: Okno dialogowe konfiguracji montażu w celu zapisania map o średniej rozdzielczości. W przypadku kwadratu na siatce o gęstości 200 oczek, którego szerokość wynosi 90 µm, zaleca się obszar całkowity co najmniej 90 µm x 90 µm. Należy wybrać opcję Move stage zamiast przesuwania obrazu (shifting image) oraz Use View parameters w trybie Low Dose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig09.jpg" /> 
Rysunek 9:&#160;Rejestracja mapy o średniej rozdzielczości. Przejdź do okna dialogowego Items w celu rejestracji map o średniej rozdzielczości. Wybierz Mapping, Acquire i zapisz obraz lub montaż, a następnie zaznacz Make Navigator map. W sekcji Tasks przed lub po Primary wybierz Rough and Fine Eucentricity. W przypadku pracy bez asysty opcjonalnie wybierz No message box when error occurs oraz Close column valves at end. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig10.jpg" /> 
Rycina 10:&#160;Obraz mapy o średniej rozdzielczości. Mapa o średniej rozdzielczości (Square Map) zarejestrowana w trybie STEM za pomocą montażu 3 x 3. Dwie mapy kotwiczące (Anchor Maps) o średniej rozdzielczości służące do zbierania danych są zaznaczone niebieskimi kwadratami. Pasek skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig11.jpg" /> 
Rycina 11:&#160;Dane serii przechyłów seryjnych. Okno Acquire w dialogu Items służące do zbierania seryjnych serii przechyłów. Aby przeprowadzić zbiór danych serii przechyłów, należy wybrać Final Data oraz Acquire tilt series. W sekcji Tasks przed lub po Primary należy zaznaczyć Manage Dewars/Vacuum (wybrać odpowiednie ustawienia w menu Setup), Realign to Item, Fine Eucentricity oraz Run Script przed Action. W opcjach General należy zaznaczyć No message box when error occurs oraz Close column valves at end (patrz 5.14). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig12.jpg" /> 
Rycina 12: Przechył 0° w serii przechyłów STEM mitochondrium. Pomarańczowe groty strzałek wskazują osady fosforanu wapnia (granul macierzy), zielone groty strzałek grzebienie, a czerwone groty strzałek złote markery fiducjalne 15 nm. Pasek skali = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig12large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig13.jpg" /> 
Rycina 13: Zarejestrowane mapy cryo-CLEM. (A) Mapa STEM o średniej rozdzielczości (mapa kwadratowa, 26-A) zarejestrowana z (B) mapą STEM o niskiej rozdzielczości, (C) mapą cryo-FM w kanale BF oraz (D) mapą cryo-FM w kanale GFP. Dziewięć punktów rejestracji (etykiety 4-21) pokazano w (E) Nawigatorze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig13large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rycina 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig14.jpg" /> 
Rycina 14: Rendering objętościowy. Rendering objętościowy przekrojów o grubości (A) 60 nm oraz (B) 40 nm przez tomogram filtrowany metodą SIRT-like (30 cykli) na różnych głębokościach. Rozmiar piksela wynosi 2,048 nm, co daje pole widzenia o wielkości około 4 µm. Należy zwrócić uwagę na odwróconą gęstość w porównaniu do Ryciny 12, co oznacza, że elementy o wysokiej intensywności są jasne. Pomarańczowe, białe, czerwone, zielone i jasnoniebieskie groty strzałek wskazują odpowiednio na złogi fosforanu wapnia, rybosomy, mikrotubule, wewnętrzną i zewnętrzną błonę mitochondrialną oraz filamenty aktynowe. Pasek skali = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig14large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is ...

Tomografia TEM jest szeroko stosowana do obrazowania komórek, ale jest bardzo ograniczona pod względem grubości próbki. FIB SEM i miękka tomografia rentgenowska mogą być stosowane w przypadku większych próbek, choć w niższej rozdzielczości. Tomografia STEM doskonale wypełnia tę lukę.Tomografia STEM umożliwia przyjrzenie się próbkom o grubości mikronów w rozdzielczości kilku nanometrów. Połączenie z preparatyką kriogeniczną pozwala nam spojrzeć na próbki i przekroje biologiczne w 3D. Zapoznaj się z podstawami optyki STEM, aby zrozumieć powstawanie obrazu i upewnić się, że inżynier serwisu dobrze ustawił tryby trzpienia i trzpienia Lomax oraz że kroki kalibracji wyglądają tak, jak na filmie.Aby rozpocząć, załaduj plik wyrównania kolumn i otwórz wartości kolumn. Jeśli używasz uchwytu kriogenicznego z bocznym wejściem, otwórz osłonę kriogeniczną i uruchom w trybie TEM. Wiązka powinna pojawić się na ekranie.Zmniejsz powiększenie, jeśli wiązka nie jest widoczna. Ustaw mikroskop w trybie eucentrycznym, naciskając przycisk na panelu sterowania. Ustaw rozmiar plamki na wygodną wartość, aby wizualizować ekran fluorescencyjny bezpośrednio lub za pomocą wbudowanej kamery.Ustaw mikroskop w trybie STEM i sprawdź, czy ostrość wykorzystuje soczewki kondensatora, a nie obiektyw. Na panelu ustaw ostrość eucentryczną i wyjdź z trybu dyfrakcji, aby dokonać wstępnych regulacji. Upewnij się, że wiązka nie jest pusta i zmniejszaj powiększenie, aż wiązka pojawi się na ekranie.Dostosuj przesunięcie wiązki do środka i zwiększaj powiększenie w krokach do 70 000, utrzymując wiązkę w środku. Następnie włóż żądaną aperturę kondensatora, zwykle 50 mikrometrów w trybie mikrosondy, i sprawdź wyśrodkowanie apertury. Obracając pokrętłem ostrości w przód iw tył, plamka powinna się rozszerzać i kurczyć, ale pozostać na miejscu, jakby samolot przecinał wyimaginowaną pionową klepsydrę.Jeśli przysłona nie jest wyśrodkowana, oświetlenie przesunie się na boki, tak jakby klepsydra była przechylona. Ustaw ostrość wiązki, naciśnij przycisk ostrości na liście intensywności na karcie wyrównania lub wróć do ostrości eucentrycznej. Ponownie dostosuj położenie belki do środka i wyreguluj środek obrotu.Teraz przekręć pokrętło kroku ostrości na minimum lub o jeden stopień powyżej, aby wiązka delikatnie pulsowała i upewnij się, że pozostaje nieruchoma, gdy ostrość porusza się w górę iw dół. Wybierz punkty obrotu i połącz je ze sobą za pomocą regulacji X i Y. Wyreguluj stygmatory kondensatora, aby wiązka była okrągła.Przechodź w górę i w dół przez ostrość, aby zoptymalizować. Nie powinno być tendencji do wydłużania się w jednym lub drugim kierunku podczas przechodzenia przez ognisko. Znormalizuj soczewki, a następnie stopniowo zwiększaj powiększenie do około 240 000, używając przesunięcia wiązki, aby utrzymać punkt wyśrodkowany i powtórz regulację środka obrotu i punktu obrotu.Wróć do trybu dyfrakcji. Na tym etapie wiązka powinna pojawić się jako jednolity dysk na ekranie fluorescencyjnym. Długość kamery skutecznie kontroluje teraz odległość optyczną do detektora jako krystalografia rentgenowska.Zmień go i obserwuj, jak dysk kurczy się i powiększa, tak jakby położenie ekranu przesuwało się w kierunku lub od próbki. Stożek ten reprezentuje oświetlenie jasnego pola. Aby włączyć tryb STEM przy dużym powiększeniu, zacznij od detektora trzpienia jasnego pola i dostosuj wyrównanie dyfrakcyjne, aby wyśrodkować wiązkę przy użyciu żądanej długości kamery.Włącz oznaczenie jasnego pola na ekranie, zmniejsz długość kamery do 330, podnieś ekran i włóż czujniki. Rozpocznij skanowanie w oprogramowaniu mikroskopu. Użyj wyświetlacza lunety, aby pomóc w dostosowaniu ustawień jasności i kontrastu zgodnie z opisem w rękopisie.Powtórz korektę kilka razy. Przywróć mikroskop do stosunkowo niskiego powiększenia w rejestrze dużego powiększenia, bez wchodzenia w tryb małego powiększenia. Włóż ekran fluorescencyjny i zanotuj prąd ekranu w celach informacyjnych.Podobnie jak w TEM, prąd może być zmieniany za pomocą soczewki pistoletu i ustawień rozmiaru plamki przy rosnących liczbach odpowiadających zmniejszonemu prądowi. W tym momencie zapisz rejestr FEG, aby ułatwić powrót do wartości standardowych. Przejdź do trybu LMTEM, aby zobaczyć próbkę.Włóż próbkę. Doprowadzić próbkę do wysokości eucentrycznej. Można to zrobić na kilka sposobów.Na przykład użyj woblera stolikowego, aby przechylić siatkę, jednocześnie przesuwając wysokość próbki wzdłuż osi Z, aż obraz przestanie przesuwać się na boki. Możesz też zaznaczyć niektóre funkcje na ekranie podglądu i przechylić stół montażowy o 10–30 stopni. Funkcja będzie się poruszać na boki.Dostosuj wysokość próbki, aby przywrócić ją do pierwotnej pozycji. Zwiększ powiększenie lub pochylenie stolika, aby udoskonalić i przywrócić nachylenie do zera stopni. Teraz wróć do trybu STEM i włóż detektor STEM.Upewnij się, że opcja Włącz skanowanie LM nie jest zaznaczona. Przejdź do najniższego trybu dużego powiększenia. Dostrój astygmatyzm kondensatora za pomocą tej metody.Gdy wiązka znajduje się nad cienkim obszarem próbki, skup się na punkcie, w którym transmitowana wiązka wybucha między cieniami próbki po obu stronach. Następnie wyreguluj strojenie kondensatora, aby centralna tarcza była okrągła. Wymaga to pewnej wprawy, zwłaszcza w przypadku próbek kriogenicznych.Wróć do otworu 50 mikrometrów i zaktualizuj rejestr FEG. Przejdź do trybu LMSTEM i kontynuuj skanowanie, aby znaleźć interesujący obszar. W razie potrzeby mniej więcej w tym momencie dostosuj ustawienia jasności i kontrastu czujnika.Naciśnij eucentryczną ostrość, zwiększ powiększenie i dopracuj ostrość podczas skanowania za pomocą pętli ostrości dostarczonej przez mikroskop i sprawdź astygmatyzm na złotych koralikach. Do tej pory wszystko odbywa się w trybie nanosondy. Zauważ, że wstawienie mniejszej apertury kondensatora zmniejsza kąt półzbieżności, co jest pomocne w przypadku grubych próbek.Alternatywnym podejściem z instrumentami TFS jest przełączenie w tryb mikrosondy, co prowadzi do zmniejszenia kąta półzbieżności. Następnie dostosuj długość kamery tak, aby kąt zbierania był trzykrotnie większy niż kąt zbieżności, tj. oznaczenia obszaru detektora BF na ekranie były około trzy razy większe niż wiązka.Oszacuj dawkę do zapisu za pomocą równania. Z reguły należy dążyć do uzyskania od 100 do 150 elektronów na kałamarz kwadratowy dla całego tomografu. Przywróć stolik do całości i dostosuj prąd wiązki za pomocą rozmiaru plamki i/lub ustawień soczewki pistoletu, aby osiągnąć żądany prąd ekranu.Pełna mapa siatki w małym powiększeniu nagrana w trybie STEM pokazuje obszary z interesującymi komórkami. Komórki wydają się częściowo jasne z elektronami rozproszonymi w kierunku detektora HAADF. Mapa o średniej rozdzielczości nagrana w trybie STEM wyświetlała dwie mapy kotwic o średniej rozdzielczości.Nachylenie serii nachylenia łodygi o zero stopni pozwoliło na wizualizację złóż fosforanu wapnia, grzebienia i złotych markerów referencyjnych mitochondrium. Pokazane jest renderowanie objętościowe odcinków o grubości 60 nanometrów i 40 nanometrów. Kriotomografia macierzysta (CSTET) stanowi pomost między biologią strukturalną a biologią komórki, a także kontekst dla fluorescencji w super rozdzielczości.Bez konieczności przeprowadzania sekcji czy preparowania lameli możemy zobaczyć cały teatr komórkowy w stanie zbliżonym do rodzimego.

visualization-of-organelles-in-situ-by-cryo-stem-tomography

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Tomografia krioelektronowa (cryo-ET) umożliwia wizualizację 3D ultrastruktury komórkowej w rozdzielczości nanometrów, ale ręczna segmentacja pozostaje czasochłonna i skomplikowana. Przedstawiamy nowatorski przepływ pracy, który integruje zaawansowane oprogramowanie rzeczywistości wirtualnej do segmentacji tomogramów krio-ET, pokazując jego skuteczność poprzez segmentację mitochondriów w komórkach ssaków.

Wykorzystanie rzeczywistości wirtualnej do immersyjnej segmentacji i analizy danych z tomografii krioelektronowej

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Poznaj tomografię krio-STEM do wizualizacji organelli w komórkach in situ. Ta metoda umożliwia uzyskanie obrazów 3D z rozdzielczością nanometryczną w grubych próbkach biologicznych bez inwazyjnego przygotowania.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Przeglądaj więcej filmów