Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Lokalizacja białek w kontekście ultrastruktury komórki jest od dziesięcioleci potężnym narzędziem badawczym. Dzięki temu protokołowi rozszerzyliśmy białka, które są mało obfite lub trudne do zlokalizowania. Używamy mikroskopii fluorescencyjnej do znakowania białek w czuły i możliwy do przesiewania sposób, a następnie łączymy ją z mikroskopią elektronową, aby uzupełnić ultrastrukturę komórki.

Tutaj zademonstrujemy CLEM w sekcji białek autofagii, ale tak naprawdę można go zastosować do każdego pytania biologicznego, w którym interesuje się ultrastruktura komórki, zwłaszcza w badaniu rzadkich zdarzeń. Procedurę zademonstruje mi Tineke Veenendaal, starszy technik badawczy z naszego laboratorium. Na początek zastąp PBS zawierający 0,15% glicyny 1% żelatyną w PBS podgrzanym do 37 stopni Celsjusza.

Zeskrobać i przenieść komórki w żelatynie do probówki mikrowirówkowej. Granulować komórki w temperaturze 6 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej w mikrowirówce, a następnie usunąć żelatynę bez naruszania osadu. Do granulki dodać 12% żelatyny podgrzanej do 37 stopni Celsjusza i delikatnie zawiesić, pipetując końcówkami do pipet lub szklanymi pipetami pastwiskowymi podgrzanymi do tej samej temperatury.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie granulować komórki w temperaturze 6 000 G przez jedną minutę. Zestal żelatynę na lodzie przez 30 minut. Aby usunąć komórki zatopione w żelatynie z probówki, odetnij koniec rurki zawierającej osad od reszty probówki za pomocą żyletki.

Następnie przeciąć koniec rurki z granulką komórkową na pół prostopadle do pierwszego cięcia. Umieścić dwie połówki rurki zawierające osad komórkowy w 2,3-molowej sacharozie i inkubować przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powoduje to, że połówki granulek komórkowych nieznacznie się kurczą i wypierają z plastikowej rurki.

Usuń połówki probówki z osadem komórkowym zatopionym w żelatynie z sacharozy, a następnie usuń połówki osadu komórkowego z połówek plastikowej rurki za pomocą pęsety. Ręcznie pokrój granulkę na bloki o odpowiedniej wielkości za pomocą żyletki i użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, aby powiększyć obiekt podczas cięcia. Inkubuj bloki komórkowe przez noc w 2,3-molowej sacharozie w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umieść je na aluminiowym trzpieniu uchwytu na próbkę. Pozostaw wystarczającą ilość sacharozy wokół krawędzi bloku, aby utworzyła cienki kołnierz między blokiem a szpilką. Zatrzaskowo zamroź i przechowuj w ciekłym azocie.

Przytnij przód bloku, aby spłaszczyć jego powierzchnię, aby uzyskać odcinki o grubości około 250 nanometrów. Następnie przyciąć boki bloku, dzieląc od 50 do 100 mikrometrów w bok bloku próbki za pomocą rogu noża. Przycięcie czterech boków powierzchni bloku próbki utworzy wystający prostokąt o wymiarach około 250 na 375 mikrometrów.

Odetnij wstęgę od wystającego prostokąta, upewniając się, że sekcje mają grubość od 70 do 90 nanometrów i mają srebrzystozłoty połysk. Odsuń sekcje od krawędzi noża diamentowego za pomocą włoska na patyku, aby utworzyć długą wstążkę. Podnieś wstążkę, zanurzając trzymilimetrową pętlę odbiorczą w mieszaninie jeden do jednego 2,3 molowej sacharozy i 2% metylocelulozy.

Włóż pętlę do komory kriogenicznej mikrotomu, a gdy kropla zacznie zamarzać, natychmiast podnieś sekcje, delikatnie dociskając kroplę do nich. Usuń pętlę z komory kriogenicznej. Poczekaj, aż kropla całkowicie się rozmrozi i dociśnij kroplę do przygotowanej siatki.

Umieść kratki z sekcjami na około jednym mililitrze PBS w małym naczyniu lub płytce wielodołkowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Przetwarzaj siatki na około 75 mikrolitrach kropelek na Parafilm i zacznij od płukania glicyną PBS w temperaturze pokojowej. Inkubować kratki z buforem blokującym złożonym z 0,1% albuminy C surowicy bydlęcej i 0,5% żelatyny ze skóry rybiej w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej jako etap blokujący.

Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w buforze blokującym w PBS i inkubować siatki na około 10 mikrolitrowych kropelkach tego roztworu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj kratki w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej w PBS pięć razy w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe i DAPI w buforze blokującym w PBS.

Następnie inkubować kratki na około 10 mikrolitrowych kropelkach tego roztworu przez 30 minut lub dłużej w temperaturze pokojowej, a następnie umyć kratki w PBS pięć razy, jak pokazano wcześniej. Aby zamontować próbki do mikroskopii świetlnej, zanurz siatki w 50% glicerolu w wodzie destylowanej dwa razy na pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść jedną kratkę na szkiełko nakrywkowe między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym w 50% glicerolu, upewniając się, że sekcje są skierowane w stronę szkiełka nakrywkowego.

W przypadku mikroskopii świetlnej należy przenieść szklane szkiełko z warstwowymi siatkami do mikroskopu szerokokątnego ze zautomatyzowanym stolikiem. Wybierz obiektyw olejowy o dużym powiększeniu i utwórz zestaw kafelków obrazu składający się ze wstążki sekcji. Następnie, w celu demontażu i mikroskopii elektronowej lub kontrastu EM, dodaj 10 mikrolitrów wody destylowanej z boku kanapki ze szkiełkiem podstawowym i poczekaj, aż działanie kapilarne wypełni interfejs kanapki ze szklaną pokrywką

Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe, nie mieszając oleju immersyjnego z glicerolem. Wyjmij kratki pęsetą i zanurz je trzykrotnie w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej, aby zmyć 50% glicerolu. Ostrożnie osusz tylną część kratki niestrzępiącą się bibułką i połóż kratki stroną do dołu na kropelkach wody destylowanej.

Aby wybarwić skrawki w celu kontrastu w mikroskopii elektronowej, inkubuj je z octanem uranylu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Schłodzić roztwór metylocelulozy octanu uranylu, umieszczając kropelki na Parafilm na metalowej płytce na lodzie. Następnie dwukrotnie umyj kratki tym lodowatym roztworem i inkubuj je w roztworze przez 10 minut.

Zapętlić kratki, wkładając pętlę do suszenia siatki do kropli octanu uranylu metylocelulozy poniżej każdej siatki i delikatnie podnosząc ją, aż siatka zostanie ściągnięta z kropli. Aby zeskrobać nadmiar roztworu, dotknij pętli pod kątem około 60 stopni na niestrzępiącej się bibule filtracyjnej i powoli przeciągnij ją wzdłuż bibuły, aż roztwór przestanie się wchłaniać. Umieść pętlę z siatką w odpowiednim stojaku i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na ponad 10 minut.

Skorzystaj z przeglądu uzyskanego za pomocą mikroskopii świetlnej, aby zlokalizować obszar zainteresowania do obrazowania w transmisyjnym mikroskopie elektronowym lub TEM i dodać adnotację do zwrotu z inwestycji w zestawie danych mikroskopii świetlnej. Po wybraniu regionu uzyskaj kafelek obrazu ustawiony na powiększenie od 20 000x do 50 000x w TEM. Zrekonstruuj zestaw kafelków obrazu w oprogramowaniu do przetwarzania końcowego.

Wykonaj korelację na podstawie sygnału DAPI i fluorescencji oraz konturów jądrowych w mikroskopii elektronowej. Przesuń obrazy, aby precyzyjnie je nałożyć i dokładnie wykonać ręczną korelację. Komórki HEPG2 pochodzące z hepatoblastoma były głodzone przez dwie godziny w EBSS przed utrwaleniem za pomocą 4% paraldehydu przez dwie godziny.

Obrazowanie IF LC3 i LAMP1 na przekrojach ujawnia stosunkowo niewiele punktów LC3 i niewielką kolokalizację z LAMP1. Informacje molekularne z IF powiązano z informacjami ultrastrukturalnymi uzyskanymi w mikroskopii elektronowej poprzez nałożenie na siebie dwóch modalności obrazowania opartych na DAPI i konturach jądrowych. Korelacja organelli LC3 dodatnich z ultrastrukturą EM ujawniła, że różne punkcte reprezentowały różne etapy autofagii.

Ultrastruktura poszczególnych przedziałów oznaczonych LC3, zilustrowana w polu pierwszym, jest pokazana tutaj. Obrazy z korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła są pokazane po lewej stronie, a obrazy z pseudokolorowej mikroskopii elektronowej są pokazane po prawej. Wewnętrzne i zewnętrzne błony autofagosomalne są oznaczone białymi i czarnymi grotami strzałek.

Co ciekawe, EM zidentyfikował stosunkowo słabe plamki fluorescencyjne jako autolizosomy LC3-dodatnie, które charakteryzują się gęstą zawartością i pęcherzykami śródświetlnymi. Ujawnia to minimalną widoczność LC3 w IF ultracienkich skrawków kriogenicznych, co sugeruje wykrywalne LC3 w autolizosomach w stanie ustalonym pomimo degradującego środowiska. Jednak LC3 dodatnie puncta reprezentują głównie autofagosomy, a niewiele reprezentuje autolizosomy.

Dla badaczy, którzy chcą wykonać znakowanie immunogold zamiast CLEM na sekcji, opisane tutaj protokoły i wskazówki mają również pełne zastosowanie do znakowania immunogold. Początkowo zastosowaliśmy CLEM w sekcji do endosomalnych białek regulatorowych o niskiej liczebności i po raz pierwszy wykazaliśmy ich endogenną lokalizację ultrastrukturalną.