Name: Izolacja i charakterystyka mysich więzadeł maciczno-krzyżowych i narządów dna miednicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:25:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Poznaj metodę izolacji więzadeł maciczno-krzyżowych u myszy z zachowaniem struktur anatomicznych. Protokół umożliwia badanie mechanicznych właściwości tkanek miednicy i rozwój modelu preklinicznego chorób podłogowych miednicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) (C.B.), NSF Graduate Research Fellowship (L.S.), Schmidt Science Fellowship (C.L.), University of Colorado Research & Innovation Seed Grant Program (2020 nagroda dla V.F., S.C. i K.C.) oraz Anschutz Boulder Nexus Seed Grant na University of Colorado (dla V.F. i K.C.). Specjalne podziękowania należą się dr Tylerowi Tuttle'owi za pomoc w zaprojektowaniu komory załadowczej, a także członkom laboratorium Calve za pomocne dyskusje.

Wszystkie eksperymenty i procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem nr 2705, zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Kolorado w Boulder. W niniejszym badaniu wykorzystano sześciotygodniowe samice myszy C57BL/6J. Zwierzęta pozyskano z komercyjnego źródła (patrz Tabela materiałów).
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Uśmierć zwierzę zgodnie z zatwierdzoną metodą instytucjonalną. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano inhalację CO2 zgodnie z wytycznymi American Veterinary Medical Association (szybkość wypierania od 30% do 70% objętości komory CO2 na minutę), a następnie zwichnięcie stawów szyjnych, aby zapewnić skuteczną eutanazję.
	<ol>
		<li>Jeśli to możliwe, pracuj pod dygestorium, aby zminimalizować rozprzestrzenianie się alergenów mysich. Gdy mysz przestanie się poruszać i oddychać, odczekaj 2 min lub więcej, aby potwierdzić brak reakcji. 
		UWAGA: Jeśli mysz jest w ciąży lub w okresie poporodowym, szczenięta muszą zostać uśmiercone indywidualnie. Szczenięta w wieku E15.5 i starsze muszą zostać poddane dekapitacji podczas sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zestaw do sekcji, składający się z podkładki sekcyjnej, skalpela z ostrzem nr 11, zakrzywionych cienkich ostrych nożyczek, dwóch par pęset, pęsety zakrzywionej, nici chirurgicznej polyglactin 5-0, mikroskopu sekcyjnego oraz sześciu szpilek (Rycina 1, patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść mysz na podkładce i przypnij przednie kończyny (Rycina 2A). Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie o długości około 1-1,5 cm w jamie brzusznej (Rycina 2B). Delikatnie użyj nożyczek, aby oddzielić skórę po stronie kranialnej, kaudalnej i bocznej nacięcia (Rycina 2C, D).</li>
	<li>Odwróć mysz na grzbiet i delikatnie odsunie skórę w stronę kończyn tylnych, aby odsłonić miejsce sekcji (Rycina 2E-H).</li>
	<li>Przypnij mysz za kończyny (Rycina 2I) i wykonaj nacięcie o długości około 1 cm w jamie brzusznej, od klatki piersiowej do miednicy (Rycina 2J). 
	UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić leżących poniżej organów.</li>
	<li>Delikatnie przesuń organy w stronę klatki piersiowej, aby oczyścić pole widzenia (Rycina 2K). 
	UWAGA: Przemywaj tkanki 1x PBS, aby utrzymać ich nawilżenie.</li>
	<li>Usuń całą tkankę tłuszczową z dna miednicy (Rycina 2L-N). 
	​UWAGA: Użyj pęsety, aby delikatnie odciągnąć i usunąć tłuszcz z organów i tkanek będących przedmiotem zainteresowania.</li>
</ol>
<img alt="Zestaw do sekcji z mikroskopem, narzędziami, szalkami Petriego i PBS do analizy biologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Czyste miejsce pracy ze wszystkimi narzędziami niezbędnymi do przeprowadzenia sekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces sekcji myszy przedstawiający kolejne etapy chirurgiczne; obejmuje odsłonięcie tkanek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Usunięcie skóry i otwarcie jam miednicznej oraz klatki piersiowej myszy. (A) Przytwierdzanie wszystkich kończyn szpilkami. (B) Pierwsze nacięcie. (C) Oddzielanie skóry od leżącej pod nią powięzi za pomocą nożyczek. (D) Przecinanie skóry i przygotowanie do jej usunięcia. (E-G) Ściąganie skóry poprzez prowadzenie cięcia wokół myszy. (H) Całkowite usunięcie skóry z grzbietu. (I) Całkowite usunięcie skóry z tułowia i ponowne przytwierdzenie kończyn myszy. (J) Otwarcie jamy brzusznej. (K) Widok otwartej jamy brzusznej. (L) Przesunięcie organów poza pole widzenia. (M) Usunięcie tkanki tłuszczowej. (N) Widok oczyszczonego dna miednicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Pozyskiwanie USL
<ol>
	<li>Odciąć rogi macicy od jajników (Rycina 3B), odsunąć je z pola widzenia i odciąć w miejscu połączenia z szyjką macicy (Rycina 3C). 
	UWAGA: Rogi macicy można zidentyfikować zgodnie ze schematem na Rycynie 3A. Płukać tkanki 1x PBS, aby utrzymać ich nawilżenie.</li>
	<li>Odciąć moczowody w miejscu połączenia z pęcherzem moczowym (Rycina 3D). 
	UWAGA: Ma to na celu uniknięcie pomylenia ich z USL.</li>
	<li>Odciąć okrężnicę jak najbliżej szyjki macicy (Rycina 3E,F). 
	UWAGA: Płukać tkanki 1x PBS, aby utrzymać ich nawilżenie.</li>
	<li>Umieścić mysz wraz z podkładką sekcyjną pod mikroskopem sekcyjnym, aby zwizualizować USL (Rycina 3G).</li>
	<li>Używając pęsety, delikatnie oczyścić USL z otaczającej tkanki tłuszczowej. 
	UWAGA: Użyć drugiej pęsety, aby unieść szyjkę macicy pod niewielkim kątem, co ułatwi wizualizację miejsca, w którym USL łączy się z szyjką macicy. Płukać tkanki 1x PBS, aby utrzymać ich nawilżenie.</li>
	<li>Związać końce szyjkowe obu USL szwem z poliglaktyny 5-0 (Rycina 4B, C). 
	UWAGA: USL można zidentyfikować za pomocą schematu i obrazów powiększenia (Rycina 4I-K).</li>
	<li>W niniejszym badaniu jedno USL jest wykorzystywane do analiz morfologicznych lub biochemicznych (np. mikroskopii Ramana, immunohistochemii, histologii). Odciąć koniec szyjkowy USL, pozostawiając fragment szyjki macicy, a następnie odciąć fragment mięśnia z dolnej części USL (Rycina 4D). Umieścić wypreparowaną tkankę w kąpieli z 1x PBS, aby utrzymać jej nawilżenie (Rycina 4G, H).</li>
	<li>Pozostałe USL wykorzystać do testów mechanicznych i obrazowania. Odciąć koniec szyjkowy USL, pozostawiając fragment szyjki macicy, aby ułatwić przygotowanie układu mechanicznego (Rycina 4D). 
	UWAGA: Tkanka szyjki macicy będzie pełnić funkcję kotwicy służącej do unieruchomienia USL podczas testu mechanicznego.</li>
	<li>Po pobraniu wszystkich interesujących tkanek (kroki 3-5), zwichnąć kości udowe z miednicy (Rycina 4E). 
	UWAGA: Podczas oddzielania głowy kości udowej od panewki stawu biodrowego powinien być słyszalny cichy trzask.</li>
	<li>Odciąć kość miednicy w jej końcach dystalnych i proksymalnych, pozostawiając około 10 mm tkanki (Rycina 4F). Umieścić wypreparowaną tkankę w 1x PBS.</li>
</ol>
<img alt="Schemat sekcji myszy i kolejność operacji; metoda usuwania macicy; konfiguracja mikroskopu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Oczyszczone dno miednicy do sekcji USL. (A) Schemat anatomiczny. (B) Przecinanie rogów macicy w miejscu połączenia z jajnikiem. (C) Odcinanie rogów macicy. (D) Przecinanie moczowodów. (E) Przecinanie okrężnicy. (F) Wyraźny widok odbytnicy i USL. (G) Umieszczenie myszy i podkładki sekcyjnej pod mikroskopem stereoskopowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przygotowanie do zabiegu chirurgicznego w okolicy rektowaginalnej u myszy; schematy, etapy sekcji i obrazy badania tkanek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Widok USL i otaczających tkanek oraz sekcja USL. (A) Schemat punktów orientacyjnych anatomii otaczających USL. (B) Zawiązywanie szwu wokół końców szyjnych. (C) Odcinanie końców szyjnych USL. (D) Odcinanie USL w miejscu połączenia sakralnego do późniejszych analiz biochemicznych. (E) Odcinanie kości udowych od kości miednicy. (F) Odcinanie proksymalnego końca miednicy. (G) Sekcja USL w szalce Petriego 35 mm. (H) USL z przyłączoną miednicą w szalce Petriego 35 mm. (I) USL i odbytnica przy powiększeniu 0,75x. (J) Usuwanie tłuszczu z USL. (K) Oczyszczanie USL przy powiększeniu 1,0x. Pasek skali = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Pobieranie pęcherza
<ol>
	<li>Po usunięciu tkanki tłuszczowej należy chwycić pęcherz pęsetą i delikatnie unieść go pod kątem około 40° (Rycina 5A).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek należy odciąć pęcherz od strony dystalnej, bezpośrednio nad szyjką macicy (Rycina 5B).</li>
	<li>Tkankę należy umieścić w kąpieli z 1x PBS, aby utrzymać jej nawilżenie (Rycina 5H).</li>
</ol>
4. Pobieranie odbytnicy
<ol>
	<li>Po odłączeniu więzadeł szerokich macicy (USL) od szyjki macicy i wypreparowaniu pęcherza moczowego, unieś szyjkę macicy pęsetą pod kątem około 40°. Pomiędzy odbytnicą a szyjką macicy znajduje się powięź odbytniczo-pochwowa. Za pomocą skalpela delikatnie przetnij to połączenie (Rysunek 5C, D).</li>
	<li>Przetnij kość łonową na wysokości spojenia łonowego za pomocą nożyczek. Delikatnie poszerz pole operacyjne, aby zwiększyć widoczność miejsc przyczepu tkanek.</li>
	<li>Za pomocą pęsety delikatnie pociągnij odbytnicę w kierunku klatki piersiowej, a następnie użyj nożyczek, aby prowadzić wzdłuż tylnej ściany odbytnicy aż do odbytu. Przetnij odbytnicę na wysokości odbytu (Rysunek 5E).</li>
	<li>Umieść tkankę w 1x PBS, aby zapobiec jej odwodnieniu (Rysunek 5I).</li>
</ol>
5. Pobieranie kompleksu szyjka macicy-pochwa
<ol>
	<li>Po usunięciu szwów USL z szyjki macicy, należy uchwycić szyjkę macicy pęsetą. Odciąć szyjkę macicy jak najbliżej sromu za pomocą nożyczek (Rysunek 5F, G). 
	UWAGA: Należy pamiętać o przecięciu spojenia łonowego, aby wizualnie odsłonić dystalny koniec pochwy.</li>
	<li>Umieścić tkankę w 1x PBS, aby zapobiec jej odwodnieniu (Rysunek 5J).</li>
</ol>
<img alt="Eksperyment z sekcji gryzonia pokazujący wycinanie organów i próbki tkanek w szalkach Petriego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Sekcje pęcherza moczowego, odbytnicy oraz szyjki macicy/pochwy. (A) Trzymanie pęcherza moczowego pod kątem. (B) Odcinanie pęcherza moczowego. (C) Przecinanie ścięgna łączącego szyjkę macicy z odbytnicą. (D) Ścięgno przy powiększeniu 1,0x. (E) Przecinanie odbytnicy. (F) Trzymanie szyjki macicy pęsetą. (G) Przecinanie na dystalnym końcu pochwy. (H) Pęcherz moczowy w 35 mm szalce Petriego. (I) Odbytnica w 35 mm szalce Petriego. (J) Kompleks tkankowy szyjki macicy i pochwy w 35 mm szalce Petriego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
6. Przygotowanie próbek do charakterystyki tkanki
<ol>
	<li>Analizy mechaniczne i wizualne USL
	<ol>
		<li>Umieść USL wraz z przyczepem miednicznym na ściance w kształcie litery T w specjalnie zaprojektowanej studni do barwienia, aby zapewnić pełne zanurzenie w roztworze barwiącym (rysunki CAD studni znajdują się w Supplementary Coding File 1 oraz Supplementary Coding File 2). 
		UWAGA: Do ułatwienia rozmieszczenia użyj nici chirurgicznej i pęsety.</li>
		<li>Rozcieńcz dostępny komercyjnie barwnik do wolnych grup aminowych (5 µL, patrz Table of Materials) w 2,5 mL 1x PBS, dodaj roztwór do specjalnej studni do barwienia i barw tkankę przez 2 h na wytrząsarce w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Przed dodaniem do studni do barwienia wymieszaj roztwór w wirówce typu vortex.</li>
		<li>W ciągu ostatnich 15 min barwienia dodaj do roztworu 2,5 µL dostępnego komercyjnie barwnika do jąder martwych komórek (patrz Table of Materials). 
		UWAGA: Przed dodaniem do studni do barwienia wymieszaj roztwór w wirówce typu vortex.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza Ramanowska USL
	<ol>
		<li>Przymocuj USL w linii prostej do bloku z polidimetylosiloksanu (PDMS) umieszczonego w specjalnej studni. 
		UWAGA: PDMS służy jako miękkie podłoże umożliwiające przymocowanie próbki w pożądanej konfiguracji. Bloki o różnych wymiarach można wykonać poprzez zmieszanie dwóch komponentów zgodnie z instrukcją producenta (patrz Table of Materials), odlanie w szalce Petriego, a po polimeryzacji wycięcie PDMS w wymaganym kształcie za pomocą ostrza skalpela.</li>
		<li>Przymocuj próbkę za pomocą szpilek entomologicznych w miejscu pętli szwu oraz w mięśniu miednicznym. Nawilż tkankę roztworem 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostałe tkanki
	<ol>
		<li>Szybko zamroź pozostałe tkanki w ciekłym azocie lub w odpowiednim medium do zatapiania, w zależności od planowanych analiz.</li>
		<li>Przechowuj tkanki w temperaturze −80 °C do czasu przeprowadzenia kolejnych analiz (np. testów immunohistochemicznych lub biochemicznych).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Maldonado, P. A., Wai, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+and+Gynecology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pelvic organ prolapse.</a> Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 43 (1), 15-26 (2016).</li>
<li>Drewes, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pelvic+organ+prolapse+in+fibulin-5+knockout+mice%3A+Pregnancy-induced+changes+in+elastic+fiber+homeostasis+in+mouse+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina.</a> American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).</li>
<li>Barber, M. D., Maher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcome+assessment+of+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22International+Urogynecology+Journal+and+Pelvic+Floor+Dysfunction%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcome assessment of pelvic organ prolapse.</a> International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 24 (11), 1783-1790 (2013).</li>
<li>Becker, W. R., De Vita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biaxial+mechanical+properties+of+swine+uterosacral+and+cardinal+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+in+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).</li>
<li>Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+uterosacral+ligaments%3A+Current+knowledge%2C+existing+gaps%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions.</a> Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).</li>
<li>Amundsen, C. L., Flynn, B. J., Webster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+correction+of+vaginal+vault+prolapse+by+uterosacral+ligament+fixation+in+women+who+also+require+a+pubovaginal+sling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Anatomical correction of vaginal vault prolapse by uterosacral ligament fixation in women who also require a pubovaginal sling.</a> Journal of Urology. 169 (5), 1770-1774 (2003).</li>
<li>Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pelvic organ prolapse.</a> The Lancet. 396 (9566), 1027-1038 (2007).</li>
<li>Blomquist, J. L., Muñoz, A., Carroll, M., Handa, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+delivery+mode+with+pelvic+floor+disorders+after+childbirth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Association of delivery mode with pelvic floor disorders after childbirth.</a> Journal of the American Medical Association. 320 (23), 2438-2447 (2018).</li>
<li>Iwanaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+histology+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+pelvic+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Urogynecology+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments.</a> International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+extracellular+matrix+protein+expression+and+apoptosis+in+the+uterosacral+ligaments+of+patients+with+or+without+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22International+Urogynecology+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse.</a> International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).</li>
<li>Jimenez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+mechanical+characterization+and+computational+modeling+of+fibrin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multiscale mechanical characterization and computational modeling of fibrin gels.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Fischenich, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+articular+cartilage+is+orthotropic+where+microstructure%2C+micromechanics%2C+and+chemistry+vary+with+depth+and+split-line+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).</li>
<li>Luetkemeyer, C. M., Neu, C. P., Calve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+defining+tissue+injury+criteria+reveals+ligament+deformation+thresholds+are+multimodal%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A method for defining tissue injury criteria reveals ligament deformation thresholds are multimodal.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>O'Brien, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Raman+spectroscopy+for+biochemical+monitoring+of+the+human+cervix+throughout+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">In vivo Raman spectroscopy for biochemical monitoring of the human cervix throughout pregnancy.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 218 (5), 1-18 (2018).</li>
<li>Louwagie, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+ultrasonic+dimensions+and+parametric+solid+models+of+the+gravid+uterus+and+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">et al. ultrasonic dimensions and parametric solid models of the gravid uterus and cervix.</a> PLoS One. 16 (1), 0242118(2021).</li>
<li>Drewes, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pelvic+organ+prolapse+in+fibulin-5+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice.</a> The American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).</li>
<li>Rahn, D. D., Ruff, M. D., Brown, S. A., Tibbals, H. F., Word, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+properties+of+the+vaginal+wall%3A+Effect+of+pregnancy%2C+elastic+fiber+deficiency%2C+and+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Biomechanical properties of the vaginal wall: Effect of pregnancy, elastic fiber deficiency, and pelvic organ prolapse.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (5), 1-6 (2008).</li>
<li>Roman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+alternative+materials+for+the+treatment+of+stress+urinary+incontinence+and+pelvic+organ+prolapse%3A+A+comparison+of+the+in+vivo+response+to+meshes+implanted+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Evaluating alternative materials for the treatment of stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse: A comparison of the in vivo response to meshes implanted in rabbits.</a> Journal of Urology. 196 (1), 261-269 (2016).</li>
<li>Couri, B. M., Lenis, A. T., Borazjani, A., Paraiso, M. F., Damaser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+female+pelvic+organ+prolapse%3A+Lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned.</a> Expert Review of Obstetrics & Gynecology. 7 (3), 49(2012).</li>
<li>Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+mechanics%2C+animal+models%2C+and+pelvic+organ+prolapse%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecologyand+Reproductive+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review.</a> European Journal of Obstetrics & Gynecologyand Reproductive Biology. 144, S146-S158 (2009).</li>
<li>Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-structural+and+biaxial+creep+properties+of+the+swine+uterosacral-cardinal+ligament+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex.</a> Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).</li>
<li>Tan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-mechanical+properties+of+the+swine+cardinal+and+uterosacral+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).</li>
<li>Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+analysis+of+the+uterosacral+ligament%3A+Swine+vs.+human%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical analysis of the uterosacral ligament: Swine vs. human.</a> Annals of Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).</li>
<li>Vardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+hormone+replacement+on+the+biomechanical+properties+of+the+uterosacral+and+round+ligaments+in+the+monkey+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">The effects of hormone replacement on the biomechanical properties of the uterosacral and round ligaments in the monkey model.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (5), 1741-1751 (2005).</li>
<li>Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+to+macaque+uterosacral-cardinal+ligament+complex+and+its+relationship+to+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Pathology%22%5BJournal%5D)">Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse.</a> Toxicological Pathology. 36 (7), 101(2008).</li>
<li>Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+to+measure+in+vivo+uterine+suspensory+ligament+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).</li>
<li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rodents+as+models+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of rodents as models for human diseases.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wpływ uszkodzeń strukturalnych na żeńskie tkanki rozrodcze jest niedostatecznie zbadany i potrzebny jest łatwo dostępny model zwierzęcy do badań nad TZO. Mysz jest opłacalnym modelem, który może naśladować badania nad reprodukcją ludzi16. Ze względu na rosnące zainteresowanie badaniami żeńskiego układu rozrodczego istnieje zapotrzebowanie na metody wspomagające badanie tych tkanek. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, w niniejszej pracy opracowano metodę preparowania i przygotowania tkanek dna miednic...

Około 50% kobiet cierpi na wypadanie narządów miednicy (POP)1,2. Około 11% tych kobiet spełnia kryteria poddania się zabiegowi chirurgicznemu, który ma słaby wskaźnik powodzenia (~30%)3,4. POP charakteryzuje się zejściem któregokolwiek lub wszystkich narządów miednicy (tj. pęcherza moczowego, macicy, szyjki macicy i odbytnicy) z ich naturalnej pozycji z powodu niewydolności USL i mięśni dna miednicy w celu zapewnienia odpowiedniego wsparcia5. Stan ten obejmuje dysfunkcję anatomiczną i przerwanie tkanki łącznej, a także uszkodzenie nerwowo-mięśniowe, a także czynniki predysponujące3,6. POP jest związany z wieloma czynnikami, takimi jak wiek, waga, poród i rodzaj porodu (np. poród naturalny lub cesarskie cięcie). Uważa się, że czynniki te wpływają na integralność mechaniczną wszystkich tkanek dna miednicy, przy czym ciąża i poród są uważane za główne czynniki powodujące POP5,7,8. 
Więzadła maciczno-krzyżowe (USL) są ważnymi strukturami podporowymi dla macicy, szyjki macicy i pochwy oraz wiążą szyjkę macicy z kością krzyżową4. Uszkodzenie USL naraża kobiety na zwiększone ryzyko rozwoju POP. Uważa się, że ciąża i poród dodatkowo obciążają USL, co potencjalnie wywołuje uraz i zwiększa ryzyko POP. USL to złożona tkanka złożona z komórek mięśni gładkich, naczyń krwionośnych i limfatycznych rozmieszczonych niejednorodnie wzdłuż więzadła, które można podzielić na trzy odrębne sekcje: szyjną, pośrednią i krzyżową9. Integralność mechaniczna USL pochodzi ze składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takich jak kolageny, elastyna i proteoglikany5,9,10. Wiadomo, że włókna kolagenowe typu I są głównym nośnym składnikiem rozciągającym tkanki więzadłowe i dlatego prawdopodobnie biorą udział w awarii USL i POP11. 
Brakuje wiedzy na temat przyczyn, rozpowszechnienia i skutków POP u kobiet. Opracowanie odpowiedniego zwierzęcego modelu POP jest konieczne, aby pogłębić naszą wiedzę na temat dna miednicy kobiety. Myszy i ludzie mają podobne anatomiczne punkty orientacyjne w obrębie miednicy, takie jak moczowody, odbytnica, pęcherz moczowy, jajniki i więzadła okrągłe9, a także podobne punkty przecięcia USL z macicą, szyjką macicy i kością krzyżową. Co więcej, myszy oferują łatwość manipulacji genetycznej i mają potencjał, aby stać się łatwo dostępnym, opłacalnym modelem do badania POP9. 
To badanie opracowało metodę dostępu i izolacji USL oraz różnych tkanek dna miednicy od nieródek (tj. nigdy nie będących w ciąży) myszy. Wyekstrahowane USL poddano trawieniu enzymatycznemu (tj. w celu usunięcia kolagenów i glikozaminoglikanów), przetestowano w celu określenia odpowiedzi mechanicznej pod obciążeniem rozciągającym i oceniono pod kątem składu biochemicznego w badaniu potwierdzającym słuszność koncepcji. Zdolność do izolowania nienaruszonych tkanek ułatwi dalszą mechaniczną i biochemiczną charakterystykę składników dna miednicy, co jest kluczowym pierwszym krokiem w kierunku lepszego zrozumienia ryzyka urazów związanych z porodem, ciążą i POP.

<table><tbody><tr><td>11 Blade</td><td>Fisher</td><td>3120030</td><td>Zdejmowane ostrze</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>Rozcieńczony od 10x stężenia</td></tr><tr><td>Chondroitynaza ABC</td><td>Sigma</td><td>C3667-10UN</td><td>Enzym&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Worthington Biochemiczny</td><td>LS004194</td><td>enzymatyczny&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 5</td><td>Konfiguracja pionowa</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>S9E</td><td>Z kamerą</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Fisher</td><td>NC9626652</td><td>Cienka końcówka</td></tr><tr><td>Samica myszy C57BL/6J</td><td>Jackson Szczep</td><td>laboratoryjny #: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator FemtoTools</td><td>FT-RS1002</td><td></td><td>100 mN</td></tr><tr><td>Kleszczyki zakrzywione FST</td><td>Fisher</td><td>NC9639443</td><td>Zakrzywiona końcówka</td></tr><tr><td>Nożyczki FST Sharp 9 mm&nbsp;</td><td>Nożyczki preparacyjne</td> <td>Fisher</td><td>NC9639443</td></tr><tr><td>Ghost Dye 780&nbsp;</td><td>Tonbo</td><td>13-0865-T500</td><td>Bezpłatna plama aminowa</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td>Pudełko 50 chusteczek</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue Tek</td><td>4583</td><td>Służy do konserwacji tkanek</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Thermo Fisher</td><td>044764.AK</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 35 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875711A</td><td>Używany do preparowania tkanek</td></tr><tr><td>Poliglaktyna 5-0 Szew</td><td>Veter.Sut</td><td>VS385VL</td><td>Z igłą</td></tr><tr><td>Mikroskop Ramanowski Renishaw InVia</td><td>Renishaw</td><td>PN192(EN)-02-A</td><td>Z obiektywami konfokalnymi</td></tr><tr><td>Platforma bujana</td><td>VWR</td><td>10127-876</td><td>Platforma 2-poziomowa</td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne</td><td>Fisher</td><td>52818</td><td>Do preparacji&nbsp;</td></tr><tr><td>Sytox</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11381</td><td>Bejca jądrowa&nbsp;</td></tr><tr><td>Szpilki teowe</td><td>Fisher</td><td>S99385</td><td>Do rozwarstwienia&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>Do rozwarstwienia&nbsp;</td></tr><tr><td>Podkłady</td><td>Fisher</td><td>22037950</td><td>Do zakrycia podkładki preparacyjnej</td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka mysich więzadeł maciczno-krzyżowych i narządów dna miednicy

Isolation and Characterization of the Murine Uterosacral Ligaments and Pelvic Floor Organs

Wypadanie narządów miednicy (POP) to stan, który wpływa na integralność, strukturę i mechaniczne wsparcie dna miednicy. Narządy w dnie miednicy są wspierane przez różne struktury anatomiczne, w tym mięśnie, więzadła i powięź miednicy. Więzadło maciczno-krzyżowe (USL) jest krytyczną strukturą nośną, a uszkodzenie USL powoduje większe ryzyko rozwoju POP. Niniejszy protokół opisuje sekcję mysich USL i narządów dna miednicy wraz z uzyskaniem unikalnych danych na temat składu biochemicznego i funkcji USL za pomocą spektroskopii Ramana i oceny zachowania mechanicznego. Myszy są nieocenionym modelem w badaniach przedklinicznych, ale analiza mysiego USL jest trudnym i skomplikowanym procesem. Procedura ta przedstawia podejście do kierowania sekcją tkanek dna miednicy myszy, w tym USL, w celu umożliwienia wielu ocen i charakterystyki. Prace te mają na celu pomoc w preparowaniu tkanek dna miednicy przez naukowców i inżynierów zajmujących się badaniami podstawowymi, rozszerzając w ten sposób dostępność badań nad USL i warunkami dna miednicy oraz przedklinicznych badań nad zdrowiem kobiet przy użyciu modeli mysich.

Każdy etap sekcji myszy typu dzikiego został szczegółowo opisany w powiązanym filmie oraz na rysunkach dołączonych do protokołu. W badaniu tym wykorzystano 6-tygodniowe samice myszy C57BL/6J (Supplementary Table 1). Przeanalizowano trzy grupy próbek USL traktowanych różnymi enzymami: grupę kontrolną (bez traktowania), grupę traktowaną kolagenazą oraz grupę traktowaną chondroitynazą. Mięśnie gładkie, nerwy i naczynia limfatyczne w USL są otoczone przez ECM bogatą w kolageny włókniste i glikozaminoglikany ...

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół preparowania więzadeł maciczno-krzyżowych i innych tkanek dna miednicy, w tym szyjki macicy, odbytnicy i pęcherza moczowego u myszy, w celu rozszerzenia badań nad żeńskimi tkankami rozrodczymi.

Izolacja i charakterystyka mysich więzadeł maciczno-krzyżowych i narządów dna miednicy

Pelvic organ prolapse (POP) is a condition that affects the integrity, structure, and mechanical support of the pelvic floor. The organs in the pelvic ...

Protokół ten rozszerzy dostępność badań nad chorobami więzadła maciczno-krzyżowego i dna miednicy, takimi jak wypadanie narządów miednicy lub POP, oraz ułatwi preparację lustrzanej tkanki dna miednicy. Technika ta pozwala na odizolowanie obu więzadeł maciczno-krzyżowych od myszy przy jednoczesnym zachowaniu anatomicznych przyczepów i odzyskaniu otaczających narządów dna miednicy. Nasza metoda ustanawia model przedkliniczny, który pozwala na zbadanie, w jaki sposób ciąża lub choroba wpływa na mechaniczne zachowanie tkanek.Metoda ta ustanawia nowe narzędzie do badań związanych ze zdrowiem kobiet. Główną walką jest identyfikacja i postępowanie z więzadłem maciczno-krzyżowym. Radzę poświęcić odpowiednią ilość czasu i zachować ostrożność, ponieważ te tkanki są małe i delikatne.Zacznij od umieszczenia uśpionej myszy na podkładce i przygwożdżenia czterech kończyn. Wykonaj nożyczkami nacięcie na brzuchu o długości od jednego do 1,5 centymetra. Delikatnie oddziel skórę po stronie czaszki, ogona i bocznych nacięcia.Odwróć mysz tak, aby była skierowana grzbietową stroną do góry i delikatnie oderwij skórę w kierunku tylnych kończyn. Przypnij kończyny i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w jami

isolation-characterization-murine-uterosacral-ligaments-pelvic-floor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja dorosłych komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie szybkości przylegania komórek do kolby.

Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych

Mierzymy obwodowo-płciową wrażliwość mechaniczną i aktywację komórek tucznych u samców myszy C57BL/6, które przeszły paradygmat stresu we wczesnym okresie życia - separację noworodków od matek, w celu wywołania przedklinicznego modelu przewlekłego zapalenia gruczołu krokowego/przewlekłego bólu miednicy.

Ocena wrażliwości okołopłciowej i aktywacji komórek tucznych gruczołu krokowego w mysim modelu separacji noworodków od matek

Ten protokół opisuje implantację siatki w przegrodzie odbytniczo-pochwowej owiec za pomocą techniki pojedynczego nacięcia pochwy, z i bez wprowadzania ramion kotwiczących pod kierunkiem trokaru.

Wprowadzenie siatki przezpochwowej w modelu owczym

Tutaj prezentujemy protokół standaryzujący pomiar wielkości dźwigacza i rozworu za pomocą rezonansu magnetycznego. Celem jest wydobycie wniosków biomechanicznych z analizy obrazu poprzez porównanie wartości spoczynku i wysiłku u pacjentów obu płci z wypadaniem miednicy, przy użyciu spójnych anatomicznych punktów orientacyjnych kostnych.

Kwantyfikacja powiększenia rozworu górnika górnika ani za pomocą rezonansu magnetycznego u mężczyzn i kobiet z wypadaniem narządów miednicy mniejszej

Ten protokół przedstawia ustandaryzowaną metodę hodowli komórek VX2 w hodowli i stworzenia ortotopowego modelu VX2 raka endometrium z przerzutami do węzłów chłonnych zaotrzewnowych u królików. Ortotopowe modele raka endometrium są ważne dla badań przedklinicznych nad nowymi metodami obrazowania w diagnostyce przerzutów do węzłów chłonnych.

Ortotopowy model raka endometrium z limfadenopatią zaotrzewnową wykonany z rozmnożonych i hodowanych in vivo komórek VX2

Skurcze macicy są ważne dla dobrego samopoczucia kobiet. Jednak patologicznie zwiększona kurczliwość może powodować bolesne miesiączkowanie, szczególnie u młodszych kobiet. W tym miejscu opisujemy prosty preparat ex vivo, pozwalający na szybką ocenę skuteczności leków zwiotczających mięśnie gładkie, które mogą być stosowane w leczeniu bolesnego miesiączkowania.

Metoda ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości układu rozrodczego myszy oraz algorytm śledzenia ruchu macicy oparty na MATLAB do analizy danych

Główne zwoje miednicy zawierają neurony przywspółczulne i współczulne, które unerwiają narządy miednicy. Tutaj opisujemy metodę preparacji i podajemy schematy identyfikacji tych zwojów i związanych z nimi nerwów. Metody te można zastosować do eksperymentalnej manipulacji tymi zwojami in vivo lub usunięcia pośmiertnego w celu dalszych badań.

Rozwarstwienie autonomicznych zwojów miednicy i związanych z nimi nerwów u samców i samic szczurów

Technika robotyczna opisana tutaj ma na celu szczegółowe przedstawienie stopniowego podejścia do wspomaganego przez robota całkowitego wycięcia mezorektalnego i wycięcia bocznych węzłów chłonnych miednicy w przypadku miejscowo zaawansowanego (T3/T4) raka odbytnicy znajdującego się poniżej odbicia otrzewnowego.

Wspomagane przez robota całkowite wycięcie mezorektalu i rozwarstwienie bocznych węzłów chłonnych miednicy w przypadku miejscowo zaawansowanego średnio-dolnego raka odbytnicy

Wypadanie narządów miednicy dotyka miliony kobiet na całym świecie, a mimo to niektóre powszechne interwencje chirurgiczne mają wskaźnik niepowodzeń sięgający nawet 40%. Brak standardowych modeli zwierzęcych do badania tego schorzenia hamuje postęp. Proponujemy następujący protokół jako model do zawieszenia więzadła maciczno-krzyżowego i prób rozciągania in vivo.

Opracowanie szczurzego modelu zawieszenia więzadła maciczno-krzyżowego

Tutaj wprowadzamy nowatorskie podejście znane jako laparoskopowa niesiatkowa pektopeksja szyjki macicy z zachowaniem macicy w przypadku wypadania narządów miednicy (LNMCPUP) dla pacjentek, które chcą zachować swoją macicę. Stałe szwy szyjki macicy służą do zawieszenia macicy do więzadła biodrowo-pektynowego przez więzadło okrągłe.

Laparoskopowa pektopeksja szyjki macicy bez siatki z zachowaniem macicy w przypadku wypadania narządów miednicy mniejszej

Zrosty wewnątrzmaciczne (IUA), najczęstsza patologiczna konsekwencja uszkodzenia endometrium, poważnie upośledzają funkcje rozrodcze. Urazy i infekcje są powszechnie uznawane za kluczowe czynniki ryzyka rozwoju IUA. Udało nam się stworzyć powtarzalny szczurzy model wkładki domacicznej, łącząc dwie krytyczne metody urazów: kiretaż mechaniczny i indukcję infekcyjną za pomocą lipopolisacharydu.

Opracowanie modelu szczurzego dla zrostów wewnątrzmacicznych poprzez podwójny uraz: łyżeczkowanie i infekcję

Poznaj metodę izolacji więzadeł maciczno-krzyżowych u myszy z zachowaniem struktur anatomicznych. Protokół umożliwia badanie mechanicznych właściwości tkanek miednicy i rozwój modelu preklinicznego chorób podłogowych miednicy.

Izolacja i charakterystyka mysich więzadeł maciczno-krzyżowych i narządów dna miednicy

Przeglądaj więcej filmów