Name: Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów w mikrogleju mózgu myszy za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybkie, ilościowe badanie zmian epigenetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Yanyang Bai za pomoc w leczeniu immunoblot na rysunku 5. Prace te były wspierane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem [CRC-RS 950-232402 do AC]; Kanadyjska Rada ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 do AC]; Fundacja Charytatywna Rytu Szkockiego [21103 do AC] oraz Fundacja Brain Canada [AWD-023132 do AC]; Stypendium dla absolwentów Aborygenów Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej (6481 do MT); Stypendium dla absolwentów Kolumbii Brytyjskiej (6768 do MT); Nagroda Kanadyjskiej Platformy Otwartej Neuronauki dla Studentów Stypendysty (10901 dla JK); Czteroletnie stypendium doktoranckie Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej (6569 do JK). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Mouse Brain Histone Modification Quantification Using Flow Cytometry

<ol><li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%3A+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li>
<li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367(2021).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications%2C+Long-Term+Potentiation%2C+and+Long-Term+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li>
<li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development%2C+Homeostasis%2C+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li>
<li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li>
<li>Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGosselin%2C+D+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+hard%2C+play+hard%3A+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011(2022).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Crowe, A., Yue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+Determination+of+Protein+Expression+Using+Immunohistochemistry+Staining+and+Analysis%3A+An+Integrated+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol.</a> BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).</li>
<li>Seligson, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+histone+modification+patterns+predict+risk+of+prostate+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence.</a> Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li>
<li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+H4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658(2016).</li>
<li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications%3A+A+MODEL-AD+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726(2021).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70(2019).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Conventional+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Flow+Cytometry+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Conventional Flow Cytometry.</a> Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+artifactual+and+confounding+glial+signatures+by+single-cell+sequencing+of+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain.</a> Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).</li>
<li>Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+quantitative+fluorescence+measurements+with+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).</li>
<li>Rumbaugh, G., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+in+the+brain%3A+measuring+global+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).</li>
<li>Xavier, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+delineation+of+signaling+and+epigenomic+mechanisms+underlying+microglia+inflammatory+activity+in+acute+and+chronic+brain+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRvix%22%5BJournal%5D)">Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies.</a> BioRvix. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół umożliwia ilościową ocenę globalnych poziomów HPTM za pomocą cytometrii przepływowej. Chociaż protokół ten przedstawia nowatorską metodę, poprzednie badania przeprowadzały ilościową ocenę białek przy użyciu podobnego podejścia26. Poprzednie metody stosowane do oceny globalnych poziomów HPTM obejmują immunohistochemię i western blot 16,17,19,20. Przedstawiona metoda oparta na cytometrii przepływowej jest metodą łatwo mierzalną, podczas gdy western blot i immunohistochemia są półilościowe i mają niższą przepustowość. Western blot opiera się na lizie komórek, a zatem wymaga zarówno normalizacji białka, jak i białka kontrolnego obciążenia, które zakłada się, że jest niezmienione w warunkach eksperymentalnych27. Immunohistochemia jest półilościowa i bardzo niskoprzepustowa, ponieważ trudno jest ilościowo ocenić ilość białka bez badania na poziomie pojedynczej komórki16. Podobnie w przypadku izolowanego mikrogleju stosowanie metody cytometrii przepływowej jest korzystne ze względu na ograniczoną wydajność, ponieważ western blot wymaga znacznie większego wkładu białka19. Wymagania dotyczące niskiej liczby komórek pozwalają na przeprowadzenie wielu paneli barwiących z tego samego zwierzęcia.
Jednak, podobnie jak w przypadku każdej innej metody, istnieją ograniczenia tej techniki, w tym koszt i dostępność przeciwciał, ponieważ nie wszystkie przeciwciała działają dobrze w warunkach cytometrii przepływowej. Ponadto, w porównaniu z immunoblotem, wymagane stężenie przeciwciał jest znacznie wyższe. Podczas gdy multipleksowanie pozwala na użycie wielu przeciwciał na tym samym panelu komórek, komórki nie mogą być pozbawione przeciwciała po analizie, co ogranicza użycie komórek do jednego na gatunek przeciwciał. Różni się to od immunoblot, w którym ten sam blot może być używany wielokrotnie. Jednak w zależności od dostępności przeciwciał i liczby kanałów detekcyjnych na cytometrze, możliwe byłoby badanie do kilkunastu znaczników jednocześnie.
Obecna metoda obejmuje tylko globalne poziomy ekspresji białek, a nie konkretną lokalizację genomu, a zmiany w poziomach globalnych mogą nie odzwierciedlać zmian w poszczególnych loci genomu. Podobnie, brak zmian na poziomach globalnych może nie oznaczać, że żadne loci genomowe nie ulegają zmianom, po prostu że globalne zmiany sumują się do zera różnic między terapiami. W związku z tym technika ta ma być używana jako badanie przesiewowe do identyfikacji HPTM będących przedmiotem zainteresowania do analizy genomowej. Ponadto metoda ta nie pozwala na porównanie różnych znaczników białkowych, z wyjątkiem sytuacji, gdy jest oceniana jako zmiana fałdowania w celu kontroli. W związku z tym jest to ograniczone w porównaniu ze standardową metodą opartą na krzywej, taką jak ELISA do oznaczania białek.
Przedstawiony protokół oferuje strategię izolowania żywego mikrogleju mózgu. Protokół ten opiera się na ekspresji białka P2RY12 do izolacji mikrogleju. Jednak P2RY12 jest markerem homeostatycznym w mikrogleju i może być regulowany w dół w modelach choroby, takich jak 5XFAD22. Dlatego używając zwierzęcia modelowego choroby, należy wybrać inne białka markerowe, takie jak TMEM119, CD11b lub CD45, aby pomóc w izolacji mikrogleju23. Podobnie przedstawiamy ten protokół jako izolację od hipokampa i/lub kory mózgowej. Protokół ten działałby w celu wyizolowania mikrogleju z innych regionów mózgu, w tym regionów istoty białej, jednak do uzyskania wystarczającej ilości mikrogleju może być potrzebnych wiele zwierząt, w zależności od wielkości obszarów zainteresowania.
Przedstawiony protokół może solidnie izolować żywy mikroglej mózgu, ale na etapie izolacji istnieje kilka etapów, opisanych poniżej, które mogą zmniejszyć wydajność komórek, jeśli zostaną wykonane nieprawidłowo.
Perfuzje dla tego protokołu powodują wyższy procent mikrogleju we fragmencie wzbogaconym immunologicznie, co skróci czas spędzony w sortowniku. Perfuzja nie jest jednak wymagana, a w razie potrzeby można zastosować inne metody eutanazji.
Podczas izolacji mikrogleju mielina powinna zostać całkowicie usunięta. Cytometry przepływowe opierają się na tym, że komórki są w stanie przemieszczać się przez wąskie rurki w szybkim tempie. Ze względu na swoją lepkość i skłonność do zbrylania się mielina powoduje problemy z cytometrami, często powodując zatkanie, które może zarówno uszkodzić sprzęt, jak i zniszczyć próbkę, drastycznie zmniejszając wydajność. Zachowaj ostrożność, aby usunąć całą mielinę podczas pobierania fragmentów wzbogaconych w układ odpornościowy, aby uniknąć problemów w dalszej części procesu.
Barwienie płytek a barwienie w probówkach: W tym protokole opisaliśmy dwie opcje barwienia komórek w probówkach o pojemności 1,5 ml lub na płytce 96-dołkowej. Przypadek użycia dla każdego z nich zależy od eksperymentu; Jednak ogólnie rzecz biorąc, barwienie probówek wiąże się z mniejszym ryzykiem wpływu na wydajność niż barwienie płytek, ponieważ pstryknięcie grozi utratą komórek, jeśli zostanie wykonane nieprawidłowo. Barwienie płytek jest znacznie szybsze, ponieważ zasysanie supernatantu do każdej probówki jest czasochłonne. Przed utrwaleniem (do sortowania itp.) należy użyć barwienia w probówkach, aby zmaksymalizować wydajność i zmniejszyć ryzyko strat. Jednak w przypadku analizy HPTM, po utrwaleniu komórek do barwienia wewnątrzjądrowego, osad jest bardziej stabilny i zmniejsza się ryzyko utraty przy miażdżeniu.
Ustalanie nieciągłego gradientu gęstości: Podczas ustanawiania warstw, prawidłowe ułożenie warstw jest niezbędne do uzyskania frakcji wzbogaconej immunologicznie. Jeśli warstwy są zakłócone lub wymieszane i wydają się mętne, komórki nie posortują się do pożądanego miejsca i wystąpią trudności w uzyskaniu frakcji komórkowej wzbogaconej w układ odpornościowy. Jeśli tak się stanie, odwirować z podłożem o gęstości, aby usunąć mielinę, a następnie zebrać całe pozostałe frakcje, rozcieńczyć 3 ml buforu FACS do 1 ml pożywki o gęstości i dobrze wymieszać (będzie to wymagało wielu probówek). Wirować z prędkością 500 x g przez 10 minut z hamulcem ustawionym na 0. Odrzucić supernatant, pozostawiając tylko ~300 μl roztworu. Zebrać całą próbkę i wybarwić ją. Spowoduje to zmniejszenie procentu sortowania i większą ilość czasu spędzonego przy cytometrze, ale wydajność nadal może być porównywalna.
W przypadku stosowania metody izolacji korzystna jest możliwość pobierania komórek do RNA i oceny HPTM z tego samego mózgu myszy. W tej sytuacji, po posortowaniu żywego mikrogleju, komórki można podzielić, aby przydzielić część do oceny RNA (minimalna liczba komórek wejściowych do uzyskania przyzwoitej wydajności RNA to 75 000 komórek) i część do dalszej analizy cytometrii przepływowej (minimum 10 000 komórek na studzienkę dla dobrego określenia MFI). W takim przypadku wymagane jest sortowanie cytometrem przepływowym. Jednak w przypadku planowania wykorzystania komórek tylko do analizy HPTM, sortowanie nie jest wymagane, a frakcja immunologiczna może być barwiona przeciwciałem P2RY12 i przeciwciałem HPTM. Bramkowanie na cytometrze można następnie ustawić dla mikrogleju P2RY12 +, tak jak w przypadku sortowania przepływowego, aby analizować tylko sygnał HPTM w mikrogleju. Wyeliminowanie sortowania pozwala na szybsze i bardziej opłacalne działanie protokołu. Ponadto, w przypadku oceny HPTM z hodowanych komórek, wystarczy rozpocząć od protokołu barwienia i nie są wymagane przeciwciała przeciwko markerom komórkowym, jak pokazano na rysunku 6. Protokół oceny HPTM może być stosowany w przypadku wielu typów komórek, w tym komórek hodowlanych, pierwotnych i pochodzących z IPSC.
Wreszcie, chociaż przedstawiliśmy tylko dwa potencjalne zastosowania mikrogleju po izolacji, istnieje wiele innych, w tym techniki epigenetyczne, takie jak ChIP, CUT&Tag i CUT&RUN. W przypadku genomowych technik epigenetycznych, w których interesujące jest scharakteryzowanie zmian w określonych loci, należy wybrać specyficzne inhibitory dla autorów i eraserów znaczników chromatyny11 dostosowane do eksperymentów, aby zapewnić, że wszelkie profilowane modyfikacje epigenetyczne mikrogleju nie są artefaktami technicznymi z żadnych etapów procedury izolacji, takich jak trawienie enzymatyczne. Podczas oceny zmian w globalnych poziomach znaczników epigenetycznych, na przykład przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej, nie oczekuje się, że jakiekolwiek zmiany wywołane procedurą będą tak duże, aby można je było wykryć na poziomie globalnym.
Ogólnie rzecz biorąc, omówione metody zapewniają nowatorską, jednokomórkową metodę ilościowego określania globalnych poziomów modyfikacji histonów i innych zmian epigenetycznych za pomocą cytometrii przepływowej. Wykazaliśmy, że ta metoda jest wystarczająco czuła, aby wykryć globalne zmiany markera wzmacniającego H3K27ac w mikrogleju w odpowiedzi na LPS in vivo. Jest to zgodne z wcześniejszym sekwencjonowaniem ChIP H3K27ac po stymulacji LPS, które wykazało dramatyczną przebudowę wzmacniaczy reagujących na LPS28. Zastosowania tej metody pozwolą na zbadanie globalnych zmian epigenetycznych w różnych typach komórek mózgowych w trakcie rozwoju i choroby.

Epigenetyka to badanie mechanizmów, które regulują ekspresję genów bez zmiany podstawowej sekwencji DNA. Epigenetyczna regulacja ekspresji genów jest dynamiczna w komórkach i może pozwolić na szybkie i skoordynowane reakcje na różne bodźce środowiskowe. Regulacja dynamiczna zachodzi częściowo z powodu zmian w strukturze chromatyny na poziomie nukleosomu, który składa się z białek histonowych (H2A, H2B, H3, H4) połączonych w rdzeń oktamera ciasno nawinięty przez DNA1. Interakcje między białkami histonowymi a DNA mogą kontrolować dostępność DNA dla maszynerii transkrypcyjnej, która ostatecznie może kontrolować ekspresję genów i inne aspekty biologii chromatyny2. Białka histonowe mają nieustrukturyzowane ogony, które zawierają dodatnio naładowane reszty, które tworzą oddziaływania elektrostatyczne z ujemnie naładowanym szkieletem DNA. Interakcje te skutkują ścisłym upakowaniem DNA i zmniejszoną dostępnością DNA. Kowalencyjne modyfikacje ogonów histonowych, zwane modyfikacjami potranslacyjnymi histonów (HPTM), mogą regulować te interakcje3,4. Niektóre z najlepiej scharakteryzowanych HPTM obejmują acetylację i metylację ogona histonów, które mogą zmienić powinowactwo oddziaływań elektrostatycznych między ogonami histonów a DNA, co skutkuje zróżnicowanym dostępem do leżącego u podstaw DNA i rekrutacją czynników transkrypcyjnych, które rozpoznają te HPTM w określonych miejscach. HPTM są regulowane przez trzy ważne klasy enzymów zwanych czytnikami - które rozpoznają, pisarzami - które osadzają i gumkami - które usuwają HPTM. Tak więc rekrutacja lub rozpuszczenie enzymów czytających, piszących lub wymazujących może ostatecznie zmienić krajobraz HPTM i zarządzać strukturą i funkcją chromatyny, sprawiając, że ich regulacja i odczyt są niezbędne do zrozumienia biologii i funkcji komórkowej3,4.
Komórki w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) są epigenetycznie elastyczne, ponieważ zmieniają swój transkryptom, aby dostosować się do bodźców środowiskowych. Coraz więcej dowodów sugeruje, że zmiany w epigenomie, takie jak metylacja DNA, niekodujące RNA i HPTM, odgrywają istotną rolę w tworzeniu pamięci i funkcji synaptycznej5. Zakłócenie dynamiki HPTM poprzez manipulowanie odpowiednimi czytnikami, pisarzami lub gumkami może blokować lub wzmacniać uczenie się asocjacyjne i długoterminowe wzmocnienie6,7,8. Mikroglej, rezydująca komórka immunologiczna OUN, szybko reguluje swój transkryptom w odpowiedzi na stymulację immunologiczną poprzez dynamiczne zmiany w swoim epigenomie9,10,11. Ten wysoki poziom adaptacji do lokalnego środowiska mózgu sprawia, że są one trudne do zbadania w odizolowanym kontekście, ponieważ badania wykazały, że epigenom i transkryptom mikrogleju ulega zmianie już po kilku godzinach w pożywce hodowlanej po usunięciu ze środowiska mózgu11. Ponadto, ponieważ mikroglej stanowi tylko 10% komórek mózgu, pomiary badające zmiany na poziomie całej tkanki nie są czułe i swoiste12,13. W rezultacie, mikroglej musi zostać szybko wyizolowany w celu zbadania zmian epigenetycznych, takich jak poziomy HPTM, ex vivo.
Metody powszechnie używane do badania HPTM obejmują sekwencjonowanie chromatyno-immunoprecypitacyjne (ChIP-seq) i rozszczepienie pod celami oraz sekwencjonowanie tagmentacji (CUT&Tag-seq)4. Chociaż techniki te są wysoce specyficzne dla poszczególnych HPTM i mogą informować o obecności HPTM w określonym kontekście genomicznym, mogą one badać tylko jeden z wielu możliwych HPTM w ramach jednego eksperymentu11,14 Dlatego przed przystąpieniem do takich eksperymentów, które wymagają znacznych inwestycji czasu i pieniędzy, bardzo cenne jest zawężenie listy potencjalnie interesujących HPTM do dalszego zbadania przez najpierw badając zmiany w globalnych poziomach HPTM. Dwa główne podejścia do badania globalnych poziomów HPTM to immunohistochemia i analiza western blot, ale oba podejścia są tylko częściowo ilościowe, niskoprzepustowe i wymagają dużej liczby skrawków tkanek lub izolowanych komórek15,16. W związku z tym naszym celem było opracowanie wysoce czułej, ilościowej metody, którą można by wykorzystać do szybkiego zbadania globalnych poziomów HPTM na poziomie pojedynczej komórki.
Przedstawiony protokół umożliwia szybkie wykrywanie globalnych poziomów HPTM za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej. Wcześniejsze badania na komórkach nowotworowych uzasadniały znaczenie badania globalnych poziomów z perspektywy klinicznej17,18. Często zdarza się również, że w badaniach wykorzystuje się poziomy globalne jako metodę przesiewową przed oceną lokalizacji genomowej określonych HPTM będących przedmiotem zainteresowania19,20. W przypadku mikrogleju ocena globalnych poziomów po izolacji jest trudna ze względu na niską wydajność komórek; Pan i inni prezentują globalne poziomy HPTM z izolowanego mikrogleju, w którym mikroglej od trzech zwierząt został połączony, aby umożliwić wykrycie poziomu białka za pomocą western blot19. Korzystając z naszego protokołu, jesteśmy w stanie wykryć globalne zmiany przy znacznie mniejszej liczbie danych wejściowych komórek, umożliwiając badanie przesiewowe wielu znaczników na zwierzę i eliminując potrzebę łączenia próbek.
Tutaj opisujemy protokół szybkiego wykrywania poziomów HPTM za pomocą ilościowej wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju. Chociaż skupiamy się w szczególności na kwantyfikacji HPTM ze względu na zwięzłość, protokół ten może być używany w ten sam sposób do ilościowego określania globalnych poziomów enzymów czytających, piszących i gumujących. Protokół składa się z dwóch części: po pierwsze, metody izolacji mikrogleju, a po drugie, metody opartej na cytometrii przepływowej do określania poziomów HPTM. Metoda izolacji pozwala uzyskać komórki, które można wykorzystać zarówno do izolacji RNA, jak i oceny poziomu HPTM, co pozwala na ocenę ekspresji genów i poziomów HPTM z tej samej próbki. Ponadto metoda oceny HPTM może być stosowana na innych typach komórek, jak wskazano w protokole.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe Falcon, polipropylen, sterylne&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe przezroczyste, nieobrobione płytki</td><td>Costar</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Clear Polistyren Microplate, przezroczyste okrągłe dno, nieobrobiona powierzchnia</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>Acetylohiston 3 K9 (C5B11)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9649S</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Acetyl Histone H4 K8 (2594)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2594S</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Acetylo-histon H3 K27 (D5E4)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>8173S</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Acetylo-histon H3 Lys27 (MA523516)</td><td>Invitrogen</td><td>MA523516</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Aktynomycyna D</td><td>New England Biolabs</td><td>15021S</td><td></td></tr><tr><td>Anisomycyna</td><td>New England Biolabs</td><td>2222S</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Histone H3 (tri metylo K4)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab213224</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-laktylo-histonowe H4 (Lys 12) mAb królika</td><td>PTM Biolabs</td><td>PTM-1411RM</td><td>Rozcieńczenie: 1:250</td></tr><tr><td>Anty-L-Laktylolizyna PAb</td><td>królika PRM Biolabs</td><td>PTM-1401RM</td><td>Rozcieńczenie: 1:250</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-P2RY12 Apc, klon: S16007D</td><td>BioLegend</td><td>848006</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Tocris</td><td>5217</td><td></td></tr><tr><td>Cyto-Last Buffer</td><td>BioLegend</td><td>422501</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek, sterylny</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>12611S</td><td></td></tr><tr><td>DNAza I</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>Osioł Anty Mysz AlexaFluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-546-150</td><td>Rozcieńczenie: 1:500</td></tr><tr><td>Osioł Anty Królik AlexaFluor488</td><td>ABklonalny</td><td>AS035</td><td>Rozcieńczenie: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Rozcieńczenie: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>406410</td><td>Rozcieńczenie: 1:500</td></tr><tr><td>Fisherbrand Jednorazowe pipety z podziałką</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Jednorazowy filtr PES, 250mL&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne H3K18ac</td><td>Invitrogen</td><td>720095</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>HBSS (10X), bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>KONTES Młynki do tkanek Dounce 125mm 7mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Lactyl-Histone H3 (Lys 18) MAb królika</td><td>PTM BIolabs</td><td>PTM-1406RM</td><td>Rozcieńczenie: 1:250</td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5418</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki kompensacyjne OneComp eBeads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw PDS, fiolka z papainą - Worthington Biochemical</td><td>Cedarlane</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>VWR</td><td></td><td></td>RC57004</tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>Tęczowe cząstki fluorescencyjne, 1 pik (3,0-3,4 uM -</td><td></td> Probówki do mikrofug bez RNaz <td>BioLegend</td> 422905 <td></td></tr> o średniej intensywności, <tr><td>1,5 ml</td><td>Invitrogen</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem i nakrętkami, 5 ml</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triptolide</td><td>New England Biolabs</td><td>97539</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw prawdziwych jądrowych czynników transkrypcyjnych</td><td>BioLegend</td><td>424401</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX PLUS (anty-mysie CD16/32)</td><td>BioLegend</td><td>156604</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do naprawy Zombie Aqua BioLegend</td><td></td><td>423102</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Kontrola ekspresji genów następuje częściowo poprzez modyfikacje struktury chromatyny, w tym dodawanie i usuwanie modyfikacji potranslacyjnych ogonów histonowych. Modyfikacje potranslacyjne histonów (HPTM) mogą ułatwiać ekspresję genów lub ich represję. Na przykład acetylacja reszt lizyny ogona histonowego neutralizuje ładunek dodatni i zmniejsza interakcje między ogonem a ujemnie naładowanym DNA. Zmniejszenie interakcji ogon-DNA histonu powoduje zwiększoną dostępność leżącego u podstaw DNA, co pozwala na zwiększony dostęp do czynnika transkrypcyjnego. Znacznik acetylacji służy również jako miejsce rozpoznawania aktywatorów transkrypcji zawierających bromodomenę, co razem skutkuje zwiększoną ekspresją genów. Znaczniki histonów mogą być dynamicznie regulowane podczas różnicowania komórek oraz w odpowiedzi na różne środowiska i bodźce komórkowe. Podczas gdy podejścia sekwencjonowania nowej generacji zaczęły charakteryzować lokalizacje genomowe dla poszczególnych modyfikacji histonów, tylko jedna modyfikacja może być badana jednocześnie. Biorąc pod uwagę, że istnieją setki różnych HPTM, opracowaliśmy wysokoprzepustową, ilościową miarę globalnych HPTM, którą można wykorzystać do badań przesiewowych modyfikacji histonów przed przeprowadzeniem bardziej rozległych podejść do sekwencjonowania genomu. Protokół ten opisuje metodę opartą na cytometrii przepływowej do wykrywania globalnych HPTM i może być przeprowadzana przy użyciu komórek w hodowli lub izolowanych komórek z tkanek in vivo. Przedstawiamy przykładowe dane z izolowanego mikrogleju mózgu myszy, aby zademonstrować czułość testu w wykrywaniu globalnych zmian w HPTM w odpowiedzi na bodziec immunologiczny pochodzenia bakteryjnego (lipopolisacharyd). Protokół ten pozwala na szybką i ilościową ocenę HPTM i może być stosowany do dowolnego regulatora transkrypcyjnego lub epigenetycznego, który może być wykryty przez przeciwciało.

U dorosłych myszy przeprowadzono perfuzję przezsercową, a następnie uśmiercono zwierzęta w celu izolacji mikrogleju. Mikroglej izolowano w temperaturze 0°C i barwiono przeciwciałami P2RY12-APC oraz barwnikiem żywotności violet 525. Komórki wykazujące pozytywny wynik dla P2RY12 i negatywny dla barwnika żywotności violet 525 sortowano jako żywe komórki mikrogleju. Średnia wydajność izolacji mikrogleju z wypreparowanego mózgu myszy wyniosła 1,28 x 105 ± 0,05 (średnia ± błąd standardowy średniej (SEM), N=100). Nie stwierdzono różnic w wydajności izolacji mikrogleju u myszy samic (1,25 x 105 ± 0,09 [średnia ± SEM, N=46]) i samców (1,32 x 105 ± 0,07 [średnia ± SEM, N=54]) (t(98)=0,6365, p=0,526). W przypadku izolacji z konkretnych obszarów mózgu, średnia wydajność mikrogleju z kory mózgu myszy wynosiła 8,3 x 104 ±&#160; 0,08 (średnia ± SEM, N=15), a z hipokampa myszy 4,1 x 104 ± 0,02 (średnia ± SEM, N=16). Zgodnie z oczekiwaniami, odnotowano istotną różnicę w wydajności izolacji mikrogleju z poszczególnych regionów mózgu (F(2, 128)=25,25, P&#60;0,0001). Po izolacji mikrogleju z wydzielonych komórek wyekstrahowano RNA przy użyciu zestawu do izolacji RNA z niewielkiej ilości materiału wejściowego. Wskaźnik integralności RNA (RIN) był konsekwentnie powyżej 9,0 (9,62&#160;± 0,05), a średnia wydajność RNA na komórkę wyniosła 0,25 ± 0,01 pg (średnia ± SEM, N=32; Supplementary File S2).
Dorosłe myszy otrzymały dożylnie wewnątrzbrzusznymi 1 mg/kg lipopolisacharydu (LPS) na 24 h przed ubojem. Myszy poddano perfuzji transkardialnej za pomocą HBSS, a mikroglej wyizolowano z całego mózgu zgodnie z opisanym protokołem (Rysunek 5A). Do każdego panelu przeciwciał przeznaczono od 20 000 do 30 000 komórek na każde barwienie. Globalne poziomy acetylacji lizyny 27 histony 3 (H3K27Ac) w wyizolowanym mikrogleju oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. U myszy samców i samic traktowanie LPS indukowało wzrost H3K27Ac po normalizacji MFI w obrębie płci (t(6)=9,676, p&#60;0,0001; Rysunek 5B). Analiza histogramów dla zabarwionych komórek wykazała, że populacje pozostają rozłożone normalnie przy podobnej wariancji; jednak komórki przesunęły się w stronę zwiększonej fluorescencji, co skutkuje wzrostem MFI (Rysunek 5C). Analiza H3K9Ac przy tym samym traktowaniu wykazała podobny wzrost H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Rysunek 5D,E), jednak krotność zmiany sygnału H3K9Ac dla LPS w stosunku do PBS jest mniejsza niż w przypadku sygnału H3K27Ac.
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Globalne zmiany acetylacji histonów w izolowanej mikroglei. (A) Myszy otrzymały dożylnie wstrzyknięty roztwór soli fosforanowej (PBS) lub 1 mg/kg lipopolisacharydu (LPS) na 24 h przed ubojem. Mikrogleję pobrano z frakcji wzbogaconej w komórki odpornościowe i utrwalono do analizy cytometrią przepływową oraz oceny globalnych potranslacyjnych modyfikacji histonów. Mediana intensywności fluorescencji została oceniona jako wskaźnik ekspresji białka. Stworzono za pomocą BioRender.com. (B) Globalne poziomy H3K27Ac wzrosły w odpowiedzi na traktowanie LPS. Krotność zmiany względem PBS znormalizowana w ramach eksperymentu i płci. Nieparzysty dwustronny test t, t(6)=9,676, p&#60;0,0001. Wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM. N=8 zwierząt; po 2 na warunki w 2 niezależnych eksperymentach. (C) Przykładowe histogramy przedstawiające przesunięcie intensywności fluorescencji H3K27Ac. Panel przedstawia histogramy z myszy wstrzykniętych PBS w porównaniu z myszami wstrzykniętymi LPS. (D) Przykładowe histogramy przedstawiające przesunięcie intensywności fluorescencji H3K9Ac. Panel przedstawia histogramy z myszy wstrzykniętych PBS w porównaniu z myszami wstrzykniętymi LPS. (E) Globalne poziomy H3K9Ac wzrosły w odpowiedzi na traktowanie LPS. Krotność zmiany względem PBS znormalizowana w ramach eksperymentu i płci. Nieparzysty dwustronny test t, t(6)=7,299, p=0,0003. Wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM. N=8 zwierząt; po 2 na warunki w 2 niezależnych eksperymentach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Aby potwierdzić, że opisana metoda była porównywalna z innymi stosowanymi wcześniej metodami ilościowego oznaczania globalnych modyfikacji histonów, postanowiliśmy wykorzystać immunoblotting jako narzędzie porównawcze. Jednakże wydajność uzyskiwana z izolowanej mikroglei jest zbyt niska, aby umożliwić rzetelną ocenę. Dlatego w celu porównania metody cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej z metodą Western blot (WB) wykorzystaliśmy hodowlę komórek BV2. Komórki BV2 hodowano w pożywce kompletnej (DMEMF12, 10% FBS, 1x penicylina/streptomycyna oraz 1x L-glutamina) w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Komórki pasażowano przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA i wysiewano w gęstości 250 000 komórek/dołek, a następnie inkubowano w pożywce z obniżoną zawartością surowicy (DMEM F12, 2% FBS, 1x penicylina/streptomycyna oraz 1x L-glutamina), pozwalając im na regenerację przez 12 h w 37 °C i 5% CO2. Przed utrwaleniem (opisanym powyżej) lub lizą w buforze do lizy WB, komórki traktowano 25 ng/mL LPS przez 24 h. Sygnał H3K27Ac oznaczano obiema metodami, przyjmując GAPDH jako kontrolę ładowania dla WB. Dla każdej grupy wyznaczono analizę znormalizowanej intensywności fluorescencji w porównaniu z kontrolą PBS (Rycina 6A). Badając zmianę znormalizowanego sygnału H3K27Ac za pomocą WB, odnotowano 1,527-krotny wzrost w warunkach traktowania LPS w stosunku do kontroli H2O, co uznano za istotne statystycznie w nieparzystym teście t (t=3,024, df=5; p=0,0293). W analizie z wykorzystaniem cytometrii przepływowej odnotowano 1,482-krotny wzrost w warunkach traktowania LPS, co również uznano za istotne (t=7,843, df=10; p&#60;0,0001). Stosując dwuczynnikową analizę wariancji (2-way ANOVA) do porównania metod, stwierdzono istotny wpływ traktowania (F(1,15)=45,21, p&#60;0,0001), ale brak istotnego wpływu metody (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) lub interakcji (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Ponadto weryfikujemy tutaj, że nie zachodzi zmiana poziomu histonu H3 zarówno w metodzie Western blot, jak i cytometrii przepływowej, ponieważ 2-way ANOVA nie wykazała istotnego wpływu traktowania LPS (F(1,7)=0,02170, p=0,8870), metody (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) ani interakcji (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Rycina 6B). Przedstawiono również przykładowe bloty oraz przesunięcia histogramów dla tych danych (Rycina 6C,D).
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Porównanie metod ilościowego oznaczania zmian globalnych modyfikacji histonów za pomocą cytometrii przepływowej i western blotu. (A) Komórki BV2 poddano działaniu 25 ng/mL lipopolisacharydu (LPS) lub H2O przez 24 h przed analizą. Intensywność fluorescencji H3K27Ac przedstawiono jako krotność zmiany względem kontroli nośnika, soli fizjologicznej (PBS), zarówno dla cytometrii przepływowej, jak i western blotu. Dwuczynnikowa analiza wariancji (2-way ANOVA) wykazała istotny wpływ traktowania LPS (F(1,15)=45.21, p&#60;0.0001), ale nie metody (F(1,15)=0.05545, p=0.8697) ani interakcji (F(1,15)=0.02785, p=0.8697). Dla reszt zastosowano korektę Tukeya dla wielokrotnego testowania hipotez. * oznacza 0.0332, ** oznacza 0.0021. (B) Intensywność fluorescencji dla histonu H3&#160;przedstawiono jako krotność zmiany względem PBS zarówno dla cytometrii przepływowej, jak i western blotu. Dwuczynnikowa analiza wariancji (2-way ANOVA) nie wykazała istotnego wpływu traktowania LPS (F(1,7)=0.02170, p=0.8870), metody (F(1,7)=0.01191, p=0.9162) ani interakcji (F(1,7=0.01191, p=0.9162). (C) Przedstawiono przykładowe bloty oraz (D) przesunięcia w cytometrii przepływowej. Wielkość histogramu została znormalizowana do wartości procentowej w oparciu o liczbę komórek obecnych przy modalnej intensywności fluorescencji. Wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM. n=2 niezależne eksperymenty, po 2 na warunek w każdym eksperymencie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Podsumowując, wyniki te pokazują, że technikę tę można wykorzystać do ilościowej oceny globalnych poziomów HPTM w izolowanej mikroglei. Dodatkowo wykazano, że metoda ta jest porównywalna z poprzednimi technikami, lecz wymaga znacznie mniejszej liczby komórek. Ponadto, choć nie zostało to przedstawione, przy zastosowaniu odpowiedniej kompensacji, obecna technika może być używana z wieloma przeciwciałami w jednym panelu do oceny różnych HPTM.
Plik uzupełniający S1: Przykładowe pliki analizy. Plik ten zawiera plik analizy wsp oraz 7 plików fcs, w tym próbkę bez barwienia, P2RY12FMO, 568FMO, próbki od dwóch zwierząt traktowanych PBS oraz dwóch zwierząt traktowanych LPS, zabarwionych przeciwciałem H3K27Ac. Celem tego pliku jest zademonstrowanie analizy i procesu bramkowania na przykładzie eksperymentu, który obrazuje prawidłowy przebieg badania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający S2: Dane dotyczące izolacji. Dołączony plik zawiera odpowiednie dane po sortowaniu mikrogleju, obejmujące liczbę komórek mikrogleju oraz wydajność RNA uzyskaną zgodnie z opisanym protokołem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>POPULACJA WYBRANA (GATED)&#160;</td>
			<td>Częstotliwość rodzicielska</td>
			<td>Częstość całkowita</td>
			<td>Liczba</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S2&#62;S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC+ &#62; S2 &#62; S1&#160;</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>610+ &#62; APC+ &#62; S2 &#62; S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przykładowy schemat pochodzenia próbek przedstawia procent oraz liczbę zdarzeń wymaganych do dokładnej detekcji białek.

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Nasze badania mają na celu zrozumienie podstawowych mechanizmów regulacyjnych kontrolujących ekspresję genów w mózgu. Jesteśmy szczególnie zainteresowani zrozumieniem, w jaki sposób zakłócenie tych mechanizmów przyczynia się do zaburzeń neurorozwojowych i neuropsychiatrycznych. Koncentrujemy się na zrozumieniu, w jaki sposób genetyczne i środowiskowe czynniki ryzyka łączą się, aby zmienić funkcję komórkową i powodować zaburzenia zachowania.Protokół ten obejmuje metody wysokoprzepustowych badań przesiewowych modyfikacji histonów w izolowanym mikrogleju, co pozwala nam na przesiewanie dziesiątek różnych modyfikacji epigenetycznych przed podjęciem decyzji o wysokiej przepustowości sekwencjonowaniu i funkcjonalnych badaniach uzupełniających. Nasz protokół zapewnia pomiary globalnych modyfikacji histonów, podobnie jak w przypadku western blot. Jednak nasza technika jest zarówno szybsza, wymaga mniejszej liczby komórek wejściowych, jak i jest bardziej ilościowa i może być multipleksowana.Zacznij od umieszczenia izolowanej tkanki mózgowej myszy i jednego mililitra buforu trawiennego na mózg na oddzielnych szalkach Petriego na lodzie. Dokładnie posiekaj tkanki mózgowe na małe kawałki za pomocą czystego ostrza skalpela. Używając plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką, ostrożnie przenieś rozdrobnione mózgi do pojedynczych dołków wewnątrz 24-dołkowej płytki na lodzie.Przykryj płytkę dużym kawałkiem przezroczystej, elastycznej folii, zamknij pokrywkę i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Następnie przenieś strawiony roztwór mózgowy do pojedynczych homogenizatorów z siedmiomililitrowego szkła mrożonego Odbijaj się na lodzie zawierającym pięć mililitrów zimnego buforu FACS. Delikatnie zanurz każdy mózg luźnym tłuczkiem, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.Delikatnie zanurz ciasnym tłuczkiem trzy do czterech razy, aby zapewnić zawieszenie pojedynczej komórki przed przeniesieniem do 15-mililitrowych tubek polipropylenowych. Zacznij od dodania 2,125 mililitra izotonicznego gradientu gęstości do 15-mililitrowej rurki polipropylenowej zawierającej mysi homogenat mózgu. Uzupełnij każdą probówkę buforem FACS do końcowej objętości 8,5 mililitra.Delikatnie odwróć probówki 20 razy, aby dokładnie wymieszać. Używając wąskiej pipety do przenoszenia z podziałką, delikatnie ułóż cztery mililitry różowego gradientu o gęstości 37%, tworząc dwie czyste warstwy. Zamień pipety transferowe i ułóż dwa mililitry niebieskiego gradientu o gęstości 70% poniżej warstwy 37%.Przenieś probówki do wirówki schłodzonej do czterech stopni Celsjusza i wiruj je w temperaturze 500G przez 20 minut z rampą hamującą ustawioną na najniższe ustawienie. Po odwirowaniu wyrzuć mielinę z górnej części 15-mililitrowej probówki za pomocą czystej pipety transferowej. Ostrożnie zebrać górny fragment gradientu gęstości do czystej 15-mililitrowej probówki polipropylenowej za pomocą innej pipety transferowej.Następnie zbierz wszystkie komórki w próbce, powoli okrążając pipetę wzdłuż boków probówki, jednocześnie zbierając fragment wzbogacony w układ odpornościowy. Przenieś fragment wzbogacony w układ odpornościowy do nowej 15-mililitrowej rurki polipropylenowej. Umyj próbkę, dodając 10 mililitrów FACS do probówki.Delikatnie odwróć probówkę 20 razy, aby dokładnie wymieszać. Zakręć probówkami w schłodzonej wirówce z rampą hamowania ustawioną na najniższe ustawienie, aby zagnieździć izolowane komórki odpornościowe. Przenieś wzbogaconą w mózg myszy pastylkę immunologiczną z 15-mililitrowej probówki na okrągłą płytkę 96-dołkową.Po odwirowaniu płytki o sile 500 G przez pięć minut, usunąć supernatant przez strzepnięcie. Ponownie zawiesić ogniwa w 100 mikrolitrach buforu FACS. Następnie przenieś 10 mikrolitrów z każdej studzienki do studzienek kontrolnych.Wirować przy 500G przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu z odwirowanych komórek dodać 50 mikrolitrów bloku FC o podwójnym stężeniu. Inkubować przez 10 minut na lodzie.Teraz dodaj 50 mikrolitrów głównej mieszanki przeciwciał o podwójnym końcowym pożądanym stężeniu i inkubuj ją na lodzie w ciemności. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu FACS do każdej studzienki i odwiruj w temperaturze 500G przez pięć minut. Odrzucić supernatant przez strzepnięcie.Następnie umyj komórki w 300 mikrolitrach buforu FACS. Odwirować w ponownym zawieszeniu komórek w 200 mikrolitrach buforu FACS. Na koniec przenieść zawiesinę do probówki do sortowania przepływowego zawierającej 300 mikrolitrów buforu FACS.Aby przeanalizować panel przeciwciał, upewnij się, że cytometr ma co najmniej cztery lasery, w tym czerwony, żółty, niebieski i fioletowy. Ustal matrycę kompensacji za pomocą koralików kompensacyjnych lub kontroli z pojedynczą komórką barwiącą. Aby skalibrować i ustandaryzować, uruchom tęczowe koraliki fluorescencyjne na początku każdego eksperymentu, dostosowując napięcie lampy fotopowielacza, aż szczyty koralików zrównają się z wartościami docelowymi z poprzednich eksperymentów.Ustaw napięcie lampy fotopowielacza i wzmocnienie dla eksperymentu. Następnie użyj kulek kompensacyjnych wychwyconych przez przeciwciała, aby ustalić matrycę kompensacyjną. Następnie wykreśl boczny obszar punktowy na kłodydze w funkcji wysokości rozproszenia do przodu na wykresie liniowym na wykresie kropkowym.Usuń zanieczyszczenia i wybierz rozmiar komórki za pomocą bramki S1. Wybierz komórki singlet na wykresie kropkowym o szerokości rozproszenia do przodu w porównaniu z wysokością rozproszenia do przodu z bramką S2. Do ustanowienia bramek fluoroforowych należy użyć odpowiedniego FMO dla każdego kanału fluoroforowego.Za pomocą histogramów pojedynczych parametrów określ sygnał dodatni w każdym kanale i odpowiednio ustal bramki. Starannie zapisz próbki przy użyciu ustalonej strategii bramkowania. Zidentyfikuj mikroglej za pomocą sygnału P2 RY 12 plus i określ ekspresję białka w odpowiednim kanale tylko dla mikrogleju.Ustanów bramki analityczne w interfejsie użytkownika oprogramowania do analizy cytometru, replikując tę samą strategię bramkowania, która jest używana podczas nagrywania. Użyj funkcji dodawania statystyk, aby wybrać medianę dla populacji będącej przedmiotem zainteresowania na wysokości kanału z kompensacją. Eksportuj wartości MIF dla odpowiednich kanałów do arkusza kalkulacyjnego za pomocą edytora tabel w celu dalszej analizy statystycznej.Leczenie lipopolisacharydami indukowało wzrost acetylacji histonu H3 lizyny 27, gdy MFI jest normalizowane w zestawach. Analiza histogramu barwionych komórek wykazała normalnie rozmieszczone populacje z przesunięciami komórek w kierunku zwiększonej fluorescencji. Podobny wzrost acetylacji histonu H3 lizyny 27 zaobserwowano w barwionych komórkach.

quantification-global-histone-post-translational-modifications-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten protokół opisuje metodę hodowli pierwotnych neuronów hipokampa z embrionalnego mózgu myszy. Ekspresja głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na zewnątrzkomórkowej powierzchni hodowanych neuronów jest następnie oceniana za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Ocena ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na pierwotnych mysich neuronach hipokampa za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem umożliwiającym izolację i badanie specyficznych populacji komórek. Niniejszy protokół opisuje etapy izolacji komórek wykazujących ekspresję LacZ z tkanek ślimaka noworodków myszy transgenicznych. Przed rozdzieleniem metodą cytometrii przepływowej, zdysocjowane komórki ślimaka zostały znakowane przy użyciu substratów β-galaktozydazy sprzężonych z fluorochromami.

Izolacja komórek wykazujących ekspresję LacZ z tkanek ucha wewnętrznego myszy z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Opisujemy protokół pozwalający na oczyszczenie przedziału naczyniowego mózgu myszy. Izolowane naczynia mózgowe obejmują komórki śródbłonka połączone ścisłymi połączeniami i otoczone ciągłą blaszką podstawną, perycyty, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, a także okołonaczyniowe błony astroglejowe.

Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Analiza ilościowa zawartości komórek w mysim nerwie kulszowym jest trudna ze względu na niedostatek tkanki. Protokół ten opisuje metodę trawienia i przygotowania tkanek, która zapewnia wystarczającą ilość komórek do analizy cytometrii przepływowej populacji komórek odpornościowych z nerwów poszczególnych myszy.

Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy przy użyciu cytometrii przepływowej

Przedstawiamy protokół izolowania neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Po wyizolowaniu RNA jest ekstrahowane z tych komórek w celu analizy ich profilu ekspresji genów. Protokół ten pozwala na zbieranie wysokiej jakości RNA do przeprowadzania dalszych analiz, takich jak qPCR i transkryptomika.

Izolacja i ekstrakcja RNA neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego, systematycznego przewodnika po skutecznym oczyszczaniu histonów H3 i H4 oraz kwantyfikacji reszt acetylowanych histonów.

Oczyszczanie białek histonów H3 i H4 oraz oznaczanie ilościowe acetylowanych śladów histonów w komórkach i tkance mózgowej

Poznaj metodę kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów w mikrogleju mózgu myszy za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybkie, ilościowe badanie zmian epigenetycznych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów