Name: Generowanie myszy z nokautem specyficznych dla brązowego tłuszczu przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i jednoprzewodnikowego systemu RNA wirusa związanego z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 58 s
Description: Poznaj metodę generowania myszy z nokautem brązowego tłuszczu przy użyciu systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i wirusa AAV. Technika ta umożliwia szybkie tworzenie modelów tkankowo-specyficznych bez konieczności selektywnego rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty amerykańskich National Institutes of Health (NIH) R01DK122808, R01DK102898 i R01DK132469 (dla Y.-H.T.), a także P30DK036836 (dla Centrum Badań nad Cukrzycą w Joslin Diabetes Center). T. T. był wspierany przez SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japonia) oraz grant American Heart Association 903968 Y. Z. był wspierany przez Charles A. King Trust Fellowship. Dziękujemy Seanowi D. Kodaniemu za uprzejmą korektę manuskryptu.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach i procedury opieki zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Joslin Diabetes Center.
1. Badania przesiewowe skutecznych sgRNA w hodowanych komórkach
UWAGA: Aby test był opłacalny, przed zapakowaniem sgRNA w cząsteczki AAV, zalecamy przetestowanie różnych sgRNA w hodowanych komórkach za pomocą systemu opartego na lentiwirusie pod kątem ekspresji Cas9/sgRNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) i wybranie sgRNA, które dają najwyższą skuteczność knockdown dla eksperymentów in vivo.
<ol>
	<li>Konstrukcja sgRNA CRISPR-Cas9
	<ol>
		<li>Projektuj sgRNA za pomocą narzędzi online, takich jak narzędzie do projektowania Broad sgRNA (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, narzędzie online CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)22 i inne dostępne narzędzia.</li>
		<li>Wprowadź nazwy genów lub docelowe sekwencje DNA w polu nazwy genu i wybierz NGG jako motyw sąsiadujący z protospacerem (PAM) dla SpCas9, aby wygenerować potencjalne sekwencje sgRNA.</li>
		<li>Wybierz sgRNA o wysokiej przewidywanej skuteczności w miejscu docelowym i niskiej aktywności poza celem. Na przykład zaleca się stosowanie sgRNA o wyniku swoistości co najmniej 50 na wyjściu CRISPOR. Spośród konkretnych sgRNA, które przechodzą filtr, wybierz te z wysokimi wynikami wydajności23. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wybiera się trzy lub cztery sgRNA, aby zapewnić identyfikację skutecznych sgRNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa plazmidu sgRNA CRISPR-Cas9
	<ol>
		<li>Zsyntetyzuj pary oligonów sgRNA kodujące 20 sekwencji docelowych nukleotydów (nt) z nawisami (zarówno 5', jak i 3') z miejsca restrykcji BsmBI (Tabela 1) za pomocą platformy syntezy DNA.</li>
		<li>Ligaty wyżarzone pary oligonów za pomocą linearyzowanego wektora BsmBI lentiCRISPR v2.</li>
		<li>Przekształć produkt ligacji w szczep Stbl3 E. coli i potwierdź insercję sgRNA przez sekwencjonowanie DNA Sangera przy użyciu startera U6 do przodu. 
		UWAGA: Zobacz szczegółową procedurę klonowania w protokole Addgene zatytułowanym LentiCRISPRv2 i lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie cząstek lentiwirusowych
	<ol>
		<li>Około 24 godziny przed transfekcją rozmieścić 7 x 105 komórek HEK-293 w 4 ml kompletnej pożywki wzrostowej na 6 cm płytce do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Dodać 15 μl odczynnika do transfekcji LT1 do 250 μl pożywki bez surowicy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Przygotować koktajl transfekcyjny dla każdego sgRNA zgodnie z tabelą 2 w 250 μl pożywki wolnej od surowicy. Zmieszać odczynnik do transfekcji przygotowany w kroku 1.3.2 z koktajlem plazmidowym i inkubować przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp całą pożywkę wzrostową 3,5 ml świeżej pożywki wzrostowej dla komórek HEK-293, a następnie dodaj kroplami mieszaninę odczynników do transfekcji DNA do komórek HEK-293 hodowanych w 3,5 ml świeżej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Po 12-15 godzinach transfekcji zmień pożywkę, aby usunąć odczynnik do transfekcji i zastąp ją 4 ml świeżej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Po 24 godzinach inkubacji zebrać pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą cząstki lentiwirusa i przefiltrować pożywkę przez filtr 0,45 μm w celu usunięcia wszelkich komórek HEK-293. Wirusy mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka dni. W przypadku długotrwałego przechowywania wirusy należy zamrozić w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego podczas przygotowywania cząstek lentiwirusa i pracuj w środowisku (np. BL2+) odpowiednim do obchodzenia się z lentiwirusem. Zobacz szczegółową procedurę przygotowania lentiwirusa w protokole Addgene zatytułowanym pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie brązowych preadipocytów i oznaczanie knockdownu za pośrednictwem sgRNA
	<ol>
		<li>Płytka 1 x 106 unieśmiertelnionych brązowych preadipocytów myszy w 1 ml świeżej pożywki zawierającej 8 μg/ml polibrenu na studzienkę na płytce 6-dołkowej. 
		UWAGA: W tym badaniu unieśmiertelnione brązowe preadipocyty zostały wygenerowane przy użyciu antygenu T SV40 25. Brązowe preadipocyty są hodowane w DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu cząstek lentiwirusa z kroku 1.3, aby zainfekować komórki. Utrzymuj równolegle jedną niezainfekowaną studzienkę komórek, aby służyła jako kontrola selekcji antybiotyków.</li>
		<li>Zmienić na świeże podłoże 24 godziny po zakażeniu. Dodać odpowiednie antybiotyki (np. puromycynę o końcowym stężeniu 1 μg/ml) do pożywki, aby zabić niezakażone komórki i wybrać te zakażone. Zmieniaj pożywkę na świeżą zawierającą wybrany antybiotyk co drugi dzień, aż wszystkie niezakażone komórki kontrolne umrą.</li>
		<li>Zbierz białko z komórek zakażonych wirusem i określ skuteczność knockdown sgRNA za pomocą analizy western blot. Postępuj zgodnie ze szczegółową procedurą western blotting w Eslami i Lujan26. Ze względu na różną szybkość obrotu między białkami, należy przetestować wiele punktów czasowych (np. od 6 do 12 dnia po zakażeniu wirusem), aby zaobserwować utratę sygnału białkowego. 
		UWAGA: Jeśli przeciwciało, które rozpoznaje białko kodowane przez gen będący przedmiotem zainteresowania, nie jest dostępne, sekwencjonowanie Sangera można alternatywnie wykorzystać do określenia wydajności edycji genomu każdego sgRNA. Krótko mówiąc, amplifikuj genomowe DNA za pomocą starterów flankujących region ukierunkowany na sgRNA, aby wygenerować amplikony PCR o długości ~ 700 pz. Prognozowane miejsce przerwy powinno znajdować się ~200 pz poniżej miejsca rozpoczęcia sekwencjonowania. Następnie poddaj produkt PCR sekwencjonowaniu Sangera. Przeanalizuj wyniki sekwencjonowania za pomocą narzędzi online, takich jak Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE), aby określić częstotliwość małych indeli generowanych przez każde sgRNA w puli komórek27.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Budowa plazmidu AAV-sgRNA
UWAGA: W tym kroku skuteczne sgRNA zidentyfikowane na powyższym ekranie są klonowane do wektora pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP vector28 (Rysunek 2). W międzyczasie sgRNA nieukierunkowane (np. TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29), które nie rozpoznaje żadnej sekwencji w genomie myszy, jest również klonowane do tego samego wektora, aby służyć jako nieedytowana kontrola.
<ol>
	<li>Linearyzuj szkielet pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP za pomocą BbsI, który generuje identyczne zwisy ze zsyntetyzowanymi oligonukleotydami sgRNA.</li>
	<li>Zwiąż wyżarzane pary oligonugoligatów ze zlinearyzowanym wektorem pAAV i potwierdź insercji sgRNA zgodnie z opisem w kroku 1.2. 
	UWAGA: Procedura klonowania lentiCRISPRv2-sgRNA jest również stosowana do budowy plazmidu AAV-sgRNA.</li>
</ol>
3. Opakowanie AAV
<ol>
	<li>Wektory AAV wygenerowane w sekcji 2 należy spakować do serotypu 8 AAV. Przygotuj AAV o wysokim mianie zgodnie z poprzednim protokołem30 lub poproś o usługę pakowania AAV od rdzeni wirusowych lub usług komercyjnych. Rozcieńczyć miano wirusa do 1 x10 13 kopii genomu/ml. 
	UWAGA: Zmodyfikowany genom AAV2 wyrażający sgRNA jest upakowany w serotyp 8 AAV. Ten serotyp został wybrany ze względu na jego wysoką skuteczność w tkance tłuszczowej18,31. Aby zapobiec odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez zanieczyszczenia, takie jak szczątki komórek i niewielkie ilości składników pożywki, do wstrzykiwań in vivo wymagany jest ultra oczyszczony AAV. Ultra-oczyszczanie można osiągnąć za pomocą gradientów jodixanolu i ultrawirowania30.</li>
</ol>
4. Przygotowanie myszy Ucp1 Cre/Cas9
<ol>
	<li>Kup szczep myszy Ucp1-Cre (patrz Tabela materiałów), który wykazuje ekspresję rekombinazy Cre pod kontrolą promotora Ucp1. Kup homozygotyczne myszy knock-in STOP-Cas9 z floxingiem Rosa2632 (patrz Tabela materiałów), w których ekspresja Cas9 jest regulowana w sposób zależny od rekombinazy Cre.</li>
	<li>Skrzyżowanie tych szczepów w celu wygenerowania myszy Ucp1-Cre/Cas9, zgodnie z wcześniejszym opisem16,17. Trzymaj wszystkie myszy w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności (23 °C, 30% wilgotności) w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym (światła włączają się o 6:30; wyłączają się o 18:30) z bezpłatnym dostępem do diety i wody.</li>
	<li>Potraktuj powstałe myszy Ucp1-Cre / Cas9 AAV przenoszącymi kontrolne sgRNA lub sgRNA ukierunkowane na gen zainteresowania za pomocą metody opisanej poniżej. W tym badaniu wykorzystano 12-15 tygodniowe samce myszy Ucp1-Cre / Cas9 o wadze około 30 g.</li>
</ol>
5. Operacja wstrzyknięcia AAV do BAT u myszy
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy poprzez ciągłe wdychanie 2,5% izofluranu w celu indukcji i podtrzymania.</li>
	<li>Nasmaruj oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie podaj myszom leki przeciwbólowe (banamina, 2,5 mg/kg masy ciała [m.c.), wstrzyknięcie podskórne, patrz tabela materiałów) myszom, aby zminimalizować i zapobiec pooperacyjnemu bólowi i stresowi.</li>
	<li>Ogol futro myszy w obszarze międzyłopatkowym za pomocą golarki i wysterylizuj obszar chirurgiczny za pomocą co najmniej trzech naprzemiennych rund peelingu na bazie jodu lub chlorheksydyny, a następnie 70% etanolu. Następnie nałóż sterylne obłożenia chirurgiczne wokół miejsca nacięcia.</li>
	<li>Naciąć skórę między łopatkami za pomocą skalpela (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3A-B), a następnie oderwać ogoloną skórę, aby odsłonić tkankę tłuszczową na szyi za pomocą nożyczek chirurgicznych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C-D). Wielkość nacięcia zależy od wielkości ciała, ale generalnie nacięcie powinno wynosić około 2 cm, aby odsłonić tkankę tłuszczową w okolicy międzyłopatkowej.</li>
	<li>Przetnij tkankę tłuszczową na granicy między dystalnym obszarem tkanki tłuszczowej a mięśniami, wykonując pojedyncze nacięcie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3E-F). Wielkość nacięcia powinna wynosić około 1 cm, aby po prostu otworzyć wejście do włożenia nożyczek chirurgicznych do złuszczania tkanek tłuszczowych.</li>
	<li>Używając ręki dominującej, oderwij tkankę tłuszczową tępo i pionowo nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić BAT, jednocześnie ściskając tkanki tłuszczowe, w tym BAT, ręką niedominującą (<silna klasa="xfig">Rysunek 3G). Użyj żyły Sultzera jako punktu orientacyjnego, aby wskazać dokładną lokalizację BAT. 
	UWAGA: BAT w klasie <strong="xfig">Rysunek 3H został całkowicie naświetlony w celu demonstracji obrazu. Nadmierna preparacja może spowodować uszkodzenie nerwów otaczającego BAT. Nieprawidłowy kierunek nożyczek może uszkodzić otaczające mięśnie i żyłę Sultzera, odprowadzając BAT i może prowadzić do nadmiernego krwawienia.</li>
	<li>Dla każdej myszy wstrzyknąć powoli 40 μl AAV do obu płatów BAT (20 μl na jeden płat BAT) za pomocą ostrej igły (32 G, zob. tabela materiałów) połączonej ze strzykawką Hamiltona (100 μl, zob. tabela materiałów; <silna klasa="xfig">Rysunek 3I). Sprawdzić, czy wstrzyknięcie zostało wykonane, ponieważ podczas podawania AAV nie ma wycieków z miejsca wstrzyknięcia. 
	UWAGA: BAT w <silnej klasie="xfig">Rysunek 3I został całkowicie naświetlony w celu demonstracji obrazu. Objętość roztworu AAV, który ma być podany do płata BAT, zależy od wielkości BAT myszy biorcy. Ustaliliśmy, że 20 μl roztworu AAV jest odpowiednie dla jednego płata BAT o wadze około 0,05 g w zwykłej myszy C57BL6/J o wadze 30 g. W razie potrzeby może być konieczne stężenie roztworu wirusowego, aby osiągnąć pożądaną objętość.</li>
	<li>Upewnij się, że nie ma krwawienia z wstrzykniętego BAT lub otaczających tkanek. Przycisnąć gazę nasączoną roztworem nadtlenku wodoru (patrz Tabela materiałów) na miejsce krwawienia w celu hemostazy.</li>
	<li>Umieść odsłonięte tkanki tłuszczowe z powrotem w ich normalnej pozycji. Zszyj krawędź tkanki tłuszczowej i mięśni za pomocą wchłanialnej nici monofilamentowej 5-0 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3J). Zszyj otwartą skórę za pomocą niebarwionych nici plecionych vicryl pokrytych 5-0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3K-L). 
	UWAGA: Rysunek 4 opisuje etapy zszywania obranej tkanki tłuszczowej i mięśni.</li>
	<li>Po operacji należy utrzymać zwierzęta na poduszce grzewczej aż do całkowitego wyzdrowienia. Zapewnij zwierzętom dostęp do jedzenia, wody i dużej ilości ściółki do gniazdowania. Monitoruj je regularnie pod kątem jakichkolwiek oznak stresu lub choroby przez 7 dni rekonwalescencji przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Potwierdź skuteczność docelowej delecji genu za pomocą analizy western blot w BAT wypreparowanym na myszach, jak w Sugimoto et al.16.</li>
</ol>

<ol><li>Kopelman, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+medical+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Obesity as a medical problem.</a> Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).</li>
<li>Finkelstein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+severe+obesity+forecasts+through+2030%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Preventive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Obesity and severe obesity forecasts through 2030.</a> American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).</li>
<li>Craft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+Alzheimer%27s+disease+pathogenesis%3A+Potential+mechanisms+and+implications+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment.</a> Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).</li>
<li>Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+as+a+secretory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue as a secretory organ.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).</li>
<li>Scheele, C., Wolfrum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+crosstalk+in+tissue+plasticity+and+human+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism.</a> Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).</li>
<li>Becher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+is+associated+with+cardiometabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health.</a> Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).</li>
<li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+and+beige+fat%3A+Physiological+roles+beyond+heat+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li>
<li>Scheja, L., Heeren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+function+of+adipose+tissues+in+health+and+cardiometabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).</li>
<li>Darcy, J., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ComBATing+aging-does+increased+brown+adipose+tissue+activity+confer+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Geroscience%22%5BJournal%5D)">ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity.</a> Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).</li>
<li>da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+peripheral+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mouse models of peripheral metabolic disease.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).</li>
<li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Cre-LoxP+system%3A+General+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).</li>
<li>Wang, D., Zhang, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+therapeutic+genome+editing%3A+Strategies+and+in+vivo+delivery+by+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors.</a> Cell. 181 (1), 136-150 (2020).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).</li>
<li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+An+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li>
<li>Sugimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue-derived+MaR2+contributes+to+cold-induced+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).</li>
<li>Leiria, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12-lipoxygenase+regulates+cold+adaptation+and+glucose+metabolism+by+producing+the+omega-3+lipid+12-HEPE+from+brown+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).</li>
<li>Shamsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF6+and+FGF9+regulate+UCP1+expression+independent+of+brown+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis.</a> Nature Communications. 11, 1421(2020).</li>
<li>Romanelli, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAd-CRISPR%3A+Inducible+gene+knockout+in+interscapular+brown+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402(2021).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9, 5416(2018).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+insulin+receptor+substrates+in+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+Sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western blotting: Sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Jarrett, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+genome+editing+with+CRISPR%2FCas9+generates+and+corrects+a+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease.</a> Scientific Reports. 7, 44624(2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+RNA-targeting+CRISPR%2FCas13d+technology+outperforms+shRNA+in+identifying+functional+circRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs.</a> Genome Biology. 22 (1), 41(2021).</li>
<li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+purification%2C+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960(2019).</li>
<li>Jimenez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+adeno-associated+viral+vector-mediated+genetic+engineering+of+white+and+brown+adipose+tissue+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice.</a> Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV-mediated+gene+delivery+to+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).</li>
<li>Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+efficient+gene+knockout+and+overexpression+in+mouse+interscapular+brown+adipocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101895(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istniejące opublikowane metody dostarczania genów za pośrednictwem AAV do międzyłopatkowego BAT nie zawierają szczegółowych zdjęć i filmów opisujących techniki chirurgiczne i podejście do bezpośredniego wstrzykiwania AAV do BAT. W większości opublikowanych metod33,34 AAV jest wstrzykiwany do tkanki tłuszczowej otaczającej BAT między łopatkami, a nie do samego BAT. W związku z tym istnieje kilka kluczowych kroków w tym protokole, które decydują o powodzeniu badani...

Otyłość rośnie w znacznym tempie na całym świecie, prowadząc do szerokiego spektrum chorób metabolicznych1,2,3. Tkanka tłuszczowa jest kluczem do tych patologii. Dwa funkcjonalnie odrębne typy tkanki tłuszczowej, które istnieją, to biała tkanka tłuszczowa (WAT), która magazynuje nadmiar kalorii, oraz brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) i związany z nią tłuszcz beżowo-brite, które rozpraszają energię do termogenezy. Chociaż BAT został uznany za funkcję rozpraszania energii, pełni również funkcje endokrynologiczne poprzez produkcję bioaktywnych cząsteczek, które regulują metabolizm w dystalnych narządach4,5. Liczne badania na gryzoniach wykazały, że zwiększenie ilości lub aktywności brązowego lub beżowego tłuszczu prowadzi do zwiększonego wydatku energetycznego i poprawy wrażliwości na insulinę. U ludzi osoby z wykrywalnym BAT mają znacznie mniejszą częstość występowania chorób kardiometabolicznych6. W związku z tym BAT ma doskonały potencjał terapeutyczny w zakresie następstw metabolicznych związanych z otyłością7,8,9.
Aby zbadać fizjologię i patofizjologię rozwoju i funkcji BAT oraz wyjaśnić mechanizmy molekularne związane z tymi procesami, metodą wyboru jest model myszy transgenicznej specyficzny dla BAT10. System rekombinacji Cre-LoxP jest najczęściej stosowanym sposobem produkcji myszy z warunkowym nokautem poprzez edycję genomu myszy. System ten umożliwił modyfikację (nadekspresję lub nokaut) genów będących przedmiotem zainteresowania w sposób specyficzny dla tkanki/komórki11. Może być również wykorzystany do znakowania określonego typu komórki poprzez ekspresję selektywnego fluorescencyjnego genu reporterowego.
Ostatnio, podejście systemowe Cre-LoxP zostało jeszcze bardziej rozwinięte poprzez połączenie technologii CRISPR-Cas9 i systemu jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA) wirusa związanego z adenowirusem (AAV)12. System CRISPR-Cas9 jest specyficznym i wydajnym narzędziem do edycji genów do modyfikowania, regulowania lub celowania w precyzyjne regiony genomu13. Edycja genomu oparta na CRISPR-Cas9 pozwala na szybką manipulację genetyczną loci genomu, ponieważ nie wymaga rekombinacji homologicznej z wektorem ukierunkowanym na gen. Połączone techniki Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i AAV-sgRNA umożliwiają naukowcom dokładniejsze zrozumienie funkcji genów, umożliwiając badanie roli genów będących przedmiotem zainteresowania w pożądanych momentach w tkankach/komórkach. Ponadto te połączone techniki skracają czas i wysiłek wymagany do wygenerowania myszy transgenicznych i umożliwiają czasową kontrolę aktywności CRISPR-Cas9 w celu indukowalnej edycji genomu u myszy, jeśli używana jest indukowalna linia Cre14.
Wektory AAV są bezpiecznymi i skutecznymi systemami dostarczania genów in vivo. Jednak AAV ukierunkowane na tkankę tłuszczową pozostają w tyle za aplikacjami w innych tkankach, takich jak mózg, serce, wątroba i mięśnie15. Ze względu na stosunkowo niską wydajność transdukcji i tropizm z naturalnie występującymi wektorami serotypów, dostarczanie genów do tkanki tłuszczowej pod kontrolą AAV jest nadal wyzwaniem15. W ciągu ostatnich 5 lat wraz z innymi z powodzeniem opracowaliśmy skuteczne i minimalnie inwazyjne sposoby dostarczania genów kierowanych przez AAV do tkanki tłuszczowej i stworzyliśmy modele mysie, które pozwalają nam zrozumieć geny zaangażowane w regulację funkcji BAT16,17,18,19. Na przykład, używając AAV8 do dostarczania sgRNA ukierunkowanego na Alox12, który koduje 12-lipooksygenazę (12-LOX), do BAT myszy Ucp1-Cre / Cas9, odkryliśmy, że aktywowany BAT wytwarza metabolity 12-LOX, a mianowicie kwas 12-hydroksy-eikozapentaenowy (12-HEPE) i 13R, 14S-dihydroksy-dokozaheksaenowy kwas (maresin 2), odpowiednio w celu regulacji metabolizmu glukozy i rozwiązania stanu zapalnego związanego z otyłością16, 17. W tym miejscu przedstawiamy protokół krok po kroku dotyczący procedur technicznych, w szczególności operacji bezpośredniego mikrowstrzykiwania AAV-sgRNA do płatów BAT, w celu wygenerowania myszy z nokautem specyficznych dla BAT przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i AAV-sgRNA.

<table><tbody><tr><td>Chemikalia, peptydy i białka</td><td></td><td></td><td></td>rekombinowane</tr><tr><td>Pożywka bez surowicy OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenu</td><td>Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2 wektor&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td><td>Addgene</td><td>89060</td><td></td></tr><tr><td>plazmid otoczki pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pakujący psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Modele eksperymentalne: Linie komórkowe Komórki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>Komórki ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>WT-1</td><td>Opracowany w laboratorium Tseng</td><td>PMID: 14966273</td><td></td></tr><tr><td>Modele eksperymentalne: Organizmy/szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cas9 myszy knockin</td><td>Jackson Laboratories</td><td>24857</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Ucp1-CRE</td><td>Jackson Laboratories</td><td>24670</td><td></td></tr><tr><td>Inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banamine</td><td>Patterson</td><td>07-859-1323</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>Model 710 RN Strzykawka</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>Hamilton</td><td>32 gauge, mała piasta Igła RN, igła typu 2</td><td></td></tr><tr><td>Szew 5-0 Unify PCL25 P-3 Niebarwiona 18 cali Monofilament 12/Bx</td><td>Henry Schein</td><td>1273504</td><td></td></tr><tr><td>Szew 5-0 Unify Silk P-3 18 cali 12/Bx</td><td>Henry Schein</td><td></td><td></td>1294522</tr></tbody></table>

generowanie myszy z nokautem specyficznych dla brązowego tłuszczu przy użyciu połączonego systemu cre-loxp, crispr-cas9 i jednoprzewodnikowego systemu rna wirusa związanego z adenowirusem

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

Brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) to magazyn tłuszczu wyspecjalizowany w rozpraszaniu energii, który może również służyć jako narząd endokrynny poprzez wydzielanie bioaktywnych cząsteczek. Stworzenie myszy z nokautem specyficznych dla BAT jest jednym z najpopularniejszych podejść do zrozumienia wkładu genu będącego przedmiotem zainteresowania w regulację energii za pośrednictwem BAT. Konwencjonalna strategia celowania w geny z wykorzystaniem systemu Cre-LoxP była głównym podejściem do generowania myszy z nokautem specyficznym tkankowo. Takie podejście jest jednak czasochłonne i żmudne. W tym miejscu opisujemy protokół szybkiego i skutecznego nokautu genu będącego przedmiotem zainteresowania w BAT przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i systemu jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA) wirusa związanego z adenowirusem (AAV). BAT międzyłopatkowy znajduje się w głębokiej warstwie między mięśniami. W związku z tym BAT musi być narażony, aby można było precyzyjnie i bezpośrednio wstrzyknąć AAV do BAT w polu widzenia. Odpowiednie postępowanie chirurgiczne ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania uszkodzeniom nerwów współczulnych i naczyń, takich jak żyła Sultzera, która łączy się z BAT. Aby zminimalizować uszkodzenia tkanek, istnieje krytyczna potrzeba zrozumienia trójwymiarowego położenia anatomicznego BAT oraz umiejętności chirurgicznych wymaganych na etapach technicznych. Protokół ten podkreśla kluczowe procedury techniczne, w tym projektowanie sgRNA ukierunkowanych na gen będący przedmiotem zainteresowania, przygotowanie cząstek AAV-sgRNA oraz operację bezpośredniego mikrowstrzykiwania AAV do obu płatów BAT w celu wygenerowania myszy z nokautem specyficznych dla BAT, które można szeroko zastosować do badania biologicznych funkcji genów w BAT.

W powyższych procedurach precyzyjne dostarczenie AAV-sgRNA do BAT jest kluczowe dla powodzenia protokołu. Aby zmaksymalizować efekt AAV-sgRNA i zminimalizować uszkodzenia tkanki podczas operacji, niezbędne jest zrozumienie trójwymiarowego (3D) położenia anatomicznego BAT. Jak pokazano na Ryc. 3E, trudno jest zidentyfikować dokładną lokalizację BAT bez odsłonięcia tkanki. Jednak nadmierne odsłonięcie BAT może uszkodzić tkankę (Ryc. 3H, I); dlateg...

W tym protokole opisujemy procedury techniczne do generowania myszy z nokautem specyficznym dla brązowej tkanki tłuszczowej (BAT), wykorzystując połączony system Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i systemu jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) związanego z adenowirusem (AAV). Opisane etapy obejmują projektowanie sgRNA, przygotowanie cząstek AAV-sgRNA oraz mikroiniekcję AAV do płatów BAT.

Generowanie myszy z nokautem specyficznych dla brązowego tłuszczu przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i jednoprzewodnikowego systemu RNA wirusa związanego z adenowirusem

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

Protokół ten generuje myszy z nokautem specyficznym dla brązowego tłuszczu przy użyciu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i systemu jednoprzewodnikowego RNA wirusa związanego z adenowirusem. Obejmuje technikę chirurgiczną umożliwiającą bezpieczne podawanie AAV do brunatnej tkanki tłuszczowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że może szybko generować specyficzne tkankowo nokauty bez konieczności selektywnego rozmnażania myszy.Podejście do wykonywania specyficznego tkankowo nokautu lub knockdownów można dostosować do innych tkanek, jeśli procedura chirurgiczna wstrzykiwania AAV jest modyfikowana w zależności od narządu docelowego. Na początek podawaj środek przeciwbólowy podskórnie znieczulonej myszy UCP1 Cre Cas9, aby zminimalizować i zapobiec pooperacyjnemu bólowi i stresowi. Następnie ogol sierść w obszarze międzyłopatkowym za pomocą golarki i wysterylizuj obszar chirurgiczny za pomocą co najmniej trzech naprzemiennych rund peelingu na bazie jodu lub chlorheksydyny, a następnie 70% etanolu.Za pomocą skalpela wykonaj dwucentymetrowe nacięcie w skórze nad brązową tkanką tłuszczową między łopatkami, aby odsłonić tłuszcz międzyłopatkowy. Po wykonaniu pojedynczego nacięcia należy przeciąć tkanki tłuszczowe na granicy między dystalnym obszarem tkanek tłuszczowych a mięśniami. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych w ręce dominującej oderwij tkankę tłuszczową tępo i pionowo, aby odsłonić brązową tkankę tłuszczową, jednocześnie ściskając tkanki tłuszczowe, w tym brązową tkankę tłuszczową, ręką niedominującą.Użyj żyły Sulzera jako punktu orientacyjnego, aby wskazać dokładną lokalizację brązowej tkanki tłuszczowej. Następnie, dla każdej myszy, wstrzyknij powoli 20 mikrolitrów wirusa związanego z adenowirusem lub AAV do każdego płata dwóch brązowych tkanek tłuszczowych za pomocą ostrej igły o rozmiarze 32 podłączonej do 100-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona. Potwierdzić pomyślne wstrzyknięcie, na co wskazuje brak wycieków z miejsca wstrzyknięcia podczas podawania AAV.Po zapewnieniu homeostazy umieść odsłonięte tkanki tłuszczowe z powrotem w ich normalnej pozycji, aby zszyć krawędź tkanki tłuszczowej i mięśni za pomocą wchłanialnej nici monofilamentowej 5-0. Na koniec zszyj otwartą skórę niebarwionymi plecionymi niciami VICRYL pokrytymi 5-0. Dokładna lokalizacja brunatnej tkanki tłuszczowej nie może być zidentyfikowana bez jej odsłonięcia, jednak nadmierna ekspozycja powoduje uszkodzenie tkanki.Potencjalne wady, które mogły doprowadzić do nieudanych wstrzyknięć, obejmowały wstrzyknięcie roztworu AAV w niewłaściwy obszar, penetrację igły przez tkankę i balonowanie tkanek z powodu nadmiernej objętości roztworu AAV. Precyzyjne dostarczenie pojedynczego przewodnika RNA AAV do brunatnej tkanki tłuszczowej miało kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu. Kluczem do sukcesu przy odsłanianiu brunatnej tkanki tłuszczowej jest chirurgiczna technika nożycowa, w tym kierunek i głębokość nożyczek oraz umiejscowienie strzykawki Hamiltona.Technika ta wykorzystuje zwierzęta nokautujące specyficzne dla tkanki, aby zrozumieć molekularne regulatory metabolizmu energetycznego związanego z brunatnym tłuszczem.

generation-brown-fat-specific-knockout-mice-using-combined-cre-loxp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje procedurę nokautu genu docelowego za pomocą systemu rekombinazy Cre indukowanego tamoksyfenem po dootrzewnowym wstrzyknięciu tamoksyfenu w modelu mysim.

Inaktywacja genu docelowego oparta na systemie CreER-LoxP: indukowany tamoksyfenem system rekombinazy Cre do docelowego nokautu genu w modelu mysim

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Ten protokół opisuje kroki klonowania wielu pojedynczych przewodnikowych RNA do jednego wektora konkategorującego RNA przewodnika, co jest szczególnie przydatne w tworzeniu wielogenowych nokautów przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. Wytwarzanie podwójnych nokautów w organoidach jelitowych przedstawiono jako możliwe zastosowanie tej metody.

Protokół wielokrotnego nokautu genów w organoidach jelita cienkiego myszy przy użyciu konkategomera CRISPR

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do przeprowadzenia in vivo edycji genów serca u myszy przy użyciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) za pośrednictwem CRISPR. Protokół ten oferuje obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu kardiomiopatii dystroficznej w dystrofii mięśniowej Duchenne'a i może być stosowany do generowania specyficznego dla serca nokautu u myszy po urodzeniu.

Dostarczanie CRISPR za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy

To badanie opisuje nową metodę izolowania mysich brązowych adipocytów do analizy ekspresji genów i białek.

Izolowanie brązowych adipocytów z mysiej brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami w celu analizy ekspresji genów i białek

Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Protokół opisuje, jak generować nokautujące mioblasty za pomocą CRISPR/Cas9, zaczynając od projektowania przewodników RNA, aż po klonowanie komórkowe i charakterystykę klonów nokautujących.

Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

Obecny protokół opisuje mikroiniekcję zygoty z CRISPR-Cas9 i DNA dawcy w celu efektywnej produkcji myszy z kasetą z genami i myszami z klapkami.

Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

Ten protokół przedstawia użycie CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) w adipocytach (AdipoSPH) jako alternatywnej strategii dla wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do badania biologii beżowego tłuszczu. Wstrzyknięcie in vivo sgRNA przenoszącego AAV ukierunkowanego na endogenny gen Prdm16 jest wystarczające do wywołania rozwoju beżowego tłuszczu i wzmocnienia programu genów termogenicznych.

Badanie biologii i metabolizmu tłuszczów beżowych przy użyciu systemu aktywacji CRISPR SunTag-p65-HSF1

Efektywność metody Improved Genome Editing za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych w jajowódku (I-GONAD) jest porównywalna z tradycyjną mikroiniekcją, która wymaga pobrania zygot od samic dawców i przekazania ich do kobiet pseudo-ciężarnych. Protokół ten wykazuje swoją skuteczność, wprowadzając mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 do locus ROSA26 na chromosomie 6.

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Poznaj metodę generowania myszy z nokautem brązowego tłuszczu przy użyciu systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i wirusa AAV. Technika ta umożliwia szybkie tworzenie modelów tkankowo-specyficznych bez konieczności selektywnego rozrodu.

Generowanie myszy z nokautem specyficznych dla brązowego tłuszczu przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i jednoprzewodnikowego systemu RNA wirusa związanego z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie myszy z nokautem specyficznych dla brązowego tłuszczu przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i jednoprzewodnikowego systemu RNA wirusa związanego z adenowirusem

Przeglądaj więcej filmów