Generowanie myszy z nokautem specyficznych dla brązowego tłuszczu przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i jednoprzewodnikowego systemu RNA wirusa związanego z adenowirusem
24 marca 2023
W tym protokole opisujemy procedury techniczne do generowania myszy z nokautem specyficznym dla brązowej tkanki tłuszczowej (BAT), wykorzystując połączony system Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i systemu jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) związanego z adenowirusem (AAV). Opisane etapy obejmują projektowanie sgRNA, przygotowanie cząstek AAV-sgRNA oraz mikroiniekcję AAV do płatów BAT.
Protokół ten generuje myszy z nokautem specyficznym dla brązowego tłuszczu przy użyciu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i systemu jednoprzewodnikowego RNA wirusa związanego z adenowirusem. Obejmuje technikę chirurgiczną umożliwiającą bezpieczne podawanie AAV do brunatnej tkanki tłuszczowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że może szybko generować specyficzne tkankowo nokauty bez konieczności selektywnego rozmnażania myszy.
Podejście do wykonywania specyficznego tkankowo nokautu lub knockdownów można dostosować do innych tkanek, jeśli procedura chirurgiczna wstrzykiwania AAV jest modyfikowana w zależności od narządu docelowego. Na początek podawaj środek przeciwbólowy podskórnie znieczulonej myszy UCP1 Cre Cas9, aby zminimalizować i zapobiec pooperacyjnemu bólowi i stresowi. Następnie ogol sierść w obszarze międzyłopatkowym za pomocą golarki i wysterylizuj obszar chirurgiczny za pomocą co najmniej trzech naprzemiennych rund peelingu na bazie jodu lub chlorheksydyny, a następnie 70% etanolu.
Za pomocą skalpela wykonaj dwucentymetrowe nacięcie w skórze nad brązową tkanką tłuszczową między łopatkami, aby odsłonić tłuszcz międzyłopatkowy. Po wykonaniu pojedynczego nacięcia należy przeciąć tkanki tłuszczowe na granicy między dystalnym obszarem tkanek tłuszczowych a mięśniami. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych w ręce dominującej oderwij tkankę tłuszczową tępo i pionowo, aby odsłonić brązową tkankę tłuszczową, jednocześnie ściskając tkanki tłuszczowe, w tym brązową tkankę tłuszczową, ręką niedominującą.
Użyj żyły Sulzera jako punktu orientacyjnego, aby wskazać dokładną lokalizację brązowej tkanki tłuszczowej. Następnie, dla każdej myszy, wstrzyknij powoli 20 mikrolitrów wirusa związanego z adenowirusem lub AAV do każdego płata dwóch brązowych tkanek tłuszczowych za pomocą ostrej igły o rozmiarze 32 podłączonej do 100-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona. Potwierdzić pomyślne wstrzyknięcie, na co wskazuje brak wycieków z miejsca wstrzyknięcia podczas podawania AAV.
Po zapewnieniu homeostazy umieść odsłonięte tkanki tłuszczowe z powrotem w ich normalnej pozycji, aby zszyć krawędź tkanki tłuszczowej i mięśni za pomocą wchłanialnej nici monofilamentowej 5-0. Na koniec zszyj otwartą skórę niebarwionymi plecionymi niciami VICRYL pokrytymi 5-0. Dokładna lokalizacja brunatnej tkanki tłuszczowej nie może być zidentyfikowana bez jej odsłonięcia, jednak nadmierna ekspozycja powoduje uszkodzenie tkanki.
Potencjalne wady, które mogły doprowadzić do nieudanych wstrzyknięć, obejmowały wstrzyknięcie roztworu AAV w niewłaściwy obszar, penetrację igły przez tkankę i balonowanie tkanek z powodu nadmiernej objętości roztworu AAV. Precyzyjne dostarczenie pojedynczego przewodnika RNA AAV do brunatnej tkanki tłuszczowej miało kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu. Kluczem do sukcesu przy odsłanianiu brunatnej tkanki tłuszczowej jest chirurgiczna technika nożycowa, w tym kierunek i głębokość nożyczek oraz umiejscowienie strzykawki Hamiltona.
Technika ta wykorzystuje zwierzęta nokautujące specyficzne dla tkanki, aby zrozumieć molekularne regulatory metabolizmu energetycznego związanego z brunatnym tłuszczem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę generowania myszy z wybiórczym znokautowaniem genu w brunatnej tkance tłuszczowej (BAT), wykorzystującą kombinację technik Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 oraz wektorów AAV (wirusa towarzyszącego adenowirusom) z pojedynczym przewodnim RNA. Dzięki zastosowaniu tych metod badacze mogą szybko tworzyć tkankowo specyficzne nokauty bez konieczności prowadzenia selektywnego rozchowu.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Genetyka
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Wstęp
- Brunatna tkanka tłuszczowa ma kluczowe znaczenie dla metabolizmu energetycznego.
- Tworzenie specyficznych dla tkanki knockoutów pomaga w zrozumieniu procesów biologicznych.
- Metodę tę można potencjalnie dostosować do innych tkanek.
Zastosowane metody
- Zastosowanie podejść Cre-LoxP i CRISPR-Cas9.
- Wykorzystany model mysi: myszy UCP1 Cre Cas9.
- Podanie AAV-sgRNA poprzez chirurgiczną mikroińekcję.
Główne wyniki
- Skuteczne celowanie i knockout w tkance tłuszczowej brunatnej.
- Wykazana skuteczność AAV w tkankowo specyficznej edycji genów.
- Zwalidowane kluczowe techniki chirurgiczne dla precyzyjnego dostarczania.
Wnioski
- Badanie prezentuje szybką technikę generowania modeli z nokautem genów istotnych dla metabolizmu brunatnej tkanki tłuszczowej.
- Pozwala ono na lepsze zrozumienie molekularnych regulatorów metabolizmu energetycznego.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka generacja myszy z knockoutem specyficznym dla brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) z wykorzystaniem połączonych technologii Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 oraz AAV-sgRNA umożliwia przyspieszoną genomikę funkcjonalną w badaniach nad metabolizmem. Podejście to usprawnia walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego dla genów zaangażowanych w regulację energii, skracając czas cykli w porównaniu z tradycyjną hodowlą. Metoda ta wspiera decyzje portfelowe, dostarczając specyficznych dla tkanki informacji, które są kluczowe dla wczesnego etapu odkryć i ciągłości translacyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji genów w BAT w celu uzyskania jasności mechanistycznej.
- Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka poprzez izolację efektów genowych w tkance istotnej dla przebiegu choroby.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w wyborze celu terapeutycznego dla zaburzeń metabolicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane modele z nokautem genowym do dalszego przesiewania fenotypowego.
- Standaryzuje tło genetyczne w celu uzyskania powtarzalnych wyników ilościowych.
- Przyspiesza opracowywanie testów poprzez pominięcie długotrwałych cykli hodowlanych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia dopasowanie modeli przedklinicznych do mechanizmów ludzkich chorób metabolicznych poprzez edycję genów specyficznych dla BAT.
- Umożliwia postępy w badaniach z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez wyjaśnienie wpływu genów na metabolizm energetyczny.
- Zapewnia ciągłość procesów od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w badaniach nad metabolizmem.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta jest stosowana na wczesnych etapach odkrywania leków i walidacji celów terapeutycznych, stanowiąc pomost do opracowania modeli przedklinicznych dla portfeli badawczych z zakresu metabolizmu i endokrynologii.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w regulacji energetycznej zależnej od BAT.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne modele nokautowe do ilościowych analiz fenotypowych.
- Analityka: Umożliwia pomiar specyficznych dla genów efektów w odniesieniu do wyników metabolicznych in vivo.
- Badania translacyjne: Ułatwia dostosowanie modeli przedklinicznych do biologii BAT u ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Adaptowalny protokół dla innych tkanek poprzez modyfikację dostarczania AAV, wspierający szersze zastosowania w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje dwuznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Usprawnia generowanie modeli dzięki standaryzowanym, powtarzalnym procedurom.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywną pod względem kapitałowym alokację zasobów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów metabolicznych i endokrynnych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie chirurgicznych mikroiniekcji oraz lokalizacji anatomicznej BAT.
- Niezbędny jest dostęp do infrastruktury produkcji AAV oraz inżynierii genetycznej CRISPR-Cas9.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja protokołu jest konieczna przy targetowaniu innych tkanek lub narządów.
- Sukces zależy od precyzyjnego dostarczenia AAV i zminimalizowania uszkodzeń tkanki.
