Name: Wyjaśnienie metabolizmu 2,4-dibromofenolu w roślinach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:25:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Odkryj metodę identyfikacji metabolitów 2,4-dibromofenolu w roślinach za pomocą kultury kalusowej. To podejście pozwala ocenić degradację ksenobiotyków przy minimalnym wpływie czynników zewnętrznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (21976160) oraz Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006).

1. Różnicowanie kalusa marchwi
UWAGA: Autoklaw wszystkie używane tutaj urządzenia i wykonuj wszystkie operacje na ultra czystym stole warsztatowym sterylizowanym promieniami UV.
<ol>
	<li>Wernalizować nasiona, zanurzając jednolite nasiona marchwi (Daucus carota var. sativus) w wodzie dejonizowanej o temperaturze 4 °C na 16 godzin.</li>
	<li>Sterylizuj powierzchniowo wernalizowane nasiona 75% etanolem przez 20 minut, a następnie spłucz trzykrotnie sterylną wodą dejonizowaną w warunkach aseptycznych.</li>
	<li>Następnie sterylizuj nasiona 20% H2O2 przez 20 minut i umyj je wysterylizowaną wodą dejonizowaną sześć razy w warunkach aseptycznych.</li>
	<li>Nasiona kiełkować w aseptyce, wysiewając je na bezhormonalnym podłożu MS (pH 5,8, sterylizowane w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut) zawierającym 1% żelu agarowego i inkubując w temperaturze 26 °C z 16-godzinnym fotoperiodem (350 μmol/m2s) przez 15 dni.</li>
	<li>Eksplantaty należy uzyskać, krojąc hipokotyl i liścienie sadzonek na małe kawałki (0,5 cm).</li>
	<li>Przekształć eksplantaty w szalki Petriego (dwa do czterech eksplantatów na szalkę) zawierające 15-20 ml aseptycznego podłoża MS uzupełnionego auksymonem (kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy; 1 mg/l) i fitokininą (6-benzyloaminopuryna; 0,5 mg/l) w warunkach aseptycznych.</li>
	<li>Inkubować eksplantaty w ciemności w temperaturze 26 °C przez 3-4 tygodnie, aby wywołać kalus.</li>
	<li>Oddziel tkanki kalusa (o średnicy około 1 cm) utworzone z początkowych eksplantatów za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy. 
	UWAGA: Nowo powstałe tkanki kalusa mają kolor od białego do kremowożółtego i luźno przylegają do początkowych eksplantatów.</li>
</ol>
2. Leczenie 2,4-dibromofenolem
<ol>
	<li>Rozpuścić 1 μg 2,4-dibromofenolu w 10 ml aseptycznego płynnego podłoża MS (końcowe stężenie 2,4-dibromofenolu wynosi 100 ppb, pH 5,6-7,0).</li>
	<li>Dodać 3 g świeżego kalusa marchwi (krok 1.8) do szklanych kolb zawierających przygotowany roztwór 2,4-dibromofenolu (z etapu 2.1) w warunkach aseptycznych. Rozważ to jako leczenie 2,4-dibromofenolem. 
	UWAGA: Szklane kolby zostały autoklawizowane i uszczelnione folią parafinową.</li>
	<li>Dołączyć pożywkę kontrolną zawierającą tylko roztwór 2,4-dibromofenolu (przygotowany w kroku 2.1) w celu oceny abiotycznej degradacji 2,4-dibromofenolu.</li>
	<li>Dołączyć ślepą próbę kontrolną zawierającą tylko kalus marchwi (bez roztworu 2,4-dibromofenolu) w celu sprawdzenia, czy nie ma potencjalnego zanieczyszczenia.
	<ol>
		<li>Przygotować ślepą próbę kontrolną zawierającą marchew, dodając 3 g świeżo zebranego kalusa z marchwi tylko do 10 ml sterylnego podłoża MS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować poddanie działaniu 2,4-dibromofenolu oraz pożywkę i próby kontrolne w temperaturze 130 obr./min i w temperaturze 26 °C w ciemności w inkubatorze przez 120 godzin.</li>
	<li>Wyjąć szklane kolby z inkubatora w celu pobrania próbek z obróbki 2,4-dibromofenolem i kontroli po 120 godzinach inkubacji><.
	UWAGA: Wszystkie próbki przygotowano w trzech egzemplarzach.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Ostrożnie oddzielić kalus od podłoża MS przez filtrację za pomocą filtrów z włókna szklanego (0,45 μm) do obróbki 2,4-dibromofenolem i kontrol. Zbierz modzel po trzykrotnym umyciu ultraczystą wodą.</li>
	<li>Pobrany kalus należy liofilizować ciekłym azotem, a następnie homogenizować zebrany kalus (0,2 g) za pomocą wysokowydajnego młynka do tkanek o częstotliwości 70 Hz przez 3 minuty.</li>
	<li>Nakłuć homogenizowany kalus, dodając 50 μl substytutu 4-n-NP-d4 o stężeniu 25 mg/l za pomocą szklanej mikrostrzykawki, a następnie wirując przez 1 minutę.</li>
	<li>Sonikować próbki za pomocą 5 ml metanolu/wody (1:1, v/v) w ultrasonografie (150 W, 40 kHz) wypełnionym lodowatą wodą przez 30 minut, w celu ekstrakcji 2,4-dibromofenolu i metabolitów.</li>
	<li>Odwirować zawiesiny o sile 8 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zebrać supernatanty przez pipetowanie.
	<ol>
		<li>Powtórzyć procesy ekstrakcji próbki kalusa trzy razy i połączyć ekstrakty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepuścić ekstrakty przez hydrofilowe wkłady do ekstrakcji w zrównoważonej fazie stałej (HLB SPE) o natężeniu przepływu 1 ml/min. 
	UWAGA: Wkłady HLB SPE zostały wstępnie potraktowane sekwencyjnie 6 ml metanolu i 6 ml wody w celu usunięcia wszelkich zakłóceń.</li>
	<li>Eluować anality, przepuszczając 6 ml metanolu przez wkłady HLB SPE. Następnie zagęścić otrzymane eluenty do 1 ml pod delikatnym strumieniem azotu gazowego do analizy instrumentalnej.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μl powstałych eluentów do UPLC-Q-TOF-MS dla analizy 2,4-dibromofenolu i jego metabolitów15.
	<ol>
		<li>Przefiltruj wszystkie próbki za pomocą membrany nylonowej 0,22 μm przed analizą instrumentalną</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza instrumentalna
UWAGA: Analizy 2,4-dibromofenolu i jego metabolitów przeprowadzono na ultra-sprawnym chromatografie cieczowym (UPLC) w połączeniu ze spektrometrem masowym micrOTOF-QII wyposażonym w jonizację elektronrozpylającą (ESI), działającym w trybie jonów dodatnich i ujemnych.
<ol>
	<li>Otwórz drzwiczki grzałki kolumny i zainstaluj kolumnę UPLC, podłączając wlot kolumny do zaworu wtryskowego, a wylot kolumny do wlotu spektrometru mas. 
	UWAGA: Kolumna C18 (50 mm x 2,1 mm; wielkość cząstek 1,7 μm) została użyta do rozdzielania analitów w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Podłączyć ruchomą fazę A (woda ultraczysta) i fazę ruchomą B (metanol do chromatografii) do przyrządu, wkładając koniec probówek rozpuszczalnika A i B odpowiednio do odpowiednich butelek z rozpuszczalnikiem.
	<ol>
		<li>Przefiltruj wszystkie fazy ruchome (po 500 ml na każdą) przez filtr 0,22 μm i poddaj soniku przez ponad 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W oknie oprogramowania kliknij Instrument | Metoda wlotowa do edycji warunków dla chromatogramu cieczowego.
	<ol>
		<li>Ustawić warunki gradientu fazy ruchomej B w następujący sposób: natężenie przepływu 1,0 ml/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 min, 5% do 50%; 3,5-6,5 min, 50% do 100%; 6,5-7 min, 100%; 7-10 min, 100% do 5%.</li>
		<li>Ustaw szybkość wstrzykiwania próbek do UPLC-Q-TOF-MS na 0,2 ml/min. 
		UWAGA: Wstrzykiwanie próbki jest programowane za pomocą w pełni automatycznego próbnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W oknie oprogramowania wybierz Metodę MS, a następnie ustaw parametry Q-TOF-MS: natężenie przepływu gazu suszącego (N2) 8 l/min, temperatura 300-350 °C, napięcie kapilarne 4 500 V, energia zderzenia 5-45 V i pełny zakres skanowania 40-800 Da.</li>
	<li>Umieść fiolki z próbkami w odpowiednich miejscach tacek na próbki według numeru seryjnego i ponownie włóż tacki na próbki do komory na próbki. 
	UWAGA: Utrzymuj tacki na próbki płasko i upewnij się, że drzwiczki komory na próbki są zamknięte.</li>
	<li>W oknie oprogramowania wybierz Plik | Nowość, aby utworzyć bazę danych. Nazwij bazę danych.</li>
	<li>Załaduj przykładowy program utworzony powyżej, wybierając opcję Plik MS | Plik wlotowy | Objętość wstrzyknięcia.</li>
	<li>Zapisz bazę danych w folderze przykładowym projektu, klikając punkt menu Plik | Zapisz.</li>
	<li>Wybierz pozycję Uruchom | Uruchom w oknie głównym oprogramowania, a następnie wybierz opcję Pobierz przykładowe dane i kliknij przycisk OK w oknie uruchamiania listy próbek, aby zebrać dane. 
	UWAGA: Chromatogram w czasie rzeczywistym można wyświetlić, klikając Chromatogram | Aktualizacja w czasie rzeczywistym podczas procesu pozyskiwania danych.</li>
	<li>Przetwarzaj dane w oprogramowaniu, wybierając docelowy wiersz danych i klikając okno Chromatogram, aby wyświetlić chromatogram MS scan.</li>
	<li>W oknie Chromatogram kliknij Wyświetl | TIK | Skaner ScanWaveDS | Dodawanie śladu | OK, aby uzyskać widma masowe skanowania córki.</li>
	<li>Zidentyfikować metabolity, porównując chromatogramy poddane działaniu 2,4-dibromofenolu i kontrole.</li>
	<li>Wyjaśnij kandydatów na metabolity według czasu retencji, masy i wzorców fragmentacji16,17. 
	UWAGA: Błąd dokładności masy między doświadczalnymi wartościami m/z jonów macierzystych kandydatów na metabolity do odpowiadających im teoretycznych m/z powinien być mniejszy niż 10 ppm.</li>
</ol>

<ol><li>Chakraborty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+investigation+on+plasticizers%2C+bisphenol+A%2C+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+and+heavy+metals+in+the+surface+soil+of+the+informal+electronic+waste+recycling+workshops+and+nearby+open+dumpsites+in+Indian+metropolitan+cities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities.</a> Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).</li>
<li>Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence%2C+fate+and+environmental+risk+of+anionic+surfactants%2C+bisphenol+A%2C+perfluorinated+compounds+and+personal+care+products+in+sludge+stabilization+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments.</a> Science of the Total Environment. 711, 135048(2020).</li>
<li>Xu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+occurrence+of+bisphenol+A+and+thirteen+structural+analogs+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil.</a> Chemosphere. 277, 130232(2021).</li>
<li>Cai, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+nonylphenol+and+nonylphenol+monoethoxylate+in+soil+and+vegetables+from+vegetable+farms+in+the+Pearl+River+Delta%2C+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Environmental+Contamination+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China.</a> Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).</li>
<li>Wang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Migration+and+health+risks+of+nonylphenol+and+bisphenol+a+in+soil-winter+wheat+systems+with+long-term+reclaimed+water+irrigation%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).</li>
<li>Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isomer-specific+approach+to+endocrine-disrupting+nonylphenol+in+infant+food%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).</li>
<li>Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+metabolism+in+plants+and+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Pesticide metabolism in plants and microorganisms.</a> Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).</li>
<li>Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+callus+cultures+to+elucidate+the+metabolism+of+tebuconazole%2C+flurtamone%2C+fenhexamid%2C+and+metalaxyl-M+in+Brassica+napus+L.%2C+Glycine+max+%28L.%29+Merr.%2C+Zea+mays+L.%2C+and+Triticum+aestivum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).</li>
<li>Macherius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolization+of+the+bacteriostatic+agent+triclosan+in+edible+plants+and+its+consequences+for+plant+uptake+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment.</a> Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).</li>
<li>Sun, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+nonylphenol+in+plants%3A+Isomer+selectivity+involved+with+direct+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation.</a> Environmental Pollution. 270, 116064(2021).</li>
<li>Schymanski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry%3A+communicating+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).</li>
<li>Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Household+dust+as+a+repository+of+chemical+accumulation%3A+new+insights+from+a+comprehensive+high-resolution+mass+spectrometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study.</a> Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+PBDEs+and+brominated+phenolic+compounds+in+particulate+matters+emitted+during+recycling+of+waste+printed+circuit+boards+in+a+typical+e-waste+workshop+of+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China.</a> Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).</li>
<li>de Wit, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+brominated+flame+retardants+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">An overview of brominated flame retardants in the environment.</a> Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).</li>
<li>Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Uptake+and+Metabolism+of+e%2C4-Dibromophenol+in+Carrot%3A+In+Vitro+Enzymatic+Direct+Conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).</li>
<li>Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+framework+for+identifying+toxic+transformation+products+in+complex+environmental+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).</li>
<li>Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontarget+screening+with+high+resolution+mass+spectrometry+in+the+environment%3A+ready+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go.</a> Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).</li>
<li>Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplays+between+the+cell+wall+and+phytohormones+in+interaction+between+plants+and+necrotrophic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens.</a> Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+metabolic+pathways+of+2%2C4%2C6-tribromophenol+in+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li>
<li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten został opracowany w celu skutecznej identyfikacji biotransformacji ksenobiotyków w roślinach. Krytycznym etapem tego protokołu jest hodowla kalusa roślinnego. Najtrudniejszą częścią jest różnicowanie i utrzymanie kalusa roślinnego, ponieważ kalus roślinny łatwo ulega zakażeniu i rozwija się w tkankach roślinnych. Dlatego ważne jest, aby upewnić się, że cały używany sprzęt jest autoklawowany, a wszystkie operacje są wykonywane w warunkach aseptycznych. Różnicowanie i utrzymanie kalusa rośliny powinno odbywać ...

Coraz więcej zanieczyszczeń organicznych jest wyrzucanych do środowiska z powodu działalności antropogenicznej1,2, a gleba jest uważana za główny pochłaniacz tych zanieczyszczeń3,4. Zanieczyszczenia w glebie mogą być pobierane przez rośliny i potencjalnie przenoszone do organizmów o wyższym poziomie troficznym wzdłuż łańcuchów pokarmowych, bezpośrednio dostając się do organizmu ludzkiego poprzez spożycie plonów, co w konsekwencji prowadzi do niezamierzonego narażenia5,6. Rośliny wykorzystują różne szlaki metabolizowania ksenobiotyków w celu detoksykacji7; Wyjaśnienie metabolizmu ksenobiotyków jest ważne, ponieważ kontroluje faktyczny los zanieczyszczeń w roślinach. Ponieważ metabolity mogą być wydalane przez liście (do atmosfery) lub korzenie, określenie metabolitów w bardzo wczesnych fazach ekspozycji daje możliwość przetestowania rozszerzonej liczby metabolitów8. Jednak badania z wykorzystaniem nienaruszonych roślin wymagają długotrwałych eksperymentów i złożonych protokołów przygotowania próbek, na które mogą mieć wpływ różne czynniki.
Kultury kalusa roślinnego są zatem dobrą alternatywą do badania metabolizmu ksenobiotyków w roślinach, ponieważ mogą znacznie skrócić czas leczenia. Kultury te wykluczają ingerencję mikrobiologiczną i degradację fotochemiczną, upraszczają efekt matrycy nienaruszonych roślin, standaryzują warunki uprawy i wymagają mniej wysiłku eksperymentalnego. Kultury kalusa roślinnego zostały z powodzeniem zastosowane jako alternatywne podejście w badaniach metabolicznych triklosan9, nonylphenol10 i tebukonazol8. Badania te wykazały, że wzorce metaboliczne w kulturach kalusa były podobne do tych w nienaruszonych roślinach. W niniejszym badaniu zaproponowano metodę skutecznej i dokładnej identyfikacji metabolitów ksenobiotyków w roślinach bez skomplikowanych i czasochłonnych protokołów. W tym przypadku używamy kultur kalusa roślinnego w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości do analizy metabolitów z sygnałami o niskiej intensywności11,12.
W tym celu, zawiesiny kalusa marchwi (Daucus carota var. sativus) wystawiono na działanie 100 μg/L 2,4-dibromofenolu przez 120 godzin w wytrząsarce przy 130 obr./min i 26 °C. Wybrano 2,4-dibromofenol ze względu na jego destrukcyjną aktywność endokrynologiczną13 i powszechne występowanie w glebie14. Metabolity wyekstrahowano i przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. Proponowany tutaj protokół może badać metabolizm in planta innych rodzajów związków organicznych, które mogą być zjonizowane.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy</td><td>WAKO</td><td>1 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>20% H2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>10011218-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP, >99%</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP-d4</td><td>Pointe-Claire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-benzyloaminopuryna</td><td>WAKO</td><td>0,5 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>1269101-500ML</td><td></td></tr><tr><td>7890A-5975&nbsp; chromatografia gazowa</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQULTY ultra-performance&nbsp; chromatografia cieczowa</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolki ze szkła bursztynowego</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator sztucznego klimatu</td><td>Ningbo DongNan Lab Equipment Co., LTD</td><td>RDN-1000A-4</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawy</td><td>STIK</td><td>MJ-Series</td><td></td></tr><tr><td>C18</td><td>kolumna ACQUITY UPLC BEH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DB-5MS kolumna kapilarna</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40071190-4L</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>SCIENTZ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wysokowydajna rozdrabniacz do tkanek</td><td>SCIENTZ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicrOTOF-QII spektrometr masowy</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q system Millipore</td><td></td><td>MS1922801-4L</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog medium</td><td>HOPEBIO</td><td>HB8469-7</td><td></td></tr><tr><td>N-heksan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H109658-4L</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do wdmuchiwania azotu&nbsp;</td><td>AOSHENG</td><td>MD200-2</td><td></td></tr><tr><td>Izomery NP, >99%</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oasis Wkłady HLB</td><td>Wody</td><td>60 mg/3 mL</td><td></td></tr><tr><td>Research plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>100-1000 &mikro; L</td></tr><tr><td>Nasiona marchwi drobnopalczastej (Daucus carota var. sativus)&nbsp;</td><td>Shouguang Seed Industry Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potrząsanie&nbsp; Inkubatory</td><td>Shanghai bluepard instruments Co., Ltd.</td><td>THZ-98AB</td><td></td></tr><tr><td>Ekstraktor do faz stałych</td><td>AUTO SCIENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonograf</td><td>ZKI</td><td>UC-6</td><td></td></tr><tr><td>ultra czysty stół warsztatowy sterylizowany promieniami UV</td><td>AIRTECH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wyjaśnienie metabolizmu 2,4-dibromofenolu w roślinach

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

Uprawy mogą być narażone na zanieczyszczenia organiczne, ponieważ gleba jest głównym pochłaniaczem zanieczyszczeń wyrzucanych do środowiska. Stwarza to potencjalne narażenie ludzi poprzez spożywanie żywności nagromadzonej w zanieczyszczeniach. Wyjaśnienie wchłaniania i metabolizmu ksenobiotyków w uprawach ma zasadnicze znaczenie dla oceny ryzyka narażenia z dietą u ludzi. Jednak w przypadku takich eksperymentów użycie nienaruszonych roślin wymaga długotrwałych eksperymentów i złożonych protokołów przygotowania próbek, na które mogą mieć wpływ różne czynniki. Kultury kalusa roślinnego w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS) mogą stanowić rozwiązanie do dokładnej i oszczędzającej czas identyfikacji metabolitów ksenobiotyków w roślinach, ponieważ mogą uniknąć zakłóceń ze strony mikrośrodowiska mikrobiologicznego lub grzybowego, skrócić czas trwania zabiegu i uprościć efekt matrycy nienaruszonych roślin. 2,4-dibromofenol, typowy środek zmniejszający palność i zaburzający funkcjonowanie układu hormonalnego, został wybrany jako substancja modelowa ze względu na jego powszechne występowanie w glebie i zdolność pobierania przez rośliny. W tym przypadku kalus roślinny został wygenerowany z nasion aseptyki i wystawiony na działanie sterylnej pożywki hodowlanej zawierającej 2,4-dibromofenol. Wyniki wykazały, że po 120 godzinach inkubacji w tkankach kalusa roślinnego zidentyfikowano osiem metabolitów 2,4-dibromofenolu. Wskazuje to, że 2,4-dibromofenol był szybko metabolizowany w tkankach kalusa roślinnego. Tak więc platforma do hodowli kalusa roślinnego jest skuteczną metodą oceny pobierania i metabolizmu ksenobiotyków w roślinach.

Kroki protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Zgodnie z protokołem porównaliśmy chromatogram ekstraktu z kalusa marchwi po traktowaniu 2,4-dibromofenolem z grupami kontrolnymi i zidentyfikowaliśmy osiem wyraźnych pików, które występują w próbce traktowanej 2,4-dibromofenolem, a nie występują w kontrolach (Rysunek 2). Wskazuje to, że w kalusie marchwi traktowanym 2,4-dibromofenolem pomyślnie wykryto łącznie osiem metabolitów 2,4-dibromofenolu (M562, M545, M661, M4...

Obecny protokół opisuje prostą i skuteczną metodę identyfikacji metabolitów 2,4-dibromofenolu w roślinach.

Wyjaśnienie metabolizmu 2,4-dibromofenolu w roślinach

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

Kultura kalusa roślinnego zapewnia rozwiązanie do dokładnej, wydajnej i szybkiej oceny metabolicznej degradacji ksenobiotyków w roślinach. Kultura kalusa roślinnego może wykluczyć interferencję mikrobiomu lub grzybów oraz degradację fotochemiczną, uprościć efekt matrycy nienaruszonych roślin, ustandaryzować warunki uprawy, skrócić czas trwania zabiegu i wymagać mniej wysiłku eksperymentalnego. Zaproponowana metoda może dostarczyć informacji na temat absorpcji, zachowań i mechanizmów metabolicznych różnych zanieczyszczeń organicznych w uprawach i jest przydatna w pracach nad oceną ryzyka środowiskowego.Na początek autoklaw całego sprzętu i wykonuj wszystkie operacje na ultra czystym stole roboczym sterylizowanym promieniami UV. Sterylizuj wernalizację powierzchni nasion 75% etanolem przez 20 minut. Opłucz je trzykrotnie sterylną wodą dejonizowaną i ponownie sterylizuj 20% nadtlenkiem wodoru przez 20 minut.Po sześciokrotnym umyciu nasion wysterylizowaną wodą dejonizowaną, należy je asepcie wykiełkować, wysiewając na autoklawowanym, pozbawionym hormonów pożywce Murashige i Skoog o pH 5,8 zawierającej 1% żelu agarowym i inkubować w temperaturze 26 stopni Celsjusza z 16-godzinnym okrese

elucidating-the-metabolism-of-24-dibromophenol-in-plants

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Biomasa roślinna jest głównym neutralnym węglowo zasobem odnawialnym, który może być wykorzystany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu ligniny polifenolowej.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Ten manuskrypt opisuje, jak tempo metabolizmu herbicydów może być skutecznie określone ilościowo za pomocą wyciętych liści z chwastów dwuliściennych, zmniejszając w ten sposób zmienność i usuwając wszelkie możliwe zakłócające efekty pobierania lub translokacji herbicydów, zwykle obserwowane w testach na całej roślinie.

Pomiar tempa metabolizmu herbicydów w chwastach dwuskrzydłowych za pomocą testu wyciętych liści

Poliestry lipidowe stanowią składniki strukturalne dwóch modyfikacji ściany komórkowej, naskórka roślinnego i barier dyfuzyjnych zawierających suberynę. W tym filmie opisujemy metodę depolimeryzacji kutyny z całych zdelipidowanych liści. Metoda ta może być stosowana do badania mutantów upośledzonych w biosyntezie kutyny lub suberyny.

Izolacja i analiza składu monomerów lipidowych poliestrowych naskórków roślin

Przedstawione tutaj protokoły ułatwiają wygodne badanie reakcji bakteryjnych etylenu poprzez wykorzystanie kwasu 2-chloroetylofosfonowego ().  Etylen jest wytwarzany in situ w wyniku rozkładu w wodnym pożywce bakteryjnej, co pozwala obejść wymóg stosowania czystego gazu etylenowego.

Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii

Ta praca przedstawia protokół tworzenia kultury zawiesiny komórkowej pochodzącej z liści herbaty (Camellia sinensis L.), która może być wykorzystana do badania metabolizmu zewnętrznych związków, które mogą być pobierane przez całą roślinę, takich jak insektycydy.

Badanie metabolizmu sześciu ogólnoustrojowych insektycydów w nowo powstałej kulturze zawiesiny komórkowej pochodzącej z herbaty (Camellia Sinensis L.) Liście

Ta metoda wykorzystuje obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) do zrozumienia procesów metabolicznych w liściach S. alba po wystawieniu na działanie ksenobiotyków. Metoda pozwala na przestrzenną lokalizację interesujących związków i ich przewidywanych metabolitów w określonych, nienaruszonych tkankach.

Badanie metabolizmu ksenobiotyków w liściach Salix alba za pomocą obrazowania metodą spektrometrii mas

Przedstawiamy proces izolacji, rozmnażania i charakteryzowania bakterii rozkładających węglowodory z siedlisk wodnych. W protokole opisano izolację bakterii, identyfikację metodą 16S rRNA oraz badanie ich potencjału degradacji węglowodorów. Ten artykuł pomoże naukowcom w scharakteryzowaniu różnorodności biologicznej drobnoustrojów w próbkach środowiskowych, a w szczególności w badaniach przesiewowych pod kątem drobnoustrojów o potencjale bioremediacji.

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Wydzielanie wysięków z korzeni jest zazwyczaj zewnętrzną strategią detoksykacji roślin w warunkach stresu. Protokół ten opisuje, w jaki sposób można ocenić wpływ ksenobiotyków na lucernę za pomocą niecelowanej analizy metabolomicznej.

Pobieranie wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ftalanu di(2-etyloheksylu) na produkcję metabolitów

Protokół opisuje nową metodę oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów triazolowych pestycydów w roślinach.

Ocena cytotoksyczności metabolitów typowych pestycydów triazolowych w roślinach

Rośliny tytoniu zostały użyte do produkcji celulazy grzybowej, TrCel5A, za pomocą systemu ekspresji przejściowej. Ekspresję można było monitorować za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego, a aktywność białka scharakteryzowano po ekspresji.

Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

Odkryj metodę identyfikacji metabolitów 2,4-dibromofenolu w roślinach za pomocą kultury kalusowej. To podejście pozwala ocenić degradację ksenobiotyków przy minimalnym wpływie czynników zewnętrznych.

Wyjaśnienie metabolizmu 2,4-dibromofenolu w roślinach

Przeglądaj więcej filmów