Name: Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę analizy aktywności lokomotorycznej Drosophila przy użyciu oprogramowania Fiji i nagrywania wideo. Ta technika umożliwia badaczom ilościową ocenę prędkości i dystansu w modelach chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez specjalny fundusz startowy z Uniwersytetu Soochow i Narodowej Fundacji Nauki Chin (NSFC) (82171414). Dziękujemy członkom laboratorium prof. Chunfeng Liu za dyskusję i komentarze.

W1118 dorosłych much i larw trzeciego stadium rozwojowego zostały użyte do niniejszego badania.
1. Przygotowanie eksperymentalne
UWAGA: Otwarta arena do śledzenia lokomocji Drosophila wykonana jest z bezbarwnego i bezwonnego żelu krzemionkowego.
<ol>
	<li>Wymieszaj odczynnik A i odczynnik B w stosunku 1:10, zgodnie z instrukcjami producenta zestawu krzemionki (patrz tabela materiałów). Upewnij się, że wodorowęglan sodu został dodany do mieszaniny, mieszając, aż kolor zmieni się na biały. Przenieść mieszaninę na czystą szalkę Petriego i umieścić w piekarniku w temperaturze 40 °C do wyschnięcia na 48 godzin.</li>
	<li>Ustaw kamerę HD (patrz Tabela materiałów) na statywie, regulując ją tak, aby obiektyw kamery był prostopadły do powierzchni areny krzemionkowej. Regulując ogniskową i przysłony aparatu, upewnij się, że kamera jest skupiona na powierzchni krzemionki i że wyświetlacz jest odpowiednio oświetlony. Konfiguracja eksperymentalna jest zilustrowana w Rysunek 1.</li>
	<li>Przenieś muchę na arenę na otwartym polu, aby nagrać ciągły film o długości co najmniej 61 s. 
	UWAGA: Biorąc pod uwagę powolny charakter larw, zalecany jest czas nagrywania wideo dłuższy niż 10 minut.
	<ol>
		<li>Otwórz wideo z Fidżi, przeciągnij pasek postępu do początkowej klatki i milcząco zatwierdź. Wybierz całą bryłę muchy za pomocą narzędzia "zaznaczanie odręczne" (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B,C).</li>
		<li>Kliknij obraz, > dostosować jasność i kontrast >, aby dostosować balans bieli, aż wartość szarości wybranego obszaru zbliży się do szerokiego tła (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D-F). 
		UWAGA: Homogenizacja tła pierwszej klatki umożliwia oprogramowaniu rozróżnienie tła bez żadnych obiektów i stworzenie kontrastu, gdy obecna jest mucha, umożliwiając w ten sposób oprogramowaniu jej śledzenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj cały eksperyment w środowisku testowym ustawionym na 25 °C i 60% wilgotności względnej, w miejscu, które jest ciche i pozbawione ekspozycji na jasne światło.</li>
</ol>
2. Nagrywanie wideo i wstępne przetwarzanie
<ol>
	<li>Po krótkim okresie znieczulenia przy użyciu 95% dwutlenku węgla (CO2), przenieś muchę na otwartą arenę i naciśnij przycisk nagrywania w aplikacji kamery, aby rozpocząć nagrywanie wideo. 
	UWAGA: Aby zminimalizować wpływ środka znieczulającego na poruszanie się, pozwól muszkom dojść do siebie przez 10 minut przed rozpoczęciem nagrywania wideo. Zaleca się również znieczulenie na zimno przez schłodzenie.
	<ol>
		<li>Gdy muchy dojdą do siebie po znieczuleniu, umieść naczynie z muchą pod kamerą i szybko potrząśnij płytką z boku na bok, aby upewnić się, że mucha jest w ruchu, gdy rozpocznie się nagrywanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu nagrywania naciśnij przycisk stop, aby zakończyć nagrywanie wideo. 
	UWAGA: Upewnij się, że czas nagrywania wideo nieznacznie przekracza czas śledzenia miejsca docelowego z niewielkim marginesem. Ponadto, aby poprawić wydajność eksperymentu, możliwe jest spontaniczne śledzenie wielu much. Zależy to od rozdzielczości kamery, aby umożliwić przycinanie wideo w wysokiej jakości.</li>
	<li>Konwertuj nagrane filmy do formatu AVI z kodowaniem MJPEG, aby można je było otwierać i analizować za pomocą Fidżi. W międzyczasie ustaw liczbę klatek na sekundę (fps) wideo na 15 kl./s dla dorosłych much i 12 kl./s dla larw.</li>
</ol>
3. Analiza wideo
<ol>
	<li>Otwórz wideo, które zostało przekształcone za pomocą "użyj wirtualnego stosu" i "konwertuj na skalę szarości", dwóch opcji w wyskakującym okienku podczas otwierania wideo za pomocą Fidżi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Zrób pustą pierwszą klatkę, jak wspomniano powyżej.</li>
	<li>Uzyskaj okno przetwarzania za pomocą narzędzia "ustaw aktywny obraz" wtyczki AnimalTracker i utwórz obszar śledzenia, który okrąża arenę w oryginalnym oknie wideo za pomocą narzędzia "owalny" (Rysunek 3A).</li>
	<li>Ustaw filtry (Rysunek 3A,3) i parametry dwóch filtrów (Rysunek 4A-G) dla pierwszej pustej klatki w oknie przetwarzania. Następnie zaznacz następną klatkę w oryginalnym oknie wideo i wybierz przefiltrowaną powierzchnię okna przetwarzania (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A-C). 
	UWAGA: Krok filtrowania służy do zmniejszenia szumu obrazu i/lub usunięcia tła, ułatwiając w ten sposób oddzielenie pierwszego planu od tła w binaryzacji klatek.</li>
	<li>Po wybraniu przefiltrowanego okna przetwarzania, obróć śledzoną muchę z czerwonym profilem zakrytym w oknie przetwarzania za pomocą narzędzia "ustaw próg" (Rysunek 3A,4, <silna klasa="xfig">Rysunek 5D-E i <silna klasa="xfig">Rysunek 6A).</li>
	<li>Użyj opcji "set blob-detector", aby komputer rozpoznał muchę z czerwonym profilem pokrytym w oknie przetwarzania (Rysunek 3A,5 i Rysunek 6B).</li>
	<li>Ustaw klatkę 901 jako ostatnią klatkę dla dorosłej muchy, obliczaną na podstawie czasu nagrywania filmu i liczby klatek na sekundę (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A,6, <silna klasa="xfig">Rysunek 6C). 
	UWAGA: Poniższy eksperyment z larwami był śledzony przez 10 minut, więc klatka 7200 jest ustawiona jako ostatnia klatka.</li>
	<li>Użyj narzędzia "pokaż bloby", aby wyświetlić prostokąt śledzenia w oryginalnym oknie wideo (Rysunek 3A,7 i Rysunek 6D,E). Następnie rozpocznij śledzenie i wyeksportuj plik śledzenia po zakończeniu monitorowania (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A,8,9 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 7A,B).</li>
</ol>
4. Analiza pliku śledzenia
<ol>
	<li>Załaduj pliki śledzenia i strefy za pomocą wtyczki Animal tracker > Tracking analyzer (Rysunek 8A).</li>
	<li>Wybierz żądany indeks za pomocą ustawień strefy i zmień ustawienia parametrów (Rysunek 8). Oblicz czas interwału klatek, używając liczby klatek na sekundę. 
	UWAGA: W tym stanie liczba klatek na sekundę wynosi 15 kl./s, a interwał klatek wynosi około 0,067 s, co jest ustawieniem domyślnym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 8D).</li>
	<li>Utwórz wykresy analizy ilościowej za pomocą oprogramowania arkusza kalkulacyjnego i GraphPad Prism po przeanalizowaniu w analizatorze śledzenia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 9).</li>
</ol>
5. Analiza na klatkę
<ol>
	<li>Wykonaj analizę prędkości dla interwału klatek. Przeanalizuj plik śladów bez Fidżi, jeśli potrzebne są bardziej szczegółowe badania.
	<ol>
		<li>Otwórz plik ścieżki, skopiuj wszystkie współrzędne do programu Microsoft Office Excel i podziel komórki za pomocą spacji. 
		UWAGA: Na przykład, po podzieleniu pliku na kolumny "C" i "D", prędkość Drosophila na interwał klatki jest obliczana według wzoru SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2), który jest pokazany w kolumnie "E" (<silna klasa="xfig">Rysunek 10A). Dane w kolumnie "E" wskazują liczbę pikseli, o ile mucha przesunęła się między dwiema klatkami, przy czym pierwsza klatka nie jest brana pod uwagę. Zaznacz wszystkie obliczone wyniki i wstaw wykres liniowy, aby pokazać intuicyjną prędkość ruchu muchy na interwał klatki, ze szczytem na wykresie liniowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 10B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie czasu bezruchu na interwał klatki. Po podzieleniu pliku na kolumny "C" i "D" oblicz stan bezruchu Drosophila na interwał ramki, korzystając ze wzoru IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), który jest pokazany w kolumnie "E". (<silna klasa="xfig">Rysunek 10C). 
	UWAGA: W przeciwieństwie do analizy prędkości, wyniki pierwszej klatki zostały zdefiniowane. Muchy, które poruszały się o mniej niż 20 pikseli, były uważane za nieruchome i zapisywane jako "0" w kolumnie "E".
	<ol>
		<li>Zaznacz wszystkie obliczone wyniki i wstaw wykres kolumnowy, aby wizualnie pokazać czas bezruchu na marginesie całego wykresu kolumnowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 10D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że zmienia się kąt kierunku. 
	UWAGA: Analiza kąta zmiany kierunku reprezentuje wybór kierunku przez muchy. Po podzieleniu pliku na kolumny "C" i "D" kąt zmiany kierunku oblicza się według wzoru ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), która jest zaprezentowana w kolumnie "E" (<silna klasa="xfig">Rysunek 10E). Obliczone wyniki wskazują kąt między trzema współrzędnymi.
	<ol>
		<li>Zaznacz wszystkie obliczone wyniki i wstaw diagram punktowy, aby zilustrować kąt zmiany kierunku ruchu much (<silna klasa="xfig">Rysunek 10F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ham, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+UCHL1+rescues+the+defects+related+to+Parkinson%27s+disease+by+suppressing+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis.</a> Science Advances. 7 (28), (2021).</li>
<li>Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+and+preimaginal+exposure+to+methylmercury+disrupts+locomotor+activity+and+circadian+rhythm+of+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster.</a> Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).</li>
<li>Jones, M. A., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+age-related+impairment+in+locomotor+and+other+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors.</a> Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).</li>
<li>Yamaguchi, M., Yoshida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model organism.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).</li>
<li>Rothenfluh, A., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs%2C+files%2C+and+videotape%3A+the+effects+of+ethanol+and+cocaine+on+Drosophila+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).</li>
<li>Tsuda, L., Lim, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+model+system+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease model system using Drosophila.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).</li>
<li>Dung, V. M., Thao, D. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 41-61 (2018).</li>
<li>Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly+for+ALS%3A+Drosophila+modeling+on+the+route+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).</li>
<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+rapid+iterative+negative+geotaxis+assay+for+analyzing+adult+climbing+behavior+in+a+Drosophila+model+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), 56507(2017).</li>
<li>Eidhof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+locomotor+behavior+in+the+Drosophila+island+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 55892(2017).</li>
<li>Scaplen, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+quantification+of+group+locomotor+activity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4427(2019).</li>
<li>Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARGO+%28Massively+Automated+Real-time+GUI+for+Object-tracking%29%2C+a+platform+for+high-throughput+ethology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology.</a> PLoS One. 14 (11), e0224243(2019).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).</li>
<li>Cichewicz, K., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShinyR-DAM%3A+a+program+analyzing+Drosophila+activity%2C+sleep+and+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms.</a> Communications Biology. 1, 25(2018).</li>
<li>McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+larval+activity+in+the+Drosophila+activity+monitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52684(2015).</li>
<li>Walter, T., Couzin, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRex%2C+a+fast+multi-animal+tracking+system+with+markerless+identification%2C+and+2D+estimation+of+posture+and+visual+fields%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields.</a> eLife. 10, (2021).</li>
<li>Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%82%AC100+lab%3A+A+3D-printable+open-source+platform+for+fluorescence+microscopy%2C+optogenetics%2C+and+accurate+temperature+control+during+behaviour+of+zebrafish%2C+Drosophila%2C+and+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 15 (7), e2002702(2017).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+the+behavior+of+Drosophila+melanogaster+for+toxicity+study%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study.</a> Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%3A+their+ability+to+reproduce+the+features+of+clinical+disease+and+model+gene-environment+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions.</a> Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).</li>
<li>Coulom, H., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+rotenone+models+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).</li>
<li>Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotenone+mediated+developmental+toxicity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892(2022).</li>
<li>Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnimalTracker%3A+an+ImageJ-based+tracking+API+to+create+a+customized+behaviour+analyser+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program.</a> Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).</li>
<li>Qu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EasyFlyTracker%3A+a+simple+video+tracking+Python+package+for+analyzing+adult+Drosophila+locomotor+and+sleep+activity+to+facilitate+revealing+the+effect+of+psychiatric+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665(2022).</li>
<li>Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+data+collection+of+Drosophila+movement+behaviour+assays+using+computer+vision+in+Python%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Innovative+Approaches+in+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python.</a> International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zaprojektowaliśmy metodę, opartą na materiale open source AnimalTracker API kompatybilnym z programem do przetwarzania obrazów Fidżi, która może umożliwić naukowcom systematyczną ocenę aktywności lokomotorycznej poprzez śledzenie zarówno dorosłych, jak i pojedynczych larw much. AnimalTracke to narzędzie napisane w Javie, które można łatwo zintegrować z istniejącymi bazami danych lub innymi narzędziami ułatwiającymi analizę zachowań związanych ze śledzeniem zwierząt zaprojektowanych przez aplikację<sup c...

Drosophila melanogaster stanowi doskonały organizm modelowy do badania funkcji komórkowych i molekularnych w modelach chorób neuronalnych stworzonych przez modyfikację genów1, leczenie farmakologiczne2, oraz senescence3. Wysoka ochrona szlaków biologicznych, właściwości fizycznych i związanych z chorobą homologicznych genów między ludźmi a Drosophila sprawia, że muszka owocowa jest idealnym naśladowcą od poziomu molekularnego do behawioralnego4. W wielu modelach chorób niedobór behawioralny jest ważnym wskaźnikiem, stanowiącym pomocny model dla różnych ludzkich neuropatii5,6. Drosophila jest obecnie wykorzystywana do badania wielu chorób ludzkich, rozwoju neurologicznego i chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona i stwardnienie zanikowe boczne7,8. Wykrycie zdolności motorycznych modeli choroby ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia postępu choroby i może zapewnić fenotypową korelację z mechanizmami molekularnymi leżącymi u podstaw procesu chorobowego.
Ostatnio opracowano dostępne na rynku narzędzia programowe i opłacalne programy do wykrywania lokomotorycznego Drosophila, takie jak testy o wysokiej przepustowości u zgrupowanych much9,10 i pomiar lokomocji w czasie rzeczywistym11,12. Jednym z takich konwencjonalnych podejść jest szybka interaktywna geotaksja ujemna (RING), zwana również testem wspinaczkowym, która obejmuje wiele kanałów, które pozwalają na powstrzymanie dużej populacji much tej samej płci i wieku, zmniejszając zmienność podczas zbierania danych9,13. Inną metodą wstępnego testowania do analizy zachowań lokomotorycznych jest TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), urządzenie, które wykorzystuje wiele wiązek do wykrywania ruchu aktywności much w cienkiej szklanej rurce14. Urządzenie rejestruje pozycję w sposób ciągły, co reprezentuje zautomatyzowaną lokomocję poprzez obliczanie przecięć wiązki w celu zbadania aktywności i rytmu dobowego much w dłuższym okresie czasu15. Chociaż metody te są szeroko stosowane w analizie wad behawioralnych u muszek owocowych w celu określenia zmian w lokomocji behawioralnej, zawsze wymagają specjalnego sprzętu testowego lub złożonych procesów analitycznych i ograniczają ich zastosowanie w niektórych modelach za pomocą ograniczonego, prostego urządzenia. Grupowe strategie śledzenia zwierząt do testowania dorosłych osobników Drosophila, takie jak FlyGrAM11 i Drosophila island assay10, implementują rekrutację społeczną i śledzenie indywidualne na wcześniej zdefiniowanym obszarze. Niemniej jednak społeczne ograniczenia indywidualne w obszarach zagrożonych mogą mieć negatywny wpływ na identyfikację na obrazach, spowodowany kolizją lub nakładaniem się much. Mimo że niektóre metody oparte na materiałach typu open source, takie jak TRex16, MARGO12 i FlyPi17, mają sytuację awaryjną, mogą przyspieszyć śledzenie much dzięki elastycznemu zastosowaniu w testach behawioralnych. Te podejścia testowe są związane ze skomplikowanymi instalacjami aparatury eksperymentalnej, specjalnymi wymaganiami dotyczącymi oprogramowania lub profesjonalnymi językami komputerowymi. W przypadku larw, pomiar całkowitej odległości przebytej przez liczbę linii granicznych siatki w jednostce czasu18, lub zgrubne liczenie skurczów ścian ciała u osobników ręcznie19, są dominującymi metodami oceny ich zdolności lokomotorycznych. Ze względu na brak precyzji w sprzęcie lub urządzeniach i metodach analizy, niektóre lokomocja behawioralna larw może uniknąć wykrycia, co utrudnia dokładną ocenę ruchu behawioralnego, zwłaszcza drobnego ruchu15.
Aktualnie opracowana metoda wykorzystuje interfejs programowania aplikacji AnimalTracker (API), kompatybilny z programem do przetwarzania obrazów Fidżi (ImageJ), do systematycznej oceny aktywności lokomotorycznej zarówno dorosłych, jak i larw much, analizując ich zachowanie na podstawie filmów w wysokiej rozdzielczości (HD). Fiji to dystrybucja ImageJ o otwartym kodzie źródłowym, która może łączyć solidne biblioteki oprogramowania z wieloma językami skryptowymi, co skutkuje szybkim prototypowaniem algorytmów przetwarzania obrazu, co czyni ją popularną wśród biologów ze względu na możliwości analizy obrazu20. W obecnym podejściu, integracja Fidżi z API AnimalTracker jest wykorzystywana do opracowania unikalnego testu behawioralnego Drosophila ze spersonalizowanym wstawieniem algorytmu i stanowi użyteczny krok dla szczegółowej dokumentacji i samouczków wspierających solidne możliwości analityczne zachowania lokomotorycznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Aby obejść komplikacje związane z obiektywnymi identyfikacjami na obrazach spowodowanymi zderzeniem lub nakładaniem się much, każda arena jest ograniczona do goszczenia tylko jednej muchy. Po ocenie precyzji śledzenia tego podejścia, wdrożono je w celu śledzenia i ilościowego określenia ruchów lokomotorycznych Drosophila, które były podawane z toksycznym lekiem rotenonem, który jest zwykle stosowany w zwierzęcych modelach choroby Parkinsona, ostatecznie odkrywając upośledzenie lokomocji w leczeniu farmakologicznym21. Ta metodologia, która wykorzystuje otwarte i wolne oprogramowanie, nie wymaga kosztownego oprzyrządowania i może precyzyjnie i powtarzalnie analizować lokomocję behawioralną Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Lokalizator zwierząt</td><td>Węgierski Program Badań nad Mózgiem</td><td>Wersja: 1.7</td><td>Strona internetowa: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads</td></tr><tr><td>Oprogramowanie kamery</td><td>Wersja Microsoft</td><td>: 2021.105.10.0</td><td>Wbudowany system Windows 10</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>DELL</td><td>Vostro-14-5480</td><td>Dostępny jest komputer z systemem Win 10</td></tr><tr><td>Stacja robocza do znieczulenia dwutlenkiem węgla Drosophila</td><td>Wu han Yihong technology</td><td>#YHDFPCO2-018</td><td>oficjalna strona internetowa: http://www.yhkjwh.com/</td></tr> <tr><td>Fiji software</td> Wersja <td>zespołu Fidżi</td><td>: 1.53v</td><td>oficjalna strona: https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>Format oprogramowania fabrycznego</td><td>Wersja Pcfreetime</td><td>: X64 5.4.5</td><td>oficjalna strona: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html</td></tr><tr><td>Pryzmat graficzny</td><td>GraphPad Wersja oprogramowania</td><td>: 8.0.2</td><td>oficjalna strona: https://www.graphpad-prism.cn</td></tr><tr><td>Kamera o wysokiej rozdzielczości</td><td>TTQ</td><td>Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)</td><td>oficjalna strona: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Office</td><td>Wersja Microsoft</td><td>: office 2019</td><td>oficjalna strona: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Rozmiar 110301003 Bkmana</td><td></td><td>: 60 mm</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy</td><td>DOW</td><td>SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dobrze wymieszaj zgodnie z instrukcją</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Macklin</td><td>#144-55-8</td><td>Dobrze wymieszaj z żelem krzemionkowym</td></tr></tbody></table>

prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u drosophila

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster jest idealnym organizmem modelowym do badania różnych chorób ze względu na obfitość zaawansowanych technik manipulacji genetycznej i różnorodne cechy behawioralne. Identyfikacja niedoborów behawioralnych w modelach zwierzęcych jest kluczową miarą ciężkości choroby, na przykład w chorobach neurodegeneracyjnych, w których pacjenci często doświadczają upośledzenia funkcji motorycznych. Jednak ze względu na dostępność różnych systemów do śledzenia i oceny deficytów motorycznych w modelach muchowych, takich jak osoby leczone farmakologicznie lub transgeniczne, nadal brakuje ekonomicznego i przyjaznego dla użytkownika systemu do precyzyjnej oceny pod wieloma kątami. Opracowano tutaj metodę opartą na interfejsie programowania aplikacji (API) AnimalTracker, która jest kompatybilna z programem do przetwarzania obrazów Fidżi, w celu systematycznej oceny aktywności ruchowej zarówno osobników dorosłych, jak i larwalnych na podstawie nagranego wideo, umożliwiając w ten sposób analizę ich zachowań związanych ze śledzeniem. Ta metoda wymaga jedynie kamery o wysokiej rozdzielczości i integracji sprzętu peryferyjnego do rejestrowania i analizowania zachowania, co czyni ją niedrogim i skutecznym podejściem do badań przesiewowych modeli much z transgenicznymi lub środowiskowymi brakami behawioralnymi. Podano przykłady testów behawioralnych z wykorzystaniem much leczonych farmakologicznie, aby pokazać, w jaki sposób techniki te mogą wykrywać zmiany behawioralne zarówno u dorosłych much, jak i larw w wysoce powtarzalny sposób.

W niniejszym badaniu zbadano deficyty lokomocyjne u dorosłych much oraz larw trzeciego stadium traktowanych rotenonem i porównano ich aktywność ruchową z aktywnością much kontrolnych karmionych rozpuszczalnikiem leku, dimetylosulfotlenkiem (DMSO). Wykazano, że traktowanie Drosophila rotenonem powoduje utratę neuronów dopaminergicznych w mózgu22 i prowadzi do znaczących deficytów lokomocyjnych23. Jak pokazano na Rysunku 11 oraz <strong ...

Obecny protokół ocenia aktywność lokomotoryczną Drosophila poprzez śledzenie i analizowanie ruchu much na ręcznie wykonanej arenie za pomocą oprogramowania typu open source Fiji, kompatybilnego z wtyczkami do segmentacji pikseli każdej klatki na podstawie nagrania wideo w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia parametrów prędkości, odległości itp.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Metoda opiera się na oprogramowaniu open source do systematycznej oceny lokalnej aktywności motorycznej pod kątem śledzenia zachowań dorosłych i larw much z nagranego wideo. Ta metoda wymaga taniej integracji urządzeń w celu rejestrowania i analizowania zachowań, co czyni ją niedrogim i skutecznym podejściem do badania lokomocji much. Technologia ta jest wykorzystywana do identyfikacji modyfikacji behawioralnej w modelu muchy choroby człowieka z miejscowym upośledzeniem ruchu, ale nie nadaje się do leczenia chorób, niepełnosprawności lub trudności.Konieczne jest wyczyszczenie odpowiedniego okna wideo podczas procesu analizy, a mianowicie oryginalnego i okna przetwarzania wideo. Na początek wymieszaj odczynnik A i odczynnik B z zestawu krzemionki w stosunku od 1 do 10, zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować arenę na otwartym polu do śledzenia lokomocji Drosophila. Następnie ustaw kamerę HD na statywie, regulując ją tak, aby obiektyw kamery był prostopadły do powierzchni areny krzemionkowej.Następnie otwórz wideo z Fidżi. Przeciągnij pasek postępu do początkowej ramki i milcząco zatwierdź. Wybierz całą bryłę muchy za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego.Kliknij obraz, dostosuj oraz jasność i kontrast, aby dostosować balans bieli, aż wartość szarości wybranego obszaru zbliży się do szerokiego tła. Przenieś znieczuloną muchę na arenę na otwartym polu. Gdy mucha wyzdrowieje ze znieczulenia, umieść miskę z muchą pod kamerą i szybko potrząśnij nią z boku na bok, aby upewnić się, że mucha jest w ruchu, gdy rozpocznie się nagrywanie.Naciśnij przycisk nagrywania w aplikacji aparatu, aby rozpocząć nagrywanie wideo. Po zakończeniu nagrywania naciśnij przycisk stop, aby zakończyć nagrywanie wideo. Konwertuj nagrane filmy do formatu AVI z pogańskim kodowaniem MJ, aby można je było otwierać i analizować za pomocą Fidżi.Ustaw także liczbę klatek na sekundę wideo na 15 kl./s dla dorosłych much i 12 kl./s dla larw. Aby otworzyć wideo z Fidżi, wybierz dwie opcje, użyj wirtualnego stosu i przekonwertuj na skalę szarości w wyskakującym okienku. Uzyskaj okno przetwarzania za pomocą narzędzia do ustawiania aktywnego obrazu wtyczki do śledzenia zwierząt i utwórz obszar śledzenia, który okrąża arenę w oryginalnym oknie wideo, za pomocą narzędzia owalnego.Ustaw filtry i parametry dwóch filtrów dla pierwszej pustej ramki w oknie przetwarzania. Następnie zaznacz następną klatkę w oryginalnym oknie wideo i wybierz przefiltrowaną powierzchnię okna przetwarzania. Po wybraniu przefiltrowanego okna przetwarzania użyj narzędzia do ustawiania progu, aby obrócić muchę traktu z czerwonym profilem, zakrytym w oknie przetwarzania.Następnie użyj ustawionego detektora blobów, aby komputer mógł rozpoznać muchę z czerwonym profilem, zakrytym w oknie przetwarzania. Ustaw ostatnią klatkę dla dorosłej muchy lub larw, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Użyj narzędzia show blobs, aby przedstawić prostokąt śledzenia w oryginalnym oknie wideo.Rozpocznij śledzenie i wyeksportuj plik śledzenia po zakończeniu monitorowania. Załaduj pliki śladów i stref za pomocą wtyczki do śledzenia zwierząt i analizatora śledzenia. Wybierz żądany indeks za pomocą ustawień strefy i zmień ustawienia parametrów.Oblicz czas interwału klatek, korzystając z liczby klatek na sekundę. Twórz wykresy analizy ilościowej za pomocą oprogramowania arkusza kalkulacyjnego i pryzmatu wykresu, po przeanalizowaniu w analizatorze śledzenia. Otwórz plik utworu.Skopiuj wszystkie współrzędne do programu Microsoft Office Excel i podziel komórki za pomocą spacji. Aby obliczyć czas uruchomienia na interwał klatki, zaznacz wszystkie obliczone wyniki i wstaw wykres kolumnowy, aby wizualnie przedstawić czas unieruchomienia na marginesie całego wykresu kolumnowego. Aby zilustrować zmiany kąta kierunku, zaznacz wszystkie obliczone wyniki i wstaw diagram punktowy.Dorosłe muchy i larwy trzeciego stadium rozwojowego, leczone rotenonem, miały znaczne deficyty lokomotoryczne w porównaniu z muszkami kontrolnymi, karmionymi rozpuszczalnikiem DMSO. Analiza ilościowa leczenia rotenonem u dorosłych muszek wykazała znaczny spadek przebytej odległości i średniej prędkości. I znaczne wydłużenie czasu bezruchu.Reprezentatywne wykresy wykazały mniej szczytów prędkości ruchu na interwał klatki u muszek karmionych rotenonem w porównaniu z tymi w kontroli, co wskazuje na nasilenie deficytu aktywności lokomotorycznej. Instytucjonalna kolumna bezruchu przesuniętych pikseli na klatkę wykazała również znacznie mniejszy ruch w ciągu jednej minuty dla muszek karmionych rotenonem w porównaniu z muchami kontrolnymi. Reprezentatywne wykresy ilustrujące kąt ruchu zmian kierunku u zwierząt karmionych rotenonem i kontrolnych ujawniły również zmiany w kierunku wybranym przez muchy.Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku trzeciej larwy Instar. Wyniki ujawniły, że ruch behawioralny larw śledzących karmionych rotenonem był znacznie upośledzony w porównaniu z kontrolą. Najważniejszym krokiem w procesie analizy jest utworzenie pierwszej z pustych ramek, ponieważ świadczy to o tym, czy oprogramowanie może skutecznie sprawdzić.Technologia ta może pozwolić naukowcom na głębsze zagłębienie się w mechanizm leżący u podstaw wielu defektów, takich jak uszkodzenie nerwów lub mięśni.

a-simple-technique-to-assay-locomotor-activity-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Badanie złożonych zachowań lokomocyjnych u Drosophila melanogaster zależy od możliwości ilościowego określenia zmian w ruchu danej muchy. Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzić ten proces przy użyciu wysokorozdzielczego systemu śledzenia.

Wysokorozdzielcze śledzenie wideo lokomocji u dorosłych osobników Drosophila melanogaster

Opisujemy procedury rejestracji dobowych rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila oraz późniejszej analizy danych. Rytmy aktywności lokomocyjnej są wiarygodnym behawioralnym wskaźnikiem zegarów okołodobowych zwierząt i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara podczas badania mutantów okołodobowych lub analizowania wpływu środowiska na regulację systemu okołodobowego.

Oznaczanie aktywności lokomotorycznej w celu badania rytmów okołodobowych i parametrów snu u Drosophila

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Ten film opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania lokomocji muchy i pokazuje przeprowadzony test wspinaczki. Test wspinaczki muchowej jest ogólnym testem funkcji motorycznych, który opiera się na negatywnej odpowiedzi geotaksji.

Test wspinaczki muchowej: metoda testowania ogólnej lokomocji u Drosophila melanogaster

Ten film opisuje, jak śledzić swobodnie chodzące muchy, aby ocenić ich ogólną zdolność poruszania się. Prezentowany protokół demonstruje konfigurację testu i analizę danych za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.

Śledzenie swobodnie chodzących much: metoda oceny lokomocji u Drosophila

Ten film opisuje system monitorowania aktywności Drosophila (DAM) używany do śledzenia aktywności lokomotorycznej. Naukowcy wykorzystują dane dotyczące aktywności zebrane z DAM do badania rytmów okołodobowych u muszek owocowych. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak ładować muchy do urządzenia i rejestrować dane dotyczące aktywności do eksperymentów okołodobowych.

Drosophila Monitor aktywności (DAM): metoda pomiaru aktywności lokomotorycznej u much

Tutaj opisujemy metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe.

Ulepszona metoda dokładnego i szybkiego pomiaru charakterystyki lotu u Drosophila

Drosophila melanogaster są przydatne w badaniu manipulacji genetycznych lub środowiskowych, które wpływają na zachowania takie jak spontaniczna aktywność lokomotoryczna. Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje monitory z wiązkami podczerwieni i oprogramowanie do analizy danych do ilościowego określania spontanicznej aktywności lokomotorycznej.

Oznaczanie spontanicznej aktywności lokomotorycznej u Drosophila melanogaster

Korzystając z kamery internetowej oraz kombinacji darmowych i niedrogich programów, wzorce lokomotyw u Drosophila melanogaster mogą być analizowane w celu wykrycia różnic w prędkości, odległości i czasie różnych aktywności motorycznych.

Tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u Drosophila

Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.

Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Poznaj metodę analizy aktywności lokomotorycznej Drosophila przy użyciu oprogramowania Fiji i nagrywania wideo. Ta technika umożliwia badaczom ilościową ocenę prędkości i dystansu w modelach chorób.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów