Name: Zgodna z GMP procedura wytwarzania limfocytów T modyfikowanych genetycznie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę transdukcji limfocytów T zgodną z GMP, stosującą ludzkie komórki PBMC. Ta technika umożliwia efektywne wytwarzanie terapii CAR T-cell w sposób ekonomiczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania te były współfinansowane przez Unię Europejską i greckie fundusze krajowe poprzez Program Operacyjny Konkurencyjność, Przedsiębiorczość i Innowacje, w ramach zaproszenia RESEARCH - CREATE - INNOVATE (kod projektu: T2EDK - 00474). Pragniemy również wyrazić naszą wdzięczność Fundacji Choose Life za nieustanne wsparcie dla Laboratorium GMP "Dimitris Lois" Instytutu Terapii Komórkowej.

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Uniwersytetu w Patras oraz Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersyteckiego Szpitala Ogólnego w Patras. Przed uzyskaniem próbek biologicznych uzyskano świadomą zgodę od osób zdrowych. Ocena kwalifikowalności uczestników została przeprowadzona zgodnie z procedurami instytucjonalnymi i zgodnie ze standardami JACIE dotyczącymi leukaferezy. Jeśli protokół ten ma zostać wdrożony w warunkach klinicznych ACT, wszystkie procedury muszą być zgodne z wytycznymi Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP) i być wykonywane w pomieszczeniach czystych zgodnych z GMP. Podczas pracy z wektorami wirusowymi konieczne są specjalne środki ostrożności, a procedury te powinny być przeprowadzane w dedykowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego. W tym badaniu opisane procedury przeprowadzono w zwalidowanej hipoksystacji H35 HEPA (patrz tabela materiałów) w celu zapewnienia kontrolowanego i monitorowanego środowiska. Odkażanie wszystkich niebezpiecznych płynów powinno odbywać się przy użyciu 10% roztworu wybielacza.
1. Izolacja PBMC i aktywacja limfocytów T (Dzień 0)
<ol>
	<li>Zebrać komórki z worka do aferezy dawcy (leukopaks, patrz tabela materiałów) do probówek o pojemności 50 ml, w zależności od objętości początkowej.</li>
	<li>Wykonaj dwa płukania worka na komórki, podając 15 ml kompletnego podłoża krwiotwórczego (+5% HSA, komercyjne podłoże krwiotwórcze bez surowicy, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przeprowadzić wirowanie w gradiencie gęstości na bazie polisacharydów w rozcieńczeniu 1:2 (odczynnik: próbka). Wirować przy 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej z przerwami (A/D, 9/0).</li>
	<li>Za pomocą mikropipety zebrać PBMC do czystej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie 1x PBS, napełniając do 50 ml na każde pranie (400 x g, 10 min, temperatura pokojowa). Ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego, używając standardowego hemocytometru lub automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki kompletną pożywką, aby uzyskać stężenie 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Aktywuj 20 x 106 PBMC, dodając 10 μl odczynnika do stymulacji limfocytów T (patrz tabela materiałów) na 2 x 106 komórek wyjściowych. 
	UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony do aktywacji 20 x 106 PBMC, ale w razie potrzeby można go dostosować do większej liczby komórek.</li>
	<li>Dodać rhIL-2 (20 U/ml) (patrz Tabela Materiałów), delikatnie wymieszać i przenieść mieszaninę do odpowiedniego naczynia (np. płytki 6-dołkowej).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 72 godziny.</li>
</ol>
2. Transdukcja limfocytów T lentiwirusowych (Dzień 3)
<ol>
	<li>Przenieś kulturę komórkową do odpowiedniego naczynia, takiego jak stożkowa probówka o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszać i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu usunięcia odczynnika aktywacyjnego. Ostrożnie całkowicie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża. 
	UWAGA: Na tym etapie możliwe jest rozmrożenie wirusa na lodzie.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w kompletnym podłożu, aby uzyskać stężenie, które pozwala na posiew 0,5 x 106 komórek w całkowitej objętości 400 μl na studzienkę na płytce 24-dołkowej. Dodać rhIL-7 (155 U/ml) i rhIL-15 (290 U/ml) (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Upewnij się, że uwzględniłeś ilość wirusów, które mają zostać dodane. Patrz krok 2.4.</li>
	<li>W osobnej probówce dodać wektofusynę-1 (patrz tabela materiałów) do pożywki Opti-MEM w stężeniu 10 μg/ml, o objętości równej objętości wirusa, która ma być użyta. 
	UWAGA: Przy obliczaniu stężenia wektofusyny-1 należy wziąć pod uwagę całkowitą objętość kultury komórkowej. Patrz krok 2.3. Alternatywnie, Vectofusin-1 GMP może być stosowany jako odczynnik klasy GMP.</li>
	<li>Połączyć skoncentrowany wirus w liczbie infekcji (MOI) 40 z mieszaniną Vectofusin-1/Opti-MEM (w stosunku 1:1) i dokładnie wymieszać. Dodać tę mieszaninę do hodowli komórkowej i w razie potrzeby dostosować całkowitą objętość do 400 μl na studzienkę, używając kompletnej pożywki.</li>
	<li>Umieścić pokrywkę na płytce, uszczelnić folią parafinową i odwirować przy 1000 x g przez 2 godziny w temperaturze 32 °C. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.</li>
</ol>
3. Usuwanie wirusa i ekspansja limfocytów T (Dzień 4)
<ol>
	<li>Zbierz komórki i umieść je w odpowiednim naczyniu, takim jak probówka o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut. Ostrożnie całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego. Zawiesić komórki w kompletnym pożywce w stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Dodać rhIL-7 (155 U/ml) i rhIL-15 (290 U/ml) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieść komórki do odpowiedniego naczynia, takiego jak kolba T25, o stężeniu 0,3-0,5 x 106 komórek/cm2 i inkubować je w temperaturze 37 °C, 5% CO2, przez 2 dni><.
	UWAGA: Jeśli wymagana jest większa populacja komórek, komórki mogą być hodowane (1:2) w obecności rhIL7 i rhIL-15 co 2 dni, zgodnie z tymi samymi warunkami inkubacji, o których mowa powyżej, aż do osiągnięcia pożądanej liczby komórek.</li>
</ol>
4. Kriokonserwacja (Dzień 14)
UWAGA: Lód będzie wymagany do przeniesienia kriowiali do miejsca przechowywania podczas tego kroku. Czas kriokonserwacji zależy od pożądanej liczby komórek. W przypadku tego protokołu kriokonserwację przeprowadza się w 14 dniu po osiągnięciu 25-krotnej ekspansji.
<ol>
	<li>Po osiągnięciu żądanej liczby komórek zbierz komórki i przenieś je do probówek o pojemności 50 ml (dostosuj liczbę probówek w zależności od całkowitej objętości).</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 400 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut. Ostrożnie całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki. W razie potrzeby połącz komórki z wielu probówek.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego. Zachowaj podwielokrotność 1 x 106 komórek dla każdego badania kontroli jakości (QC) (patrz sekcja 5) w celu oceny liczby kopii wektorów i wydajności transdukcji.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. W tym momencie odpowiednio oznacz kriowiale.</li>
	<li>Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w roztworze do kriokonserwacji składającym się z 50% HSA i 40% HBSS w stężeniu 1 x 107 komórek na ml na kriowial. Przenieś zawiesinę komórkową do odpowiedniej liczby kriowiali i dodaj 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) do każdego kriowialu.</li>
	<li>Umieść kriowiale na lodzie i natychmiast przenieś je do zamrażarki o kontrolowanej szybkości w celu kriokonserwacji. Po krioprezerwacji przenieś kriowiale do monitorowanego zbiornika ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
5. Kontrola jakości (Dzień 14)
UWAGA: W celu przeprowadzenia testów uwalniania, produkt przeszedł kilka testów, w tym testy sterylności pod kątem rozwoju drobnoustrojów i ocenę poziomu endotoksyn. Testy te zostały przeprowadzone w certyfikowanych laboratoriach Uniwersyteckiego Szpitala Ogólnego w Patras i Uniwersytetu w Patras. Obecność mykoplazmy oznaczono we własnym zakresie za pomocą testu detekcji biochemicznej i zmierzono na luminometrze zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Fenotyp komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), jak również liczba komórek i żywotność zostały ocenione wewnętrznie za pomocą cytometrii przepływowej (patrz sekcja 5.1) i automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów). Kryteria dopuszczenia ustalono na podstawie opublikowanych danych i zaleceń10,11dla produktów komórkowych wyprodukowanych w GMP (Tabela 1).
<ol>
	<li>Wykonać barwienie metodą cytometrii przepływowej (dzień 14) 
	UWAGA: Podwielokrotność 1 x 106 komórek zostanie wybarwiona pod kątem żywotności (7-AAD) i markera CD32 w celu oceny skuteczności transdukcji (patrz Tabela materiałów). Jeśli konieczne jest wykrycie interesującego genu, takiego jak w przypadku limfocytów CAR T, swoiste przeciwciało powinno mieć inny kolor niż marker CD3 i 7-AAD, aby uniknąć kompensacji. Należy wziąć pod uwagę odpowiednie próbki kontrolne.
	<ol>
		<li>Umieścić próbkę w probówce FACS i dodać 500 μl buforu FACS.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 400 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Całkowicie odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w rozcieńczonym w stosunku 1:5 roztworze buforu CD3:FACS (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wirować próbkę i inkubować przez 30 minut na lodzie w ciemności.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu FACS. Wirować przy 400 x g przez 5 minut (RT).</li>
		<li>Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w rozcieńczonym w stosunku 1:20 roztworze buforu 7-AAD:FACS (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Wirować próbkę i inkubować przez 10 minut na lodzie w ciemności.</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu FACS i przeanalizować próbkę za pomocą cytometru przepływowego (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+%28CTL019%29+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19%2B+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183(2015).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Wang, X., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+manufacturing+of+CAR+T+cells%3A+foundation+of+a+promising+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).</li>
<li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li>
<li>Kaiser, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+commercial+process+for+the+manufacture+of+genetically+modified+T+cells+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+quality%2C+non-clinical+and+clinical+aspects+of+medicinal+products+containing+genetically+modified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Medicines+Agency%22%5BJournal%5D)">Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.</a> European Medicines Agency. , EMA/CAT/GTWP/671639/2008 Rev. 1 - corr., Committee for Advanced Therapies (CAT) (2020).</li>
<li>Castella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+CAR+T-Cell+production+%28ARI-0001%29+using+a+closed+semi-automatic+bioreactor%3A+experience+from+an+academic+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial.</a> Frontiers in Immunology. 11, 482(2020).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviruses+as+gene+transfer+agents+for+delivery+to+non-dividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9 (5), 457-463 (1998).</li>
<li>Ausubel, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+CGMP-grade+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+International%22%5BJournal%5D)">Production of CGMP-grade lentiviral vectors.</a> Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).</li>
<li>Van der Loo, J. C. M., Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+viral+vector+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in viral vector manufacturing.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R42-R52 (2016).</li>
<li>Rad, S. M. A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+choice%3A+Who+should+drive+the+CAR+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells.</a> PLoS One. 15 (7), e0232915(2020).</li>
<li>Sandrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+a+modified+RD114+envelope+glycoprotein+show+increased+stability+in+sera+and+augmented+transduction+of+primary+lymphocytes+and+CD34%2B+cells+derived+from+human+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates.</a> Blood. 100 (3), 823-832 (2002).</li>
<li>Costello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+stimulated+and+unstimulated+T+lymphocytes+by+HIV-1-derived+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).</li>
<li>Radek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectofusin-1+improves+transduction+of+primary+human+cells+with+diverse+retroviral+and+lentiviral+pseudotypes%2C+enabling+robust%2C+automated+closed-system+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Vectofusin-1 improves transduction of primary human cells with diverse retroviral and lentiviral pseudotypes, enabling robust, automated closed-system manufacturing.</a> Hum Gene Therapy. 30 (12), 1477-1493 (2019).</li>
<li>Hanenberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+retrovirus+and+target+cells+on+specific+fibronectin+fragments+increases+genetic+transduction+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells.</a> Nature Medicine. 2 (8), 876-882 (1996).</li>
<li>Lamers, C. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retronectin-assisted+retroviral+transduction+of+primary+human+T+lymphocytes+under+good+manufacturing+practice+conditions%3A+tissue+culture+bag+critically+determines+cell+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Retronectin-assisted retroviral transduction of primary human T lymphocytes under good manufacturing practice conditions: tissue culture bag critically determines cell yield.</a> Cytotherapy. 10 (4), 406-416 (2008).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>Wang, R. -N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+%CE%B3%CE%B4+T+cell+expansion+and+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for γδ T cell expansion and lentiviral transduction.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1471-1480 (2019).</li>
<li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+and+optimization+of+protocols+for+producing+recombinant+lentivirus+carrying+the+anti-Her2+chimeric+antigen+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis and optimization of protocols for producing recombinant lentivirus carrying the anti-Her2 chimeric antigen receptor gene.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (7-8), e3027(2018).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+the+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T cells using the CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of chimeric antigen receptor T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
</ol>

N.S. opracował protokół i napisał manuskrypt, który był recenzowany i nadzorowany przez A.S.; K.S., G.A. przeprowadził dodatkowe eksperymenty; D.K., M.L. udzielił cennego wsparcia w eksperymentach i wraz z V.Z., N.T. w procesie recenzji. N.T. jest członkiem ProtATonce Ltd. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Wektory lentiwirusowe jako nośniki genów są ważnymi narzędziami w dziedzinie terapii komórkowej i genowej ze względu na ich zdolność do transdukcji zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się12. Jednak produkcja wektorów lentiwirusowych na dużą skalę przy użyciu metod zgodnych z GMP jest nadal wyzwaniem ze względu na różne parametry, takie jak metody transfekcji i etapy oczyszczania, które mogą powodować zmienność partii lentiwirusa. Ośrodki akademickie często pozyskują zapasy wirusów ...

Pojawienie się Adoptywnych Terapii Komórkowych (ACT) i Chimerycznych Receptorów Antygenowych (CAR)-T spowodowało rewolucyjną zmianę w nowoczesnej praktyce klinicznej, ustanawiając nowy paradygmat medycyny spersonalizowanej. W szczególności komórki CAR-T ukierunkowane na CD19 wykazały wyjątkową odpowiedź kliniczną i reprezentują najbardziej zaawansowaną terapię komórkami T w nowotworach złośliwych komórek B1,2,3,4,5. Jednak obecne skomercjalizowane terapie komórkami T zmodyfikowanymi genami w dużym stopniu opierają się na wektorach wirusowych do transferu genów. Wdrożenie wektorów wirusowych w ACT, zwłaszcza w warunkach Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP) w środowisku akademickim, stanowi poważne wyzwanie ze względu na ograniczenia skalowalności, wymagania dotyczące specjalistycznego sprzętu, zapotrzebowanie na wysoko wykwalifikowany personel oraz stosowanie odczynników zgodnych z GMP do produkcji cząstek wirusa za pośrednictwem plazmidu6,7,8.
W związku z tym, proces produkcji terapii genami modyfikowanymi limfocytami T jest skomplikowany i zazwyczaj rozpoczyna się od izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z produktu leukaferezy. Limfocyty T są często wzbogacane z puli PBMC i aktywowane za pomocą mikrokompleksów anty-CD3/CD287,9. Następnie limfocyty T są genetycznie modyfikowane za pomocą wektorów wirusowych lub niewirusowych, które mogą być produkowane in situ lub zlecane na zewnątrz. Aby uzyskać wymaganą liczbę komórek do infuzji, komórki zmodyfikowane genetycznie są namnażane przed ostatecznym sformułowaniem i/lub krioprezerwacją. Wreszcie, produkt komórkowy musi spełniać różne kryteria uwalniania w oparciu o wiele testów kontroli jakości9.
Ten protokół przedstawia kompleksową metodologię wykorzystującą proste techniki manipulacji ex vivo zdrowych PBMC w celu wytworzenia produktu z modyfikowanych genetycznie limfocytów T w warunkach zgodnych z GMP. Protokół obejmuje użycie wektora lentiwirusowego, który można zlecić firmie produkującej wirusy, zapewniającej wszystkie niezbędne testy ilościowe/funkcjonalne, czystości i bezpieczeństwa (np. miano wirusa, wykrywanie lentiwirusa kompetentnego do replikacji DNA komórki gospodarza). W tym badaniu zastosowanym wektorem jest wektor lentiwirusowy drugiej generacji oparty na VSV-g (Vesicular Stomatitis Virus G Protein) z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) jako genem będącym przedmiotem zainteresowania w konstytutywnej ekspresji.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówka FACS&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki Falcon</td><td>Greiner biomedica</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka z TC</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS CANTO II</td><td>BD Biosciences</td><td>V96300084</td><td></td></tr> Aplikacja <tr><td>BSA</td><td></td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek&nbsp;</td><td>Corning Cell Cytosmart</td><td>J21E0081</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Greiner biomedica</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (D-PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Bufor FACS (1x D-PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA)</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo v10.6.2&nbsp;</td><td>TreeStar</td> <td>Inc-Gibco</td><td></td></tr> <tr><td>CTS Opti-MEM I Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4124801</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-15</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-114</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-146</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-111</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>HEPA Whitley H35 Hipoksystacja</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>HA0315172H</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej (HSA)</td><td>Baxter</td><td>B05AA01</td><td></td></tr><tr><td>Junior LB 9509 Przenośny luminometr</td><td>Berthold Technologies</td><td>6506</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Provirus Zestaw do oznaczania</td><td>ilościowego Takara Bio</td><td>631239</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP T cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-156</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human&nbsp; CD3 (Klon: UCHT-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>557706</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Plus Zestaw detekcyjny</td><td>Lonza Bioscience</td><td>LT07-703</td><td></td></tr><tr><td>Ultrarozciągliwa taśma zamykająca Parafilm 5 cm x 75 m</td><td>D.Dutscher</td><td>90261</td><td></td></tr><tr><td>PeriStem PS-650-DB (worek do aferezy)</td><td>Strugarka do SC00816</td><td></td><td></td>urządzeń Biomed</tr><tr><td>Kryo10 Series III</td><td>Strugarka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 kolby</td><td>Greiner biomedica</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy, roztwór 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vectofusin-1 GMP</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-165</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVOTM 15 Pożywka dla komórek krwiotwórczych bez surowicy</td><td>Lonza Bioscience</td><td>A1048501</td><td></td></tr></tbody></table>

zgodna z gmp procedura wytwarzania limfocytów t modyfikowanych genetycznie

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

Dziedzina adoptywnej terapii komórkowej (ACT) została zrewolucjonizowana przez rozwój genetycznie modyfikowanych komórek, w szczególności komórek Chimerycznego Receptora Antygenowego (CAR)-T. Te zmodyfikowane komórki wykazały niezwykłe odpowiedzi kliniczne u pacjentów z nowotworami hematologicznymi. Jednak wysokie koszty produkcji tych terapii i przeprowadzania szeroko zakrojonych ocen kontroli jakości ograniczyły ich dostępność dla szerszego grona pacjentów. Aby rozwiązać ten problem, wiele instytucji akademickich bada możliwość własnej produkcji genetycznie modyfikowanych komórek, przy jednoczesnym przestrzeganiu wytycznych określonych przez krajowe i międzynarodowe agencje regulacyjne.
Produkcja genetycznie modyfikowanych produktów z komórek T na dużą skalę stanowi kilka wyzwań, szczególnie pod względem możliwości produkcyjnych instytucji i konieczności spełnienia wymagań dotyczących ilości infuzji. Jednym z głównych wyzwań jest produkcja wektorów wirusowych na dużą skalę zgodnie z wytycznymi Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP), która często jest zlecana firmom zewnętrznym. Ponadto uproszczenie procesu transdukcji limfocytów T może pomóc zminimalizować zmienność między partiami produkcyjnymi, obniżyć koszty i ułatwić szkolenie personelu. W tym badaniu przedstawiamy usprawniony proces transdukcji lentiwirusowej pierwotnych ludzkich limfocytów T z markerem fluorescencyjnym jako genem będącym przedmiotem zainteresowania. Cały proces jest zgodny ze standardami GMP i jest wdrażany w naszej instytucji akademickiej.

Ocena wydajności transdukcji 
Ekspresję genu docelowego (GFP) w transdukowanych komórkach oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 1. W 14. dniu ponad 95% komórek było CD3+, co wskazuje na pomyślną aktywację i ekspansję limfocytów T. Wydajność transdukcji w populacji CD3+ wyniosła 58,7% (TD, Rysunek 1C) w porównaniu z komórkami nietransdukowanymi (UNTD, <stron...

Ten protokół opisuje proces transdukcji pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą interesującego genu, zapewniając zgodność ze standardami Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP).

Zgodna z GMP procedura wytwarzania limfocytów T modyfikowanych genetycznie

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...

Protokół ten opisuje uproszczony i zgodny z GNP proces transdukcji ludzkich pierwotnych limfocytów T z genem będącym przedmiotem zainteresowania. Ta konkretna technika została zaprojektowana tak, aby była opłacalna i zgodna z GNP bez użycia drogich platform produkcyjnych systemów zamkniętych dostępnych obecnie w wielu ośrodkach akademickich. Metoda ta może potencjalnie znaleźć zastosowanie do generowania terapii komórkowych modyfikowanych genami, w tym między innymi limfocytów T CAR, które stanowią zmianę paradygmatu w walce z nowotworami hematologicznymi.W celu wyizolowania PBMC z komórek pobranych po leukaferezie krwi dawcy należy przeprowadzić odwirowanie próbki w gradiencie gęstości na bazie polisacharydów, utrzymując stosunek odczynnika do próbki 1:2, odwirowując mieszaninę przy 800 G przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonych hamulcach. Następnie za pomocą mikropipety zbierz PBMC do czystej probówki o pojemności 50 mililitrów. Umyć komórki dwukrotnie PBS przez odwirowanie.Przed ponownym wymieszaniem umytych komórek w kompletnym pożywce krwiotwórczej. Aktywuj około 20 milionów uzyskanych komórek, dodając 10 mikrolitrów odczynnika do stymulacji limfocytów T na każ

a-gmp-compliant-procedure-for-the-generation-of-gene-modified-t-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Film przedstawia proces tworzenia genetycznie modyfikowanych komórek CAR T za pomocą systemu CRISPR-Cas9. Zakażenie limfocytów T lentiwirusami CRISPR i CAR powoduje modyfikacje genu docelowego i syntezę chimerycznego receptora antygenowego lub CAR, co ostatecznie prowadzi do powstania genetycznie zmodyfikowanych limfocytów CAR T.

Genetyczna modyfikacja limfocytów CAR T przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Limfodepletywne i immunomodulacyjne efekty standardu leczenia chemioterapią i radioterapią mogą być wykorzystane do zwiększenia skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii limfocytami T. Przedstawiamy metodę generowania limfocytów T receptora antygenu chimerycznego (CAR) specyficznych dla EGFRvIII i podawania ich w kontekście standardowej opieki nad glejakiem.

Wytwarzanie limfocytów CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem

Tutaj opisujemy nowatorską metodę generowania specyficznych dla antygenu receptorów limfocytów T (TCR) poprzez parowanie TCRα lub TCRβ istniejącego TCR, posiadającego swoistość antygenową będącą przedmiotem zainteresowania, z komplementarnym półłańcuchem repertuaru obwodowych receptorów limfocytów T. Generowane de novo TCR zachowują swoistość antygenową z różnym powinowactwem.

Generowanie receptorów ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu de novo poprzez transdukcję retrowirusową centralnego hemiłańcucha

Tutaj prezentujemy protokół do genetycznej edycji komórek CAR-T za pomocą systemu CRISPR/Cas9.

Wykorzystanie CRISPR/Cas9 do wyeliminowania GM-CSF w komórkach CAR-T

Ten artykuł szczegółowo opisuje proces produkcji limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym do użytku klinicznego, w szczególności przy użyciu automatycznego procesora komórkowego zdolnego do przeprowadzania transdukcji wirusa i hodowli limfocytów T. Przedstawiamy rekomendacje i opisujemy pułapki, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania procesu i wdrażania badania klinicznego wczesnej fazy.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Protokół ten opisuje skalowalną metodę rozszerzania produktów Adoptive Cell Therapies (ACT), mianowicie komórek Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T oraz komórek zabójczych indukowanych cytokinami (CIK), wykorzystujących urządzenia Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex), wykazując efektywny i solidny wzrost w klinicznie istotnych warunkach.

Efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez CAR-T i cytokiny w urządzeniach skalowalnych GMP

Poznaj uproszczoną metodę transdukcji limfocytów T zgodną z GMP, stosującą ludzkie komórki PBMC. Ta technika umożliwia efektywne wytwarzanie terapii CAR T-cell w sposób ekonomiczny.

Zgodna z GMP procedura wytwarzania limfocytów T modyfikowanych genetycznie

Przeglądaj więcej filmów