Name: Ochrona komórek mięśnia sercowego H9c2 przed stresem oksydacyjnym przez krocetynę za pośrednictwem mitofagii, w której pośredniczy szlak PINK1 / Parkin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj mechanizm ochrony kardiomiocytów H9c2 przez krocetynę przed stresem oksydacyjnym poprzez mitofagię zależną od szlaku PINK1/Parkin. Metoda ta pozwala badać procesy naprawcze w komórkach serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 7202119) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82274380).

Eksperymenty zostały przeprowadzone w Laboratorium Fizjologii na Pekińskim Uniwersytecie Medycyny Chińskiej, Chiny. Wszystkie metody badawcze zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami Uniwersytetu Pekińskiego.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Dodać 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny do zmodyfikowanej pożywki podstawowej Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco (z 4,5 g/l D-glukozy, 4,g.g/l L-glutaminy i 110 mg/l pirogronianu sodu) w celu przygotowania kompletnej pożywki DMEM.</li>
	<li>Rozmrażać komórki mięśnia sercowego H9c2 zamrożone ciekłym azotem (patrz tabela materiałów) w ciepłej wodzie o temperaturze 37 °C, szybko i równomiernie mieszając, aż lód się stopi.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki wirówkowej i dodać czterokrotność objętości kompletnego podłoża DMEM. Wirować przy 358 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Otrzymaną zawiesinę komórkową rozcieńczyć pożywką hodowlaną, delikatnie przedmuchać i zaszczepić komórki w kolbie hodowlanej. Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Określenie żywotności komórek
<ol>
	<li>Rozpuścić krocetynę (patrz tabela materiałów) w sulfotlenku dimetylu (DMSO) do stężeń 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM i 200 mM.</li>
	<li>Oddzielić komórki mięśnia sercowego H9c2 za pomocą trypsyny, a następnie zneutralizować mieszaninę za pomocą kompletnej pożywki DMEM.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki wirówkowej i wirować przy stężeniu 179 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i wymieszać komórki w kompletnym pożywce DMEM, delikatnie.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą płytki do liczenia krwinek22 (patrz Tabela Materiałów) i rozcieńcz je do 5 ×10 4 komórek/ml za pomocą kompletnej pożywki DMEM.</li>
	<li>Podziel komórki na dziewięć równych porcji. Dodać DMSO (rozcieńczony w stosunku 1:1,000 z kompletną pożywką DMEM) do grupy kontrolnej i dodać różne stężenia krocetyny do pozostałych grup w stosunku 1:1,000.</li>
	<li>Wysiewaj komórki na 96-dołkowych płytkach w ilości 100 μl na studzienkę. Po inkubacji przez 24 godziny odrzucić supernatant i trzykrotnie przemyć komórki PBS.</li>
	<li>Po dodaniu 100 μl podłoża podstawowego DMEM inkubować komórki przez 4 godziny i dodać 20 μl MTS (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować komórki przez kolejne 2 godziny, zmierzyć absorbancję przy długości fali 490 nm i obliczyć żywotność komórek. 
	UWAGA: Żywotność komórek = (Od, po zabiegu - ślepa próba OD) / (Kontrola OD - ślepa próba OD) × 100.</li>
</ol>
3. Oznaczanie dehydrogenazy mleczanowej (LDH), kinazy kreatynowej (CK), dialdehydu malonowego (MDA), dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GSH Px) i katalazy (CAT)
<ol>
	<li>Zasiaj komórki H9c2 na 6-dołkowej płytce o gęstości 1 × 105 komórek. Zebrać supernatant po interwencji i wykryć poziomy LDH i SOD, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Zebrać sklarowany osad i przemyć go jednokrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Dodaj lizat komórkowy do naczynia hodowlanego i pozostaw na lodzie na 20 minut. Zebrać płyn z naczynia hodowlanego do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Wykrywanie poziomów CK, MDA, GSH-Px i CAT zgodnie z instrukcjami producenta23 (patrz Tabela materiałów i Plik uzupełniający 1).</li>
	<li>Wykryj całkowite stężenie białka w lizie metodą kwasu bicinchoninowego (BCA), aby skorygować stężenie CK, MDA, GSH-Px i CAT24 (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
4. Określenie ROS
<ol>
	<li>Zasiaj komórki H9c2 na 48-dołkowej płytce o gęstości 5 × 103 komórek. Rozcieńczyć DCFH-DA (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:1,000 z podłożem niezawierającym surowicy. Odrzucić supernatant komórkowy i dwukrotnie przemyć komórkę pożywką niezawierającą surowicy.</li>
	<li>Dodać 150 μl rozcieńczonego DCFH-DA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Umyć komórki trzykrotnie pożywką bez surowicy i uchwycić obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
5. Wykrywanie potencjału błony mitochondrialnej
<ol>
	<li>Wykryj potencjał błony mitochondrialnej za pomocą zestawu do oznaczania potencjału błony mitochondrialnej JC-125 (patrz tabela materiałów). Wyrzuć pożywkę hodowlaną i umyj ją raz pożywką bez surowicy.</li>
	<li>Dodaj roztwór roboczy JC-1 do każdej probówki i dobrze je wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut i dwukrotnie przemyć komórki buforem barwiącym JC-1. Dodaj kompletne podłoże do każdej studzienki i zrób zdjęcia pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
6. Test barwienia TUNEL
<ol>
	<li>Użyj zestawu do oznaczania apoptozy TUNEL (patrz Tabela materiałów), aby określić szybkość apoptozy26. Odrzucić supernatant i raz przemyć osad pożywką niezawierającą surowicy.</li>
	<li>Dodaj roztwór do utrwalania komórek i przemyj je PBS raz po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 0,3% trytonu-100 do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dwukrotnie przemyć komórki PBS. Dodać roztwór roboczy do wykrywania TUNEL i inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 60 minut.</li>
	<li>Dodać antyfluorescencyjną tabletkę uszczelniającą zawierającą 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI; patrz tabela materiałów) i wykonać zdjęcia pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
7. Monitorowanie przepływu autofagicznego przez transfekcję adenowirusa mCherry GFP-LC3B
<ol>
	<li>Zastąp połowę pożywki w każdym dołku świeżą pożywką. Dodać adenowirusa Ad-mCherry GFP-LC3B (mnogość infekcji [MOI] 2) do pożywki hodowlanej i dodać 5 μg/ml polibrenu (patrz tabela materiałów), aby poprawić skuteczność infekcji.</li>
	<li>Po 24 godzinach należy wymienić świeżą pożywkę i obserwować ekspresję białka fluorescencyjnego pod mikroskopem konfokalnym.</li>
	<li>Hoduj komórki w tych samych warunkach, co w sekcji 1 po potwierdzeniu udanej infekcji wirusowej i uchwyć obrazy pod mikroskopem konfokalnym27. 
	UWAGA: Ponad 20% komórek wykazało fluorescencję białka zielonej fluorescencji (GFP), co wskazuje na udaną infekcję.</li>
</ol>
8. Analiza Western blot
<ol>
	<li>Zebrać komórki do ekstrakcji całego białka i poddać je lizie (RIPA, inhibitor proteazy i inhibitor fosfatazy = 100:1:1; patrz tabela materiałów) na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 5x bufor ładujący białko do próbki białka po ilościowym określeniu białka i gotować próbki przez 10 minut.</li>
	<li>Elektroforeza próbek, które zawierają równe ilości białka, z żelami do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE)28. Następnie przenieś próbki na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).</li>
	<li>Zasłonić membrany PVDF na 1 godzinę 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku i inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (PINK1, Parkin; patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc i przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wykrywanie pasm docelowych za pomocą roztworu wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i systemu detekcji chemiluminescencji. Użyj oprogramowania Image J, aby określić ilościowo pasma za pomocą densytometrii28.</li>
</ol>
9. Wykrywanie translokacji mitochondrialnej Parkina za pomocą immunofluorescencji
<ol>
	<li>Obserwuj kolokalizację Parkiny z mitochondriami za pomocą podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego. Odrzucić supernatant komórkowy z każdej grupy i przemyć go trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Utrwal komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą 4% paraformaldehydu i dodaj 0,1% trytonu-100 do PBS.</li>
	<li>Blokować roztworem blokowym wolnym od zwierząt (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu między białkami i przeciwciałami oraz zmniejszyć tło fluorescencji.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (Parkina i Tom20; patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Dodać fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe (patrz tabela materiałów) i inkubować w ciemności przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodaj tabletki antyfluorescencyjne zawierające DAPI i rejestruj obrazy pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>
10. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wykonuj analizę statystyczną za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i analiz (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Porównaj zmienne ciągłe między grupami za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA. p < 0,05 uznano za statystycznie istotne.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li>
<li>Samsky, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiogenic+shock+after+acute+myocardial+infarction%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review.</a> JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).</li>
<li>Abbate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+cardiac+remodeling+benefits+in+patients+undergoing+late+percutaneous+coronary+intervention+of+the+infarct-related+artery%3A+evidence+from+a+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).</li>
<li>Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+heart+failure+in+patients+with+acute+myocardial+infarction+treated+with+primary+percutaneous+coronary+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention.</a> European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).</li>
<li>Dhruva, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+use+of+an+intravascular+microaxial+left+ventricular+assist+device+vs+intra-aortic+balloon+pump+with+in-hospital+mortality+and+major+bleeding+among+patients+with+acute+myocardial+infarction+complicated+by+cardiogenic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock.</a> JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+associated+with+major+cardiovascular+events+1+year+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction.</a> JAMA Network Open. 1 (4), e181079(2018).</li>
<li>Jou, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+protects+against+common+deletion+of+mitochondrial+DNA-augmented+mitochondrial+oxidative+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pineal+Research%22%5BJournal%5D)">Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis.</a> Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).</li>
<li>La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+supported+by+exogenous+cytochrome+c+oxidation+mimics+the+early+stages+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).</li>
<li>De Filippo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+secondary+prevention+medical+therapies+on+outcomes+of+patients+suffering+from+Myocardial+Infarction+with+NonObstructive+Coronary+Artery+disease+%28MINOCA%29%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis.</a> International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).</li>
<li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multitarget+strategies+to+reduce+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury%3A+JACC+review+topic+of+the+week%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).</li>
<li>Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+pharmacological+and+non-pharmacological+strategies+of+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002(2019).</li>
<li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+pharmacology+analysis+and+experimental+validation+to+investigate+the+mechanism+of+total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+in+treating+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development%2C+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis.</a> Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+Chinese+medicine+has+great+potential+as+candidate+drugs+for+lung+cancer%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748(2023).</li>
<li>Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+traditional+Chinese+medicine+for+the+prevention+and+treatment+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749(2023).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertensive+heart+disease+and+myocardial+fibrosis%3A+How+traditional+Chinese+medicine+can+help+addressing+unmet+therapeutical+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs.</a> Pharmacological Research. 185, 106515(2022).</li>
<li>Zhang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+Chinese+medicine+intervenes+ventricular+remodeling+following+acute+myocardial+infarction%3A+evidence+from+40+random+controlled+trials+with+3%2C659+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 707394(2021).</li>
<li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+Chinese+medicine+for+cardiovascular+disease%3A+evidence+and+potential+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms.</a> Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).</li>
<li>Delgado-Montero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stasis+imaging+predicts+cerebral+microembolism+during+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Echocardiography%22%5BJournal%5D)">Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).</li>
<li>Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+trends+in+traditional+Chinese+medicine+for+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction.</a> Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010(2019).</li>
<li>Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+on+outcome+of+5284+patients+with+coronary+artery+disease%3A+the+role+of+integrative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine.</a> Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crocetin+ester+improves+myocardial+ischemia+via+Rho%2FROCK%2FNF-kappaB+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway.</a> International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).</li>
<li>Zeng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+potential+value+and+mechanism+of+Kaji-Ichigoside+F1+on+arsenite-induced+skin+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473(2022).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+mitochondria+with+JC-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li>
<li>Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+by+TUNEL+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis by TUNEL assay.</a> Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+impairs+the+autophagic+flux+to+induce+p62-dependent+apoptosis+through+the+upregulation+of+CYLD+in+NRCMs%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs.</a> Toxicology. 465, 153032(2022).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li>
<li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+restore+the+MMP%2FTIMP+balance+in+models+of+osteoarthritis+by+inhibiting+the+activation+of+the+NF-%CE%BAB+and+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837(2021).</li>
<li>Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saffron%3A+a+potential+candidate+for+a+novel+anticancer+drug+against+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).</li>
<li>Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+effects+of+saffron%3A+an+evidence-based+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Tehran+Heart+Center%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review.</a> The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).</li>
<li>Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+perspective+and+opportunities+in+pharmacologically+important+safflower%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower.</a> Metabolites. 10 (6), 253(2020).</li>
<li>Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+saffron+supplementation%3A+current+clinical+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+protective+effect+of+salidroside+against+H2O2-induced+injury+in+H9C2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271(2021).</li>
<li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+rhizoma+drynariae+targets+in+the+treatment+of+osteoarthritis+based+on+network+pharmacology+and+experimental+verification%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462(2021).</li>
<li>Reers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+monitored+by+JC-1+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye.</a> Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).</li>
<li>Radovits, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibition+improves+endothelial+dysfunction+induced+by+reactive+oxidant+hydrogen+peroxide+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).</li>
<li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+parkin-mediated+mitophagy+and+mitochondrial+fission+in+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts.</a> Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).</li>
<li>Gan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+PINK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of PINK1.</a> Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).</li>
<li>Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+signals+of+PINK1%2FParkin+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).</li>
<li>Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SQSTM1%2Fp62+promotes+mitochondrial+ubiquitination+independently+of+PINK1+and+PRKN%2Fparkin+in+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy.</a> Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%284th+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Badanie skutecznych składników ze złożonych związków leków naturalnych za pomocą zaawansowanej technologii było gorącym punktem badań TCM29 i może dostarczyć dowodów laboratoryjnych dla przyszłego rozwoju leków po weryfikacji. Krokosz barwierski jest reprezentatywnym lekiem w leczeniu "wspomagania krążenia krwi i minimalizowania zastoju krwi" i jest szeroko stosowany w leczeniu zawału mięśnia sercowego30,31. Uważa się, że szafran ma podobn...

Ostry zawał mięśnia sercowego (AMI) to zagrażająca życiu martwica mięśnia sercowego spowodowana ciężkim i uporczywym niedokrwieniem i niedotlenieniem tętnic wieńcowych1,2. Przezskórna interwencja wieńcowa (PCI) jest jedną ze strategii terapeutycznych pierwszego rzutu w AMI i zwykle chroni kardiomiocyty przed uszkodzeniem niedokrwiennym3,4. Dystalny mięsień sercowy będzie pozbawiony dopływu krwi i tlenu, jeśli nie zostanie szybko i skutecznie leczony po AMI, co prowadzi do martwicy niedokrwiennej i dalszych powikłań sercowo-naczyniowych5,6. Wspomaganie regeneracji kardiomiocytów i minimalizowanie nieodwracalnych uszkodzeń mięśnia sercowego po utracie możliwości chirurgicznej PCI było gorącym punktem badań. Po AMI kardiomiocyty znajdują się w stanie niedokrwienia i niedotlenienia, co powoduje zahamowanie mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej, redukcję NAD+ do NADPH i zwiększoną redukcję pojedynczych elektronów7. W rezultacie, niepełna reakcja redukcji tlenu generuje nadmiar reaktywnych form tlenu (ROS) i ostatecznie prowadzi do uszkodzenia kardiomiocytów przez stres oksydacyjny8. Nadmierna akumulacja ROS powoduje peroksydację lipidów, co dodatkowo zaburza strukturę i funkcję błon mitochondrialnych. Rezultatem jest ciągłe otwieranie porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów i zmniejszenie potencjału błony mitochondrialnej, indukując apoptozę i martwicę.
Inhibitory konwertazy angiotensyny (ACE), blokery receptora angiotensyny (ARB), inhibitory receptora β-adrenergicznego, antagoniści aldosteronu i inne standardowe leki w AMI mogą pomóc poprawić funkcjonowanie serca po zawale mięśnia sercowego i zapobiec wystąpieniu złośliwych zdarzeń, takich jak zaburzenia rytmu serca i przebudowa lewej komory9. Jednak na przeżycie po zawale i rokowanie duży wpływ ma wielkość zawału, a zadowalające wyniki nie zostały osiągnięte w zakresie zmniejszania apoptozy kardiomiocytów10,11. W związku z tym opracowanie leków wspomagających regenerację kardiomiocytów po zawale mięśnia sercowego stało się pilną kwestią.
Tradycyjna medycyna od wielu lat stanowi źródło inspiracji dla nowoczesnych badań farmaceutycznych12,13,14,15. Tradycyjna medycyna chińska (TCM) ma długą historię w leczeniu AMI, a seria randomizowanych badań kontrolnych w ostatnich latach potwierdziła, że TCM może rzeczywiście poprawić rokowanie pacjentów16,17. Zgodnie z teorią TCM, AMI jest spowodowane zastojem krwi18,19, więc leki wspomagające krążenie krwi są zwykle stosowane w leczeniu AMI w ostrej fazie20. Wśród nich uważa się, że szafran ma silny wpływ na aktywację i zastój krwi i jest często stosowany w ostrym leczeniu AMI. Krocetyna, główny składnik szafranu, może odgrywać kluczową rolę w ochronie kardiomiocytów21.
W tym badaniu, komórki mięśnia sercowego H9c2 zostały wywołane przezH2O2 w celu symulacji niedokrwienia/reperfuzji mięśnia sercowego, co powoduje uszkodzenie kardiomiocytów AMI, a krocetyna została użyta jako interwencja w celu zbadania jej ochronnego działania przed uszkodzeniem mięśnia sercowego wywołanym stresem oksydacyjnym. Mechanizm ochrony kardiomiocytów przez krokietynę był dalej badany za pomocą mitofagii. Co ważniejsze, artykuł ten stanowi odniesienie do technicznego podejścia do badania mitofagii i szczegółowo opisuje całą procedurę eksperymentalną.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna</td><td>Gibco</td><td>2323363</td><td></td></tr><tr><td>1% Penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>V900929</td><td></td></tr><tr><td>5x bufor ładowania białka</td><td>Beijing Pulilai Gene Technology</td><td>B1030-5</td><td></td></tr><tr><td>Ad-mCherry GFP-LC3B adenowirus</td><td>Beyotime</td><td>C3011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężona koza anty-królicza IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Sp. z o.o.</td><td>ZF-0514</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-sprzężona koza anty-mysie IgG (H + L)</td> <td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td><td>ZF-0513</td><td></td></tr><tr><td>Wolne od zwierząt rozwiązanie blokujące</td><td>CST</td><td>15019s Przeciwciało</td> anty-parkinowe <td></td></tr><tr><td></td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32282</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PINK1</td><td>ABklonalne</td><td>A11435</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TOM20</td><td>ABklonalne</td><td>A19403</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-&beta;-aktynowe</td><td>ABklonalne</td><td>AC026</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>KeyGEN Biotech</td><td>KGP902</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do liczenia komórek krwi</td><td>Servicebio</td><td>WG607</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy testowe CAT</td><td>Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng</td><td>A007-1-1</td><td></td></tr><tr><td>System wykrywania chemiluminescencji</td><td>Szanghaj Qinxiang Scientific Instrument Factory</td> Zestawy testowe <td>ChemiScope 6100</td><td></td></tr><tr><td>CK</td><td>Nanjing Jiancheng Instytut Bioinżynierii</td><td>A032-1-1</td><td></td></tr><tr><td>Koenzym Q10 (CoQ 10)</td><td>Macklin</td><td>C6129</td><td></td></tr><tr><td>Crocetin</td><td>Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>RFS-Z01802006012</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki gaszące przeciwfluorescencyjne zawierające DAPI</td><td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td><td>ZLI-9557</td><td></td></tr><tr><td>DCFH-DA</td><td>Beyotime</td><td>S0033S</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco (DMEM)</td> Roztwór <td>Gibco</td><td>8122091</td><td></td></tr><tr><td>Enhanced Chemiluminescence (ECL)</td><td>NCM Biotech</td><td>P10100</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td> <td>Corning-Cellgro</td><td>35-081-CV</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7.0&nbsp;</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zestawy testowe GSH-Px</td><td>Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng</td><td>A005-1-2</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 komórki mięśnia sercowego</td><td>Pekin Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.</td><td>CS0062</td><td></td></tr><tr><td>Anty-kozia peroksydaza chrzanowa (HRP)-sprzężona z kozią kozą IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Sp. z o.o.</td><td>ZB-2305</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG (H+L) kozia peroksydaza chrzanowa (HRP) sprzężona z kozią peroksydazą chrzanową (HRP)&nbsp;</td><td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Sp. z o.o.</td><td>ZB-2301</td><td></td></tr><tr><td>JC-1 zestaw do oznaczania potencjału błony mitochondrialnej</td><td>LABLEAD</td><td>J22202</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy testowe LDH</td><td>Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng</td> Zestawy testowe MDA <td>A020-2-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng</td><td>A003-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Test metanolu</td><td>Aladdin</td><td>A2114057</td><td></td></tr><tr><td>MTS</td><td>Promega</td><td>G3581</td><td></td></tr><tr><td>Perhydrol</td><td>G-klon</td><td>CS7730</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor fosfatazy</td><td>CWBIO</td><td>CW2383</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Beyotime</td><td>C0351</td><td></td></tr><tr><td>Membrany z polifluorku winylidenu (PVDF)</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA)</td><td>Solarbio</td><td>R0010</td><td></td></tr><tr><td>Żele SDS-PAGE</td><td>Shanghai Epizyme Biomedical Technology</td><td>PG112</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE w proszku buforowym do biegania</td><td>Servicebio</td><td>G2018-1L</td><td></td></tr><tr><td>Proszek buforowy transferowy SDS-PAGE</td><td>Servicebio</td><td>G2017-1L</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy testowe SOD</td><td>Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng</td><td>A001-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buforowany solą fizjologiczną w proszku</td><td>Servicebio</td><td>G0001-2L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania apoptozy</td><td></td> Triton X-100 Sigma SLCC9172 <td></td> TUNEL Beyotime C1086 <td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Solarbio</td><td>T8220</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ochrona komórek mięśnia sercowego h9c2 przed stresem oksydacyjnym przez krocetynę za pośrednictwem mitofagii, w której pośredniczy szlak pink1 / parkin

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

To badanie miało na celu zbadanie ochronnego wpływu krocetyny na komórki mięśnia sercowego H9c2, w których pośredniczy H2O, 2 poprzez eksperymenty in vitro, i dalsze badanie, czy jej mechanizm jest związany z wpływem mitofagii. Badanie to miało również na celu wykazanie terapeutycznego wpływu kwasu szafranowego na stres oksydacyjny w kardiomiocytach i zbadanie, czy jego mechanizm jest związany z efektem mitofagii. W tym miejscu skonstruowano model stresu oksydacyjnego oparty naH2O2i oceniono stopień uszkodzenia kardiomiocytów spowodowanego stresem oksydacyjnym poprzez wykrycie poziomów dehydrogenazy mleczanowej (LDH), kinazy kreatynowej (CK), dialdehydu malonowego (MDA), dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), katalazy (CAT) i peroksydazy glutationowej (GSH Px). Do oceny uszkodzenia mitochondriów i apoptozy wykorzystano barwnik fluorescencyjny wykrywający reaktywne formy tlenu (ROS): barwnik DCPH-DA, barwnik JC-1 i barwnik TUNEL. Strumień autofagiczny mierzono przez transfekcję adenowirusa Ad-mCherry-GFP-LC3B. Białka związane z mitofagią wykryto następnie za pomocą western blotting i immunofluorescencji. Jednak krocetyna (0,1-10 μM) może znacznie poprawić żywotność komórek i zmniejszyć apoptozę i uszkodzenia spowodowane stresem oksydacyjnym spowodowane przezH2O2. W komórkach z nadmierną aktywacją autofagiczną krocetyna może również zmniejszać przepływ autofagii i ekspresję białek związanych z mitofagią PINK1 i Parkiny oraz odwracać transfer parkiny do mitochondriów. Krocetyna mogła zmniejszać uszkodzenia spowodowane stresem oksydacyjnym za pośrednictwemH2O2i apoptozę komórek H9c2, a jej mechanizm był ściśle związany z mitofagią.

Wpływ kroketyny na żywotność komórek 
Kroketyna w stężeniach 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM, 10 µM, 50 µM i 100 µM wykazala istotny efekt proliferacyjny na komórki, natomiast kroketyna w stężeniach powyżej 200 µM znacząco hamowała proliferację komórek H9c2 (Rycina 1A). Po 4 h traktowania 400 µM H2O2 żywotność komórek uległa znacznemu zmniejszeniu, a kroketyna była w stanie w pewnym stopniu odwrócić tę zmianę (Rycina 1B). Pon...

Na podstawie eksperymentów in vitro, badanie to ujawniło mechanizm działania krocetyny w naprawie uszkodzeń kardiomiocytów spowodowanych stresem oksydacyjnym poprzez wpływ na mitofagię, w której ważną rolę odgrywa szlak sygnałowy PINK1/Parkin.

Ochrona komórek mięśnia sercowego H9c2 przed stresem oksydacyjnym przez krocetynę za pośrednictwem mitofagii, w której pośredniczy szlak PINK1 / Parkin

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

Protokół ten stanowi odniesienie dla podejścia technicznego do badania autofagów i szczegółowo opisuje całe procedury eksperymentalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na obserwację długości zmiany strumienia autofagicznego. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy określić efektywne stężenie infekcji i podjąć niezbędne środki bezpieczeństwa.Rozpocznij od odwirowania zneutralizowanych komórek mięśnia sercowego H9C2 w temperaturze 179 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i wymieszać komórki w kompletnym pożywce DMEM, delikatnie. Podziel komórki na dziewięć równych proporcji.Dodać dimetylosulfotlenek do grupy kontrolnej. Następnie dodaj różne stężenia krocetyny do pozostałych grup. Wysiewaj 100 mikrolitrów komórek na studzienkę na 96-dołkowej płytce.Po inkubacji przez 24 godziny wyrzucić supernatant. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS. Dodaj 100 mikrolitrów podłoża podstawowego DMEM do każdej studzienki i inkubuj komórki przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Teraz dodaj 20 mikrolitrów MTS i inkubuj przez kolejne dwie godziny, jak pokazano. Na koniec zmierz absorbancję przy 490 nanometrach i oblicz żywotność komórki. Aby o

protection-h9c2-myocardial-cells-from-oxidative-stress-crocetin-via

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Tutaj szczegółowo opisujemy podejście do pomiaru czasowej rekrutacji EYFP-Parkiny za pomocą poklatkowej mikroskopii podczas selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów. Ten dynamiczny proces usuwania uszkodzonych mitochondriów zależny od EYFP-Parkina może być wykorzystany jako wskaźnik zdrowia komórek w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po wystawieniu na hipoksję/reoksygenację z lub bez środka ochronnego.

Test oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w miocytach serca po niedotlenieniu/reoksygenacji

Mitofagia, selektywna degradacja mitochondriów, jest związana z homeostazą mitochondriów i jest rozregulowana w różnych chorobach ludzkich. Jednak wygodne metody eksperymentalne do pomiaru aktywności mitofagii są bardzo ograniczone. Tutaj zapewniamy czuły test do pomiaru aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej.

Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono &gt;95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Opisujemy protokół przeprowadzania testu wysiłkowego serca wywołanego przez dobutaminę i monitorowanego przez cewnikowanie serca u normalnych myszy. Pokazujemy również jego zastosowanie do demaskowania subklinicznej choroby serca u otyłych myszy wywołanych dietą wysokotłuszczową.

Test wysiłkowy serca indukowany przez dobutaminę i monitorowany przez cewnikowanie serca u myszy

Echokardiografia jest powszechnie używana do nieinwazyjnego charakteryzowania i ilościowego określania zmian w strukturze i funkcji serca. Opisujemy algorytm obrazowania oparty na ultradźwiękach, który oferuje ulepszony zastępczy pomiar mikrostruktury mięśnia sercowego i może być wykonywany przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu.

Ultradźwiękowa ocena mikrostruktury mięśnia sercowego

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Poznaj mechanizm ochrony kardiomiocytów H9c2 przez krocetynę przed stresem oksydacyjnym poprzez mitofagię zależną od szlaku PINK1/Parkin. Metoda ta pozwala badać procesy naprawcze w komórkach serca.

Ochrona komórek mięśnia sercowego H9c2 przed stresem oksydacyjnym przez krocetynę za pośrednictwem mitofagii, w której pośredniczy szlak PINK1 / Parkin (Wideo) | JoVE Journal

Ochrona komórek mięśnia sercowego H9c2 przed stresem oksydacyjnym przez krocetynę za pośrednictwem mitofagii, w której pośredniczy szlak PINK1 / Parkin

Przeglądaj więcej filmów