Name: Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę pomiaru lipolizy w tkance tłuszczowej myszy ex vivo i preadipocytach in vitro. Protokół wykorzystuje próbkowanie szeregowe i enzymatyczne oznaczanie kwasów tłuszczowych oraz glicerolu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych R01DK126944 dla S.M.R.

Zastosowanie wszystkich zwierząt zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Weill Cornell Medical College Uniwersytetu Cornell.
1. Przygotowanie buforów i płytek do zbierania próbek
<ol>
	<li>Przygotuj 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 5 g BSA w 100 mL pożywki Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) bez czerwieni fenolowej. Delikatnie mieszaj BSA do całkowitego rozpuszczenia (wstrząsanie jest nieskuteczne). Po całkowitym rozpuszczeniu BSA wysterylizuj pożywkę za pomocą filtra 0,2 µm. Przechowuj pożywkę z BSA w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.</li>
	<li>Przygotuj robocze stężenia pożywek kontrolnych i stymulujących. Pożywka kontrolna: pożywka z 5% BSA z kontrolą nośnika. Pożywka stymulująca: pożywka z 5% BSA z 0,5 µM CL-316,243. Świeżą pożywkę stymulującą przygotowuj dla każdego eksperymentu.</li>
	<li>Podgrzej używane pożywki do 37 °C. Oznacz płytkę 96-dołkową przeznaczoną do zbierania pożywek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przeprowadź hodowlę komórkową zgodnie z poniższym opisem. Wszystkie prace z komórkami wykonuj w sterylnej komorze z wyciągiem, aby zminimalizować kontaminację zewnętrzną.
	<ol>
		<li>Izoluj i różnicuj pierwotne preadipocyty, zgodnie z opisem w73,74.
		<ol>
			<li>Wysiej pierwotne preadipocyty z wysoką gęstością, np. 1 x 105 komórek/dołek w płytce 24-dołkowej w 1 mL/dołek pożywki hodowlanej (15% surowicy z płodu bydlęcego (FBS) i 1x penicylina-streptomycyna-glutamina w DMEM/F12).</li>
			<li>Po osiągnięciu przez komórki 100% konfluencji, różnicuj je przez 3 dni w pożywce hodowlanej z dodatkiem 5 µM deksametazonu, 0,5 mM 3-izobutyl-1-metylksantyny, 1 µg/mL insuliny oraz 1 µM tiazolidynedionu (TZD). Następnie zmień pożywkę na pożywkę hodowlaną z 1 µg/mL insuliny na co najmniej 3 dni, aby umożliwić wzrost kropli lipidowych. W płytce 24-dołkowej stosuj 1 mL/dołek pożywki.</li>
			<li>Wymieniaj pożywkę hodowlaną (1 ml/dołek) z insuliną co 2 lub 3 dni. Komórki mogą być utrzymywane w pożywce z insuliną do 2 tygodni. Do tego testu wykorzystuj tylko hodowle, w których stopień różnicowania przekracza 90% i jest zbliżony we wszystkich grupach, ponieważ obniżone różnicowanie mogłoby zostać błędnie zinterpretowane jako spadek tempa lipolizy.</li>
			<li>Przez 24 h przed pomiarem lipolizy hoduj komórki w pożywce bez insuliny. 
			UWAGA: Insulina w pożywce utrzymuje krople lipidowe, ale jednocześnie hamuje lipolizę. Inkubacja bez insuliny przez 24 h pozwala na pełną aktywację lipolityczną bez utraty objętości kropli lipidowych. W niektórych systemach czas hodowli bez insuliny może wymagać skrócenia lub wydłużenia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przemyj komórki raz DPBS, aby usunąć resztki surowicy z pożywki hodowlanej. 
		UWAGA: Niniejszy protokół nie obejmuje głodzenia surowiczego, które może aktywować lipolizę. Głodzenie surowicze może zostać zastosowane według uznania badacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź hodowlę ex vivo zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Przygotuj płytkę 6-dołkową, przeznaczając jeden dołek dla każdej tkanki pobieranej od każdej myszy. Do każdego używanego dołka wlej 4 mL DMEM o temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Dodawanie BSA do pożywki zbierającej nie jest konieczne.</li>
		<li>Przygotuj płytkę 48-dołkową do testu lipolizy, z jednym dołkiem dla każdej replikacji. Do każdego używanego dołka wlej 400 µL DMEM o temperaturze pokojowej. Dla każdej tkanki od każdej myszy przygotuj od dwóch do czterech dołków kontrolnych i od dwóch do czterech dołków stymulowanych.</li>
		<li>Uśmierć mysz poprzez zwichnięcie karku pod narkozą, stosując metodę wtórną, taką jak obustronny odma opłucnowa. W tym przypadku użyto 7-miesięcznej samicy myszy C57BL/6J o masie 32 g, karmionej przez 4 miesiące dietą wysokotłuszczową (45%). 
		UWAGA: Protokół ten można stosować również w przypadku samców, jak i innych szczepów, diet oraz grup wiekowych.</li>
		<li>Spryskaj 70% etanolem i za pomocą nożyczek wykonaj niewielkie (~ 1 cm) nacięcie poprzeczne w centrum skóry brzucha; rozsunie skórę, chwytając kciukiem i palcem wskazującym obie strony, i odchyl skórę dolnego brzucha, aby odsłonić tylne magazyny podskórne. Zlokalizuj i usuń węzeł chłonny pachwinowy, a następnie przeprowadź tępą dyssekcję tkanki tłuszczowej pachwinowej znajdującej się bezpośrednio za węzłem chłonnym, używając pincety.</li>
		<li>Aby pobrać tkankę tłuszczową gonadalną, wykonaj nacięcie poprzeczne i pionowe w otrzewnej, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej. Chwyć pęczek tłuszczowy gonadalny pęsetą i przetnij wzdłuż macicy (lub najdائدka u samców), aby usunąć tkankę tłuszczową gonadalną. Umieść pobrane magazyny tłuszczowe w płytce 6-dołkowej.</li>
		<li>Wyjmij tkankę z dołka, połóż na macie silikonowej i potnij nożyczkami na kawałki o masie od 5 do 7 mg.</li>
		<li>Odważ od 25 do 30 mg (pięć lub sześć kawałków) do każdego dołka testowego i umieść w 48-dołkowej płytce testowej. Przed ważeniem osusz tkankę czystym ręcznikiem, aby usunąć resztki pożywki. Zważ łódeczkę po usunięciu tkanki i zapisz masę wszelkich pozostałości. Przetrzyj łódeczkę do czystości między próbkami i w razie potrzeby ponownie ustaw tarę. Dla każdej tkanki używaj nowej łódeczki.</li>
		<li>Po zważeniu wszystkich próbek tkanek umieść 48-dołkową płytkę testową w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 10% CO2 na 15 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza lipolizy
<ol>
	<li>Przeprowadzić pobieranie pożywki. Przeniesienie pożywki i następujące po nim pobieranie próbek należy wykonać w sterylnej komorze z wyciągiem, aby zminimalizować możliwość kontaminacji z zewnętrznych źródeł.
	<ol>
		<li>W czasie t = 0 usunąć pożywkę, dodać 400 µL na studzienkę pożywki kontrolnej lub stymulującej, a następnie umieścić płytkę testową w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 10% CO2. W przypadku hodowli tkanek ex vivo pożywkę należy ostrożnie usunąć za pomocą pipety; nie wolno używać odsysania. 
		UWAGA: Alternatywnie można przygotować drugą płytkę z pożywką kontrolną i stymulującą, a następnie przenieść tkanki.</li>
		<li>W czasie t = 1, 2, 3 i 4 h pobrać 200 µL pożywki, zastąpić ją 200 µL odpowiedniej pożywki kontrolnej lub stymulującej i zwrócić płytkę testową do inkubatora. Płytkę z pobranymi próbkami przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby określić pojemność buforową FFA pożywki BSA, należy pobrać dodatkową próbkę w 24 h. 
		UWAGA: Eksperymenty można przerwać na tym etapie, a pobraną pożywkę przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kolorymetryczny test FFA
<ol>
	<li>Ogrzać odczynniki do temperatury pokojowej, a następnie rozpuścić jedną butelkę odczynnika barwnego A w jednej butelce rozpuszczalnika A oraz jedną butelkę odczynnika barwnego B w jednej butelce rozpuszczalnika B. Od daty przygotowania odczynniki te najlepiej wykorzystać w ciągu 1 tygodnia. Utylizować po 1 miesiącu od przygotowania.</li>
	<li>Rozmrozić i wymieszać próbki.</li>
	<li>Sporządzić krzywą wzorcową dla FFA. Roztwór wzorcowy ma stężenie 1 mM. Do sporządzenia krzywej wzorcowej z odczynnikami należy użyć następujących objętości: 25 µL, 20 µL, 15 µL, 10 µL, 10 µL (rozcieńczenie 1:2), 10 µL (rozcieńczenie 1:4), 10 µL (rozcieńczenie 1:8) oraz 10 µL wody dla maksymalnego zakresu. W przypadku niskich poziomów FFA bardziej odpowiednie może być zastosowanie 10 µL standardu o stężeniach 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM i 0,05 mM.</li>
	<li>Nanieść standardy i próbki do płytki testowej 96-dołkowej. Zalecana objętość próbki wynosi 10 µL. W celu korekcji tła należy uwzględnić trzy dołki z taką samą objętością medium BSA jak w przypadku próbek. 
	UWAGA: Jeśli stężenia próbek wykraczają poza zakres krzywej wzorcowej, należy powtórzyć test, dostosowując objętość próbki do zakresu 2-25 µL.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 150 µL odczynnika A i wymieszać. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Ewentualne pęcherzyki należy przebić cienką igłą. Inkubować płytkę testową w temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
	<li>Odczytać absorbancję płytki przy 550 nm oraz referencyjnie przy 660 nm (Odczyt A).</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 75 µL odczynnika B i wymieszać. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Ewentualne pęcherzyki należy przebić cienką igłą. Inkubować płytkę testową w temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
	<li>Ponownie odczytać absorbancję płytki przy 550 nm oraz referencyjnie przy 660 nm (Odczyt B).</li>
</ol>
5. Kolorymetryczny test glicerolu
<ol>
	<li>Zrekonstytuuj odczynnik do wolnego glicerolu, dodając 36 mL wody ultrapurej, i doprowadź do temperatury pokojowej. Odczynniki te najlepiej zużyć w ciągu kilku tygodni. Usuń je po 2 miesiącach od rekonstytucji.</li>
	<li>Rozmroź i wymieszaj próbki.</li>
	<li>Utwórz krzywą standardową glicerolu, wykonując siedmiopunktowe, dwukrotne rozcieńczenie seryjne roztworu standardu glicerolu oraz próbę ślepą z wodą. 
	UWAGA: Krzywa standardowa jest względnie liniowa do 25 µL glicerolu o stężeniu 2,8 mM, lecz nie jest liniowa przy wyższych stężeniach.</li>
	<li>Pipetuj po 25 µL standardu i próbek do płytki testowej z 96 dołkami. Uwzględnij trzy dołki z podłożem BSA do korekcji tła.</li>
	<li>Dodaj 175 µL odczynnika do wolnego glicerolu do każdego dołka i wymieszaj. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki usuwaj za pomocą cienkiej igły. Inkubuj płytkę testową w temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
	<li>Zreaduj absorbancję płytki przy 540 nm.</li>
</ol>
6. Obliczanie szybkości lipolizy
<ol>
	<li>Zacznij od wartości gęstości optycznej (OD). W przypadku glicerolu użyj bezpośrednio wartości OD A540. Oblicz OD dla analizy FFA zgodnie z następującym wzorem: 
	OD = (Odczyt B: A550 - A660) - (Odczyt A: A550 - A660)</li>
	<li>Wykorzystaj krzywą wzorcową do obliczenia poziomów FFA i glicerolu w zebranych próbkach. Wykres wartości wzorcowych OD nanieś na oś y, a na osi x umieść wzorcowe stężenia w stosunku do objętości próbki (np. stężenie w studzienkach z 20 µL standardu 1 mM FFA na płytce z próbkami 10 µL jest równe 2 mM). Dopasuj liniową linię trendu: 
	y = mx + b</li>
	<li>Dokonaj wizualnej oceny krzywej wzorcowej i usuń wszelkie punkty znajdujące się poza zakresem liniowości analizy. Oblicz stężenia próbek, korzystając z równania: 
	Stężenie próbki: x = (OD - b) ÷ m</li>
	<li>Skoryguj i ponownie przeanalizuj próbki wykraczające poza liniowy zakres analizy. Aby uzyskać końcowe stężenie próbki, od stężenia próbek odejmij stężenie studzienek tła zawierających jedynie medium z BSA.</li>
	<li>Oblicz liczbę moli FFA i glicerolu wytworzonych przez każdą próbkę w każdym punkcie czasowym zgodnie ze wzorem: 
	<img alt="Obliczanie masy cząsteczkowej, wzór Mn=Cn×Vt+ΣCkVs, metoda analizy chemicznej." src="/files/ftp_upload/65106/65106eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie Cn = stężenie w czasie t = n; Vt = całkowita objętość w studzience; Vs = objętość pobranej próbki; a Mn = mole wytworzone w czasie t = n (jeśli stężenia podano w mM, a objętości w mL, wynikiem są µMol). 
	Przykłady dla różnych punktów czasowych: 
	M1 = C1 × Vt 
	M4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs 
	lub 
	M4 = C4 × Vt + C3 × Vs + C2 × Vs + C1 ×Vs</li>
	<li>Znormalizuj wynik do masy tkanki, dzieląc go przez masę tkanki dla każdej próbki w gramach, aby uzyskać jednostki µmol/g. Dla komórek hodowlanych wartości przedstawia się jako µmol/studzienkę. Upewnij się, że liczba komórek i efektywność różnicowania są porównywalne między poszczególnymi studzienkami. 
	UWAGA: Różnice w proliferacji lub efektywności różnicowania utrudnią interpretację wyników i będą wymagać innej metody normalizacji (np. normalizacji do białka; patrz sekcja dyskusja).</li>
	<li>Oblicz nachylenie krzywej wytworzonych µmol/g (oś y) względem czasu (oś x) oddzielnie dla każdej próbki.
	<ol>
		<li>W arkuszu kalkulacyjnym można to zrobić za pomocą funkcji =SLOPE(known_ys,known_xs). W nowej komórce wpisz "=SLOPE" (następnie użyj kursora, aby zaznaczyć wartości glicerolu lub FFA dla próbki w µmol/g, a potem odpowiednie wartości czasu).</li>
		<li>Zweryfikuj liniowość danych. Wartości R2 są szybkim sposobem określenia liniowości próbek. W arkuszu kalkulacyjnym można to zrobić za pomocą funkcji =RSQ(known_ys,known_xs), w ten sam sposób, jak opisano w kroku 6.7.1, jednak początkowym wpisem jest =RSQ. Upewnij się, że wartości R2 są &gt; 0,98; niższe wartości wskazują na odchylenie od liniowości. Może to wynikać z błędu pomiarowego/pobierania próbek lub utraty liniowości.
		<ol>
			<li>Innym sposobem testowania liniowości jest przeprowadzenie regresji liniowej dla każdej próbki i wykreślenie reszt. W programie do analizy statystycznej wygeneruj tabelę XY z pojedynczą wartością Y dla każdego punktu czasowego. Wybierz Analyze &gt; Simple linear regression i zaznacz pole Residual Plot przed zatwierdzeniem przyciskiem OK. Wykres reszt pojawi się jako nowy wykres.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykorzystaj tempo produkcji FFA i glicerolu (tj. nachylenie [µmol/g/h]) dla każdej próbki jako pojedynczy punkt danych do przeprowadzenia analizy statystycznej i nanieś wartości na wykres, jeśli porównywane są różne warunki lipolizy. Jeśli tempo lipolizy jest porównywane między genotypami, użyj dwóch lub trzech próbek od jednego zwierzęcia jako powtórzeń technicznych i wykorzystaj średnią jako jeden punkt danych na zwierzę, tak aby wielkość próby była równa liczbie zwierząt.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy podstawowy protokół pomiaru szybkości lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo . Aby określić ilościowo lipolizę, ważne jest zmierzenie szybkości lipolitycznej w fazie liniowej. Stosujemy technikę próbkowania seryjnego, w której duża część pożywki jest zbierana i zastępowana świeżą pożywką w regularnych odstępach czasu. Ta półkonserwatywna metoda pozwala na dodanie świeżego BSA o pojemności buforowej FFA i opóźnia hamowanie sprzężenia zwrotnego, wydłużając czas trwania lipo...

Nadmiar składników odżywczych jest magazynowany w białej tkance tłuszczowej w postaci trójglicerydów w neutralnym rdzeniu lipidowym kropel tłuszczowych. Zapasy trójglicerydów są mobilizowane poprzez lipoliza, proces, w którym łańcuchy boczne kwasów tłuszczowych są sekwencyjnie odcinane przez lipazę trójglicerydów tkanki tłuszczowej (ATGL), lipazę wrażliwą na hormony (HSL) oraz lipazę monoglicerydów (MGL), co prowadzi do uwolnienia wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) i szkieletu glicerolu1,2Lipoliza jest aktywowana przez sygnalizację katecholaminową w tkance tłuszczowej. Zakończenia nerwów współczulnych uwalniają lokalnie katecholaminy, które wiążą się z receptorami β-adrenergicznymi na błonie komórkowej adipocytów. Po związaniu ligandu te receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) aktywują cyklazę adenylową. poprzez GαsNastępująca po tym aktywacja kinazy białkowej A (PKA) przez cAMP prowadzi do upregulacji zarówno ATGL, jak i HSL. Fosforylacja perilipiny-1 przez PKA powoduje dysocjację ABHD5 (znanego również jako CGI-58), który wiąże i koaktywuje ATGL.3PKA bezpośrednio fosforyluje HSL, co sprzyja jego translokacji z cytozolu do kropel lipidowych, gdzie interakcja z fosforylowaną perilipiną-1 dodatkowo zwiększa jego aktywność lipazy.4,5,6,7Trzecia lipaza uczestnicząca w lipolizie, MGL, nie wydaje się być regulowana przez sygnalizację katecholaminową.8Ważne jest, że synteza triglicerydów w adipocytach odbywa się za pośrednictwem szlaku syntezy lipidów glicerolowych, w którym nie dochodzi do powstawania monoglicerydów jako produktów pośrednich; zamiast tego acylotransferazy glicerolo-3-fosforanowe katalizują powstawanie kwasu lizofosfatydowego, który łączy się z kolejnym acylo-CoA kwasu tłuszczowego, tworząc kwas fosfatydowy, a następnie ulega izomeryzacji do diglicerydów przed końcową syntezą triglicerydów (Rycina 1)9,10,11.
<img alt="Schemat szlaków lipolizy i syntezy lipidów glicerolowych z reakcjami TG, DG, MG i enzymami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65106/65106fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Szlaki lipolizy i syntezy lipidów glicerolowych. Góra: szlak lipolityczny; enzymy zaznaczone na czerwono: lipaza trójglicerydów tkanki tłuszczowej (ATGL), lipaza wrażliwa na hormony (HSL) oraz lipaza monoglicerydów (MGL). Dół: szlak syntezy lipidów glicerolowych; enzymy zaznaczone na zielono: acylotransferaza diglicerydowa (DGAT), fosfatydowa kwasowa fosfataza (PAP), acylotransferaza lizofosfatydowa (LPAT, znana również jako LPAATs) oraz acylotransferaza glicerolo-3-fosforanowa (GPAT). Lipidy: trójglicerydy (TG), diglicerydy (DG), monoglicerydy (MG), wolne kwasy tłuszczowe (FFA), acylo-CoA kwasów tłuszczowych (FA-CoA), kwas lizofosfatydowy (LPA) i kwas fosfatydowy (PA). Inne metabolity: fosforan nieorganiczny (Pi) i glicerolo-3-fosforan (G3P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65106/65106fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Zewnątrzkomórkowa adenozyna jest kolejnym istotnym regulatorem lipolizy, działającym poprzez Gs- oraz Gi-sprzężone receptory GPCR wpływające na aktywność cyklazy adenylowej. Dominującym receptorem adenozyny w adipocytach jest ADORA1, który hamuje cyklazę adenylową, a tym samym lipolizę, poprzez aktywację Gi12Wyrażany na niższym poziomie, głównie w adipocytach brunatnych, receptor ADORA2A aktywuje lipolizę poprzez Gs sygnalizacja13ADORA1 wpływa zarówno na lipolizę podstawową, jak i na odpowiedź na agonistów adrenergicznych. Wpływ adenozyny na lipolizę można kontrolować poprzez dodanie dehydrogenazy adenozynowej w celu neutralizacji adenozyny, a także poprzez zastosowanie swoistego agonisty ADORA1, fenyloizopropyladenozyny.14,15Hormonalna aktywacja białek GqGPCR sprzężone z białkami G mogą również wpływać na lipolizę poprzez aktywacja fosfolipazy C i kinazy białkowej C16,17,18,19Sygnały zapalne wpływają również na tempo lipolizy. Aktywacja TLR4 przez LPS (oraz inne endotoksyny) zwiększa tempo lipolizy poprzez aktywację ERK, która fosforyluje perilipinę-1 oraz HSL.20TNF-α aktywuje również lipolizę poprzez Aktywacja ERK i NF-κB, a także transcriptionalne obniżenie poziomu fosfodiesterazy PDE-3B i białka CIDEC21,22,23IL-6 powiązano również ze zwiększoną lipolizą adipocytów, szczególnie w tkance tłuszczowej krezkowej, której uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) wpływa na stłuszczenie wątroby oraz glukoneogenezę.24,25,26.
Lipoliza jest hamowana podczas stanu sytości przez insulinę. AKT fosforyluje i aktywuje PDE-3B, aby stłumić sygnalizację cAMP i zapobiec aktywacji PKA27. Insulina powoduje również transkrypcyjne obniżenie poziomu ATGL28. Otyłość sprzyja oporności na katecholaminy poprzez szereg mechanizmów, w tym obniżenie poziomu receptorów β-adrenergicznych w adipocytach29,30,31,32,33. Adipocyty wykazują ekspresję wszystkich trzech receptorów β-adrenergicznych (β-1, β-2 i β-3). Podczas gdy receptory β-1 i β-2 adrenergiczne są wykazane powszechnie, receptor β-3 adrenergiczny jest ekspresjonowany głównie w adipocytach myszy34,35. Ekspresja Adrb3 jest indukowana przez C/EBPα podczas adipogenezy36. Receptor β-3 adrenergiczny jest silnie ekspresjonowany w dojrzałych adipocytach. Aktywacja receptorów β-1 i β-2 adrenergicznych jest samograniczająca ze względu na hamowanie zwrotne przez β-arestynę37. Hamowanie zwrotne receptora β-3 adrenergicznego jest zapśredniczone przez inne szlaki sygnalizacyjne, które obniżają ekspresję Adrb333,38,39.
Do aktywacji lipolizy w adipocytach można wykorzystać liczne związki. Głównymi fizjologicznymi aktywatorami lipolizy są katecholaminy. Norepinefryna (lub noradrenalina) oraz epinefryna (lub adrenalina) aktywują wszystkie trzy rodzaje receptorów β-adrenergicznych40. Norepinefryna i epinefryna wpływają również na lipolizę via aktywację sygnalizacji receptora α-adrenergicznego41. Do powszechnie stosowanych agonistów receptorów β-adrenergicznych należą izoproterenol, który jest nieselektywnym agonistą receptorów β-adrenergicznych, oraz agoniści receptora β-3 adrenergicznego: CL-316,243 i mirabegron42. Biorąc pod uwagę, że adipocyty wykazują nadekspresję receptora β-3 adrenergicznego, w niniejszym przykładzie zastosowano CL-316,243. Jego specyficzność względem receptora β-3 adrenergicznego sprawia, że jest on stosunkowo specyficznym aktywatorem sygnalizacji katecholaminowej w adipocytach, który może być również bezpiecznie stosowany in vivo. Należy zauważyć, że powszechnie stosowane w hodowlach komórkowych stężenie 10 µM CL-316,243 jest o wiele rzędów wielkości wyższe niż dawka ~0.1 µM wymagana do uzyskania maksymalnej odpowiedzi33. Forskolina omija receptor adrenergiczny, bezpośrednio aktywując cyklazę adenylową i downstreamową sygnalizację lipolityczną. Istnieje wiele innych aktywatorów, a także supresorów lipolizy. Podczas wyboru związku do stymulacji lipolizy, specyficzność receptorowa oraz downstreamowe szlaki sygnalizacyjne powinny zostać dokładnie rozważone w ramach projektu eksperymentalnego.
Szybkość lipolizy w białej tkance tłuszczowej jest istotnym czynnikiem metabolicznym wpływającym na odporność na zimno oraz dostępność składników odżywczych podczas głodzenia lub wysiłku fizycznego.43,44,45,46Celem niniejszego protokołu jest pomiar szybkości lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej, co ułatwi zrozumienie metabolizmu adipocytów oraz wpływu tego procesu na fenotyp metaboliczny różnych modeli mysich. W celu ilościowego oznaczenia szybkości lipolizy mierzy się pojawianie się produktów lipolizy w medium (tj. wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu). Metoda ta opiera się na uwalnianiu produktów lipolizy z adipocytu do medium. Ponieważ białe adipocyty wykazują niską ekspresję kinazy glicerolowej, szybkość ponownego wychwytu glicerolu jest niewielka.47Z drugiej strony należy również wziąć pod uwagę produkcję wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) i glicerolu poprzez szlaki metaboliczne inne niż lipoliza. Adipocy wydają się wykazuje ekspresję fosfatazy o aktywności wobec glicerolu-3-fosforanu, co umożliwia produkcję glicerolu z glicerolu-3-fosforanu pochodzącego z glukozy.48,49,50Glikoliza stanowi źródło glicerolu-3-fosforanu wykorzystywanego do reestryfikacji wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) w białych adipocytach. W przypadku ograniczonej dostępności glukozy glikeryoneogeneza wymaga innych źródeł trzech węgli, takich jak mleczan i pirogronian.51Kierunek transportu wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) uwalnianych w wyniku lipolizy wewnątrzkomórkowej oraz ich dalszy los metaboliczny nie są dobrze poznane; FFA uwalniane podczas lipolizy muszą zostać przekształcone w acylo-CoA przed ponowną estryfikacją lub poddaniem $\beta$-oksydacji. Wydaje się, że FFA uwalniane w wyniku lipolizy najprawdopodobniej opuszczają komórkę, zanim zostaną ponownie pobrane i przekształcone w acylo-CoA.52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62Wolne kwasy tłuszczowe (FFA) mogą być wiązane poza komórką przez albuminy. Co istotne, wiadomo, że długołańcuchowe FFA wywierają hamujące działanie zwrotne na lipolizę, jeśli nie zostaną one związane przez albuminy.63,64,65,66,67Zatem optymalizacja zdolności buforującej wolne kwasy tłuszczowe (FFA) w pożywkach podczas testu lipolizy ma kluczowe znaczenie. Opisana tutaj procedura jest podobna do wcześniej opublikowanych metod pomiaru szybkości lipolizy w adipocytach i ex vivo tkanka tłuszczowa myszy i ludzi15,68,69,70,71Protokół ten różni się zastosowaniem próbkowania seryjnego; dzięki niemu możemy wewnętrznie potwierdzić, że lipoliza jest mierzona w fazie liniowej, oraz wykorzystać wielokrotne pomiary do obliczenia szybkości lipolizy, co redukuje błąd pomiarowy i zwiększa pewność końcowej obliczonej wartości. Wadą próbkowania seryjnego jest fakt, że analiza wymaga więcej czasu i odczynników; jednak dłuższy czas trwania badania zmniejsza wpływ błędu pomiarowego na błąd standardowy szacunków szybkości. Ponadto protokół ten mierzy uwalnianie zarówno wolnych kwasów tłuszczowych (FFA), jak i glicerolu, oraz analizuje stosunek uwalniania FFA do glicerolu z celem osiągnięcia proporcji 3:1, czego należałoby oczekiwać przy pełnej lipolizie i uwalnianiu produktów lipolitycznych do medium.72.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka poddana hodowli tkankowej</td><td>Corning Inc</td><td>3527</td><td>Musi być poddana hodowli tkankowej pod kątem różnicowania adipocytów</td></tr><tr><td>48-dołkowa płaska płytka dolna z pokrywką</td><td>Corning Inc</td><td>353078</td><td>Może być poddana obróbce kultur tkankowych</td></tr><tr><td>6-dołkowa płaska płyta dolna z pokrywką</td><td>Corning Inc</td><td>353046</td><td>Może być traktowana kulturą tkankową</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka PCR</td><td>USA sceintific</td><td>1402-9100</td><td>Każda stożkowa płytka PCR 0,2 ml będzie wygodna&nbsp;</td></tr><tr>Powszechnie stosowana jest <td>również albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>FFA free BSA, taka jak A8806. BSA nie powinno mieć wykrywalnego FFA, również wiele zmian w BSA może wpływać na obserwowaną szybkość lipolizy</td></tr><tr><td>CL-316,243</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5976</td><td>CAS #: 138908-40-4 dostępne u innych dostawców</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVH</td><td>CO2 powinien być idealnie ustawiony na 10% dla tkanki tłuszczowej, jednak 5% CO2 będzie również działać</td></tr><tr><td>DMEM, niska glukoza, brak czerwieni fenolowej</td><td>Thermofischer</td><td>11054020</td><td>Wszelkie podłoża wolne od czerwieni fenolowej powinny działać, DMEM/F12, RPMI, ale powinny zawierać lotną zdolność buforową, tj.</td></tr><tr><td>albuminę surowicy bydlęcej wolną od biowęglanu FFA</td><td>Equitech-Bio, Inc,&nbsp;</td><td>BAH66</td><td></td></tr><tr><td>Wolny odczynnik glicerolowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wzorcowy glicerolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7793&nbsp;</td><td>Można to również osiągnąć poprzez rozcieńczenie glicerolu do pożądanego stężenia</td></tr><tr><td>Standardowe rozwiązanie NEFA serii HR Fujifilm</td><td></td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>Seria HR NEFA-HR (2) Odczynnik kolorowy A</td><td>Fujifilm</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>Seria HR NEFA-HR (2) Odczynnik kolorystyczny B</td><td>Fujifilm</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>Seria HR NEFA-HR (2) Rozpuszczalnik A&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR Series NEFA-HR (2) Rozpuszczalnik B&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator mikrobiologiczny</td><td>Fischer Scientific</td><td>S28668</td><td>Można użyć dowolnego inkubatora o temperaturze 37C</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-dołkowe płytki</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td><td>Dowolna optycznie przezroczysta, 96-dołkowa płytka z płaskim dnem działa</td></tr><tr><td>Silikonowa laboratoryjna mata stołowa</td><td>VWR</td><td>76045-300</td><td>Można również użyć szklanej płyty. Powierzchnie chłonne nie są zalecane</td></tr><tr><td>Spektrofotometr/czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax i3x&nbsp;</td><td>Każdy czytnik płytek, który może odczytywać na 540, 550 i 660 mm, będzie działał</td></tr><tr><td>V Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810531</td><td></td></tr><tr><td>WypAll X70 Wycieraczki</td><td>Kimberly-Clark</td><td>41200</td><td>Każdy wysokiej jakości ręcznik papierowy będzie działał</td></tr></tbody></table>

pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipocyty magazynują energię w postaci trójglicerydów w kropelkach lipidów. Energia ta może być mobilizowana poprzez lipolizę, w której łańcuchy boczne kwasów tłuszczowych są sekwencyjnie odcinane od szkieletu glicerolu, co powoduje uwolnienie wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu. Ze względu na niską ekspresję kinazy glicerolowej w białych adipocytach, wskaźniki wychwytu zwrotnego glicerolu są znikome, podczas gdy wychwyt zwrotny kwasów tłuszczowych jest podyktowany zdolnością wiązania kwasów tłuszczowych składników pożywki, takich jak albumina. Zarówno uwalnianie glicerolu, jak i kwasów tłuszczowych do pożywki można określić ilościowo za pomocą testów kolorymetrycznych w celu określenia szybkości lipolitycznej. Mierząc te czynniki w wielu punktach czasowych, można z dużą pewnością określić liniową szybkość lipolizy. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru lipolizy w adipocytach zróżnicowanych in vitro i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy. Protokół ten może być również zoptymalizowany pod kątem innych linii komórkowych preadipocytów lub tkanki tłuszczowej z innych organizmów; Omówiono zagadnienia i parametry optymalizacyjne. Protokół ten został zaprojektowany tak, aby był przydatny w określaniu i porównywaniu szybkości lipolizy adipocytów między modelami mysimi a leczeniem.

Zmierzyliśmy podstawowe i stymulowane tempo lipolizy w adipocytach zróżnicowanych in vitro. Pierwotne preadipocyty z białej tkanki tłuszczowej pachwinowej zróżnicowano do adipocytów poprzez traktowanie konfluencyjnych komórek 5 µM deksametazonem, 0,5 mM IBMX, 1 µg/mL insuliną oraz 1 µM troglitazonem przez 4 dni, a następnie dodatkowym 3-dniowym traktowaniem 1 µg/mL insuliną. Przed testem lipolizy komórki inkubowano w pośrodku bez insuliny przez 24 h. W czasie t = 0 h komórki przemyto raz PBS, a następnie do każd...

Lipoliza triglicerydowa w adipocytach jest ważnym procesem metabolicznym, w wyniku którego uwalniane są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru podstawowej i stymulowanej lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy.

Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

Protokół ten szczegółowo opisuje określenie szybkości lipolizy adipocytów w hodowanych adipocytach lub tkance tłuszczowej ex vivo, co pozwala na porównanie wskaźników lipolitycznych między modelami mysimi lub zabiegami. Protokół ten wykorzystuje próbkowanie szeregowe, co pozwala na wewnętrzną walidację, że lipoliza jest mierzona w fazie liniowej i zmniejsza błąd pomiaru. Dzięki optymalizacji protokół ten może być stosowany do pomiaru lipolizy w brunatnej tkance tłuszczowej, tkance tłuszczowej innych organizmów lub adipogennych liniach komórkowych.Tkanki ex vivo muszą być pokrojone na małe kawałki o jednakowej wielkości i kształcie, aby umożliwić sekwestrację uwolnionych wolnych kwasów tłuszczowych przez BSA w pożywce. Na początek przygotuj pożywkę 5% BSA, rozpuszczając pięć gramów albuminy surowicy bydlęcej lub BSA w 100 mililitrach zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium lub DMEM firmy Dulbecco bez czerwieni fenolowej. Delikatnie wymieszaj roztwór, aby rozpuścić BSA.Następnie należy przygotować stężenia robocze pożywek kontrolnych i stymulacyjnych. Przed użyciem podgrzej podłoże do 37 stopni Celsjusza. Oznacz 96-dołkową płytkę do zbierania nośników.Wewnątrz sterylnego dygestorium wy

measuring-rate-lipolysis-ex-vivo-murine-adipose-tissue-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tkanka tłuszczowa (AT) może wpływać na homeostazę całego organizmu, dlatego zrozumienie molekularnych mechanizmów różnicowania i funkcji adipocytów jest ważne. Udostępniamy protokół uzyskiwania nowych informacji na temat tych procesów poprzez analizę homeostazy, różnicowania i ekspozycji na niedotlenienie adipocytów jako modelu indukowanej apoptozy adipocytów.

Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

Ten protokół opisuje metodę określania podstawowej i stymulowanej forskoliną lipolizy w pachwinowych poduszeczkach tłuszczowych uzyskanych z normalnej diety karmowej (NCD) lub diety wysokotłuszczowej (HFD) ± myszy dzikich karmionych kapsaicyną. Jako wskaźnik lipolizy mierzono uwalnianie glicerolu z pachwinowych poduszek tłuszczowych.

Pomiar lipolizy podstawowej i stymulowanej forskoliną w pachwinowych poduszeczkach tłuszczowych

Ten artykuł zawiera trzy łatwe i łatwo dostępne testy do oceny metabolizmu lipidów u myszy.

Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Jajowód (FT) wyłania się jako alternatywne miejsce pochodzenia surowiczego raka jajnika (SOC). Niniejszy protokół opisuje nową metodę izolacji i hodowli ex vivo komórek nabłonkowych jajowodu. System ten odwzorowuje nabłonek in vivo i umożliwia badanie patogenezy SOC.

Kultura ex vivo pierwotnych ludzkich komórek nabłonkowych jajowodu

Poznaj metodę pomiaru lipolizy w tkance tłuszczowej myszy ex vivo i preadipocytach in vitro. Protokół wykorzystuje próbkowanie szeregowe i enzymatyczne oznaczanie kwasów tłuszczowych oraz glicerolu.

Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro

Przeglądaj więcej filmów