Name: Dowody na ekspresję EpCAM i cytokeratyny w komórkach nabłonkowych w normalnej ludzkiej i mysiej krwi i szpiku kostnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek nabłonkowych z krwi i szpiku kostnego myszy oraz ludzi przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badania w biologii komórkowej i regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Josh Monts, technik cytometru przepływowego, Instytut Hormela
Todd Schuster, kierownik głównego obiektu, Instytut Hormel
Derek Gordon, statystyk, Uniwersytet Rutgers
Chcielibyśmy podziękować Karen Klein z Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM za jej pomoc redakcyjną.
Ta praca była częściowo wspierana przez Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem Nagrody R21 AR075281, oraz Grant-in-Aid of Research, Artistry and Scholarship, Office of the Vice President for Research, University of Minnesota (Propozycja #324240). Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie ze strony Instytutu Hormel.

<ol><li>Larsen, S. B., Cowley, C. J., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cells%3A+liaisons+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cells: liaisons of immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 62, 45-53 (2020).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281(2014).</li>
<li>Coradini, D., Casarsa, C., Oriana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+polarity+and+tumorigenesis%3A+New+perspectives+for+cancer+detection+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell polarity and tumorigenesis: New perspectives for cancer detection and treatment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 32 (5), 552-564 (2011).</li>
<li>Dmello, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+role+of+keratins+in+epithelial+cell+differentiation+and+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Multifaceted role of keratins in epithelial cell differentiation and transformation.</a> Journal of Biosciences. 44 (2), 33(2019).</li>
<li>Poulet, G., Massias, J., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+General+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cytologica%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: General concepts.</a> Acta Cytologica. 63 (6), 449-455 (2019).</li>
<li>Eslami-S, Z., Cortés-Hernández, L. E., Alix-Panabières, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule%3A+an+anchor+to+isolate+clinically+relevant+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule: an anchor to isolate clinically relevant circulating tumor cells.</a> Cells. 9 (8), 1836(2020).</li>
<li>Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+quintessential+precision+oncology+presenting+challenges+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: quintessential precision oncology presenting challenges for biology.</a> NPJ Precision Oncology. 1 (1), 16(2017).</li>
<li>Lin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+biology+and+clinical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: biology and clinical significance.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 404(2021).</li>
<li>Spence, M., Adai, S., Landon, T., Richter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Few+and+far+between%3A+Tools+and+strategies+for+rare-event+detection+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22BioprobesJournal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Few and far between: Tools and strategies for rare-event detection using flow cytometry.</a> BioprobesJournal of Cell Biology. 71, 14-18 (2015).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> Journal of Cell Biology. 192 (3), 373-382 (2011).</li>
<li>Ye, Q., Ling, S., Zheng, S., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+in+hepatocellular+carcinoma%3A+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy in hepatocellular carcinoma: circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 114(2019).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+epithelial+cells+and+hair+follicle+stem+cells+contribute+to+development+of+chronic+cutaneous+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms.</a> Nature Communications. 9 (1), 5293(2018).</li>
<li>Marsman, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cells+in+bone+marrow%3A+do+they+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Epithelial cells in bone marrow: do they matter.</a> Gut. 54 (12), 1821-1822 (2005).</li>
<li>Borue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+cells+contribute+to+epithelial+engraftment+during+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">marrow-derived cells contribute to epithelial engraftment during wound healing.</a> The American Journal of Pathology. 165 (5), 1767-1772 (2004).</li>
<li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+cells+contribute+to+the+maintenance+of+thymic+stroma+including+TECs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">marrow-derived cells contribute to the maintenance of thymic stroma including TECs.</a> Journal of Immunology Research. 2022, 6061746(2022).</li>
<li>Krause, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-organ%2C+multi-lineage+engraftment+by+a+single+bone+marrow-derived+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.</a> Cell. 105 (3), 369-377 (2001).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cell+replacement+with+bone+marrow+cells+for+airway+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Targeted cell replacement with bone marrow cells for airway epithelial regeneration.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L740-L752 (2007).</li>
</ol>

Nie są znane żadne konflikty interesów.

W literaturze istnieją pewne dowody na obecność komórek nabłonkowych w szpiku kostnym. Wcześniej prace zazwyczaj badały rolę komórek nabłonkowych w kontekście chorób i urazów, takich jak wątroba, płuca, przewód pokarmowy (GI), grasica i skóra 14,15,16,17. Jednak niewiele wiadomo na temat obecności tych komórek nabłonkowych w szpiku kostnym zdrowych osób. Niniejsza praca ma na celu ustalenie powtarzalnej metody w celu identyfikacji i wyizolowania komórek nabłonkowych z prawidłowej krwi i szpiku kostnego. Metoda ta przyczyni się do rozwoju w terenie, aby określić, dlaczego komórki nabłonkowe są obecne i jaka jest ich rola we krwi i szpiku kostnym przy braku choroby; Być może komórki te są częścią normalnej konserwacji tkanek lub są aktywowane w czasie urazu. Szpik kostny jest repozytorium komórek macierzystych; Nie jest jednak jasne, jaka może być linia tych komórek nabłonkowych. W niedawnym artykule omówiono komórki nabłonkowe pochodzące ze szpiku kostnego w grasicy, które najpierw wyrażają EpCAM i marker krwiotwórczy CD45, a następnie tracą ekspresję CD45 z czasem po urazie15. Badania przeprowadzone w naszym laboratorium potwierdziły również obecność komórek CD45+ EpCAM+ w zdrowej krwi i szpiku kostnym przy braku urazu12. Jednak rola tych komórek nie została jeszcze ustalona.
Istniała potrzeba opracowania powtarzalnej metody badania komórek nabłonkowych w zdrowym szpiku kostnym. Opisana metoda pomoże w dalszym charakteryzowaniu tych komórek w ich normalnym stanie. W tej metodzie istnieją ważne kroki mające na celu utrzymanie odtwarzalności. Jednym z najważniejszych kroków w tym protokole jest utrzymanie sterylnego środowiska w kapturze podczas pobierania szpiku kostnego od myszy. W przypadku zbierania od wielu myszy unika się zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami poprzez użycie nowych igieł i strzykawek dla każdej myszy. Gwarantuje to również, że próbka jest czysta i wolna od wszelkich zanieczyszczeń, które mogłyby mieć wpływ na wyniki. Ponadto należy zwiększyć liczbę przygotowywanych strzykawek i oznakowanych stożkowych probówek dla każdej dodatkowej myszy. Kolejnym ważnym krokiem jest płukanie kości, aż do uzyskania czystego białego koloru, aby upewnić się, że większość komórek szpiku kostnego została usunięta; Szanse na wykrycie rzadkich komórek wzrastają w czystszej próbce. Wprowadzono modyfikację w celu optymalizacji protokołu lizy krwinek czerwonych; Przetestowano kilka do lizy, aby znaleźć właściwy, który zapewniałby niezmiennie wysoką żywotność, ponieważ na tym etapie tracono prawie połowę komórek. Różne odczynniki i okresy inkubacji mogą wymagać optymalizacji w celu uzyskania lepszych wyników w innych ustawieniach.
Najważniejszym ograniczeniem tego protokołu jest wykorzystanie cytometrii przepływowej do znajdowania rzadkich populacji komórek. Jak wspomniano wcześniej, dodanie kontrolek i zliczeń przyrostowych pomaga zwiększyć swoistość i dokładność analizy. Kolejnym ograniczeniem jest to, że odpowiednie markery dla populacji będącej przedmiotem zainteresowania muszą być wcześniej zidentyfikowane. Dlatego należy wiedzieć o kluczowych markerach, przeciwciałach do cytometrii przepływowej i przeciwciałach kompatybilnych z gatunkami docelowymi.
Metody te stanowią ulepszenie w stosunku do istniejących metod, ponieważ pozwalają na analizę pojedynczych komórek za ułamek kosztów istniejącego automatycznego izolatora CTC i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Dodatkowo cytometria przepływowa jest łatwiej dostępna. FACS utrzymał wyższą żywotność komórek w porównaniu z wcześniejszymi raportami wynikami przy użyciu magnetycznej separacji mikrokulek. Wreszcie, techniki te pozwalają na oddzielenie komórek w celu dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie masowego RNA, sekwencjonowanie scRNA lub hodowla komórkowa.

Komórki nabłonkowe znajdują się w fizycznych barierach między naszymi ciałami a środowiskiem i są w stanie rozpoznawać i reagować na zmiany w swoim mikrośrodowisku1. Mają one rozwijającą się niszę komórek macierzystych, która umożliwia przekształcanie nowych tkanek i naprawę uszkodzeń2. Nasze laboratorium bada komórki macierzyste w mieszkach włosowych skóry; Skóra jest dobrym modelem do badania tkanki nabłonkowej i proliferacji komórek macierzystych, ponieważ jest dobrze widoczna i występuje w niej ciągła rotacja komórek. Rak nabłonka jest najczęstszą formą raka, prawdopodobnie ze względu na to, że tkanki nabłonkowe, takie jak skóra, są pierwszą linią obrony przed rakotwórczymi czynnikami środowiskowymi, co prowadzi do wysokich wskaźników rotacji i proliferacji komórek nabłonkowych3. Większość naskórka skóry, wierzchniej warstwy ochronnej, składa się z keratynocytów, które wyrażają różne rodzaje keratyny, aby zapewnić wsparcie i strukturę4. Pacjenci z nowotworami nabłonkowymi często mają komórki nabłonkowe obecne we krwi i szpiku kostnym, które również wyrażają keratynę. Płynne biopsje to nieinwazyjny sposób wykrywania i monitorowania tych komórek nabłonka w różnych płynach ustrojowych5. Krążące komórki nabłonkowe, zwane również krążącymi komórkami nowotworowymi (CTC), znajdują się we krwi obwodowej i mogą być biomarkerami rokowania w przypadku raka, a także kierować zindywidualizowanym leczeniem. CTC mogą również wskazywać na postęp choroby, skuteczność leczenia i całkowite przeżycie pacjenta5,6.
Cząsteczka adhezji komórek nabłonkowych (EpCAM) jest klinicznie stosowanym markerem CTC i może identyfikować nowotwory pochodzenia nabłonkowego u pacjentów z rakiem. EpCAM odgrywa rolę w adhezji, migracji, sygnalizacji, proliferacji i różnicowaniu komórek6. Aby krążąca komórka nabłonkowa mogła zostać sklasyfikowana jako CTC, musi być dodatnia dla cytokeratyn 8, 18 i 19 oraz ujemna dla CD45, powszechnego markera leukocytów<klasa sup="xref">6. CTC są zwykle identyfikowane przez pierwsze zubożenie CD45 za pomocą mikrokulek magnetycznych, a następnie przez testowanie na EpCAM i cytokeratynę 19 za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej7. Głównym ograniczeniem w wykrywaniu CTC jest ich rzadkość; Stanowią one mniej niż 0,01% wszystkich komórek we krwi, a bardzo niewiele z nich przeżywa w krążeniu, aby dotrzeć do odległych narządów8,9,10. Należy wziąć pod uwagę projektowanie eksperymentów i technik izolowania i identyfikowania tych komórek ze względu na ich rzadki charakter. Obecnie istnieje tylko jeden zatwierdzony przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) automatyczny sortownik jednokomórkowy używany do identyfikacji CTC, który wykorzystuje EpCAM jako biomarker. Inne metody obejmują separację kulek magnetycznych i cytometrię przepływową lub kombinację tych metod. Istnieje zapotrzebowanie na nowe techniki o wyższej czułości i swoistości do wykrywania rzadkich CTC11.
Cytometria przepływowa jest preferowaną metodą wykrywania rzadkich populacji komórek w próbkach krwi, szpiku kostnego i innych tkanek. Te rzadkie komórki mogą obejmować komórki macierzyste, krążące komórki śródbłonka, CTC i resztkowe komórki chorobowe. Cytometria przepływowa umożliwia pomiary ilościowe każdego typu komórek i sortuje je do dalszych badań7,9. Przeprowadzono zliczanie przyrostowe, aby zapewnić dokładną ocenę tych rzadkich komórek. Możliwość użycia bramkowania w celu wykluczenia komórek z dalszej analizy jest sposobem na zwiększenie swoistości podczas analizowania komórek. Ograniczeniami cytometrii przepływowej są czas potrzebny na analizę dużych próbek i brak wizualnego potwierdzenia tożsamości komórki. Aby temu zaradzić, przeprowadzono mikroskopię immunofluorescencyjną na posortowanych komórkach, aby potwierdzić ich tożsamość.
Poprzednio nasze laboratorium wykazało, że u myszy komórki szpiku kostnego są rekrutowane i przyczyniają się do powstawania nowotworów skóry12. Te komórki pochodzące ze szpiku kostnego są dodatnie dla pan-cytokeratyny i cytokeratyny naskórka. Aby dokładniej wyjaśnić rolę nabłonkowych komórek macierzystych, komórek pochodzących ze szpiku kostnego i komórek wyrażających cytokeratynę w progresji guza, poszukiwano komórek EpCAM+ cytokeratyny w normalnych próbkach krwi i szpiku kostnego myszy i ludzi. Podobnie jak w przypadku większości eksperymentów, ta metoda została opracowana w wielu iteracjach. Wcześniej transgeniczne myszy były używane wraz z przyrostowymi liczeniami w celu poszukiwania komórek eksprymujących K14GFP w szpiku kostnym12. W miarę zliczania kolejnych komórek, reprezentatywna populacja rzadkich komórek była w stanie zostać zidentyfikowana, jak pokazano na Rysunek 1 w sekcji reprezentatywnych wyników. Uzasadnienie dla badania komórek nabłonkowych w prawidłowej krwi i szpiku kostnym opierało się na wczesnej literaturze na temat CTC, gdzie normalni zdrowi dawcy mieli poziomy tła komórek EpCAM+13. Jak wspomniano wcześniej, charakterystyka EpCAM często rozpoczyna się od wyczerpania CD45. Ten krok został pominięty, ponieważ niektóre komórki krwiotwórcze mają ekspresję EpCAM i cytokeratyny z nieznanych powodów, które wymagają dalszych badań. W związku z tym komórki posortowano na podstawie obecności lub braku EpCAM, niezależnie od linii komórkowej, a następnie wybarwiono immunologicznie pod kątem cytokeratyny. Poniższy protokół i przepływ pracy pokazany na Rysunek 2 opisują technikę, która wykorzystuje cytometrię przepływową z kompensacją i kontrolą, metody statystyczne i obrazowanie immunofluorescencyjne do izolowania i identyfikacji tych rzadkich populacji komórek nabłonkowych.

<table><tbody><tr><td>40 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Służy do odfiltrowywania dużych kępek komórek ze szpiku kostnego</td></tr><tr><td>5 ml polistyrenu Probówka okrągłodenna</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td>Probówki używane do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Słoik 500 ml z pokrywką</td><td>Nalgene</td><td>11-823-32</td><td>Służy do mycia myszy</td></tr><tr><td>190 proof Etanol</td><td>Decon laboratories Inc</td><td>2801</td><td>Rozcieńczony do 70% z dH2O</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Kozia anty-królicza IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Rozcieńczenie: 1:1000</td></tr><tr><td>Hemacytometr Brightline</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-10</td><td>Służy do liczenia żywych komórek</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>Składnik rozcieńczalnika przeciwciał</td></tr><tr><td>Scharakteryzowany płodowy surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30071.03</td><td>Składnik bufora barwiącego i roztworu do zbioru</td></tr><tr><td>Curity gąbki z gazy</td><td>Covidien</td><td>2187</td><td>Służy do utrzymywania czystego miejsca pracy podczas zbierania kończyn i szpiku kostnego</td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Miltex</td><td>18-784</td><td>Używane podczas zbiorów</td></tr><tr><td>Cytokeratyna, badanie przesiewowe o szerokim spektrum Dako</td><td></td><td>Z0622</td><td>Rozcieńczenie 1:750 *Obecnie wycofane</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144 500mL</td><td>Służy do zatrzymania reakcji lizy krwinek czerwonych</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E9884-100G</td><td>Stosowany w 0,5 m&nbsp;</td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td>Składnik roztworu do zbioru</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS 1x)</td><td>Gibco</td><td>14175-095 500mL</td><td>Składnik roztworu do zbioru i roztworu buforowego do barwienia</td></tr><tr><td>Końcówka Luer-Lok Strzykawka 10 ml</td><td>Becton, Dickinson and Co</td><td>309604</td><td>Używany z igłą 26G do płukania kości, używany z igłą 20G do rozbijania grudek</td></tr><tr><td>Wiadro</td> <td>na lód Magic touch 2BelArt</td><td>M16807-2001</td><td>Służy do przechowywania próbek na lodzie</td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Apex</td><td>20-241</td><td>Składnik rozcieńczalnika przeciwciał</td></tr><tr><td>Normalna surowica końska</td><td>Wektor</td><td>ZE0122</td><td>Składnik przeciwciała Rozcieńczalnik</td></tr><tr><td>PE anty-ludzki CD 326 (EpCAM)</td><td>Biolegend</td><td>324206</td><td>Rozcieńczenie: 5 &mikro; l w 100 i mikro; l na komórki 1x106</td></tr><tr><td>PE anty-mysie CD 326 (EpCAM)</td><td>Biolegend</td><td>118205</td><td>Rozcieńczenie: 3 &mikro; l w 100 i mikro; l na komórki 1x106</td></tr><tr><td>mysz PE IgG2b, &kappa; kontrola izotypu</td><td>Biolegend</td><td>400313</td><td>Rozcieńczenie: 1 &mikro; l w 100 i mikro; l na komórki 1x106</td></tr><tr><td>PE szczur anty-ludzki CD49f</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>555763</td><td>Rozcieńczenie: 20 &mikro; l w 100 i mikro; l na 1x106 komórek</td></tr><tr><td>PE szczur IgG2am, &kappa; Kontrola izotypu</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td>Rozcieńczenie: 1 i mikro; l w 100 i mikro; l na komórki 1x106</td></tr><tr><td>Polipropylenowe stożkowe probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Basix</td><td>14-955-240</td><td>Stosowany w wirówce</td></tr><tr><td>Povidone-Jodine Scrub</td><td>Aplicare</td><td>82-227</td><td>Środek antyseptyczny stosowany do sterylizacji myszy</td></tr><tr><td>Igła PrecisionGlide 20G x 1 1/2</td><td>Igła Becton, Dickinson and Co</td><td>305176</td><td>20G służy do rozbijania grudek szpiku kostnego</td></tr><tr><td>Igła PrecisionGlide 26G x 1/2</td><td>Becton, Dickinson and Co</td><td>305111</td><td>igła 26G służąca do płukania szpiku kostnego z kości</td></tr><tr><td>Szkiełka drukowane PTFE</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>63422-06</td><td>8 dołków szkiełkuje komórki posortowane do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC 10X</td><td>Invitrogen</td><td>00-4300-54</td><td>Rozcieńczenie 1:10 przy użyciu sterylnej wody dejonizowanej</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-6762</td><td>Używany podczas zbiorów</td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne ze stali nierdzewnej #4</td><td>Bard-Parker</td><td>371222</td><td>Używane podczas zbiorów</td></tr><tr><td>Sterylna taca</td><td>Polar ware</td><td>10F</td><td>Używane podczas zbiorów</td></tr><tr><td>StretchEase Bezpudrowe rękawice nitrylowe</td><td>do badań Denville Scientific</td><td>G4161</td><td>Używane podczas zbiorów</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela chirurgicznego #4</td><td>Fischer</td><td>12-000-164</td><td>Używana z ostrzem chirurgicznym</td></tr><tr><td>TBS 20x</td><td>Składnik termiczny</td><td></td><td>TBST, stosowany przy 1X</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Służy do liczenia martwych komórek. Filtrowane za pomocą .45 i mikro; m</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500mL</td><td>Składnik</td></tr><tr><td>pęsety</td> TBST <td>Miltex</td><td>6-8</td><td>Używany podczas zbiorów</td></tr><tr><td>Vectashield Vibrance Antifade Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1800</td><td>Barwnik jądrowy do immunofluorescencji</td></tr></tbody></table>

dowody na ekspresję epcam i cytokeratyny w komórkach nabłonkowych w normalnej ludzkiej i mysiej krwi i szpiku kostnym

Evidence for EpCAM and Cytokeratin Expressing Epithelial Cells in Normal Human and Murine Blood and Bone Marrow

Komórki nabłonkowe zostały zidentyfikowane we krwi i szpiku kostnym pacjentów z rakiem i innymi chorobami. Jednak obecność normalnych komórek nabłonkowych we krwi i szpiku kostnym zdrowych osób nie została jeszcze zidentyfikowana w spójny sposób. Przedstawiono powtarzalną metodę izolowania komórek nabłonka od zdrowej ludzkiej i mysiej krwi i szpiku kostnego (BM) przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii immunofluorescencyjnej (IF). Komórki nabłonkowe u zdrowych osób zostały najpierw zidentyfikowane i wyizolowane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu cząsteczki adhezji komórek nabłonka (EpCAM). Potwierdzono, że te komórki EpCAM+ wyrażają keratynę za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w Krt1-14; Myszy transgeniczne mTmG. Próbki krwi ludzkiej zawierały od 0,18% ± 0,0004 komórek EpCAM+ (SEM; n=7 kontrprób biologicznych, 4 kontrpróby eksperymentalne). U ludzi BM 3,53% ± 0,006 (SEM; n = 3 kontrpróby biologiczne, 4 kontrpróby eksperymentalne) komórek jednojądrzastych stanowiło EpCAM+. We krwi myszy komórki EpCAM+ stanowiły 0,45% ± 0,0006 (SEM; n=2 kontrpróby biologiczne, 4 kontrpróby eksperymentalne), a we krwi myszy BM 5,17% ± 0,001 (SEM; n=3 kontrpróby biologiczne, 4 kontrpróby eksperymentalne) stanowiły EpCAM+. U myszy wszystkie komórki EpCAM+ były immunoreaktywne na pan-cytokeratynę, co określono za pomocą mikroskopii IF. Wyniki potwierdzono przy użyciu Krt1-14; Myszy transgeniczne mTmG, z niską (8,6 natywnych komórek GFP+ na 106 analizowanych komórek; 0,085% żywotnych komórek), ale znaczną liczbą (p < 0,0005) komórek GFP+ obecnych w normalnym mysim BM, które nie były wynikiem losowości w porównaniu z wieloma kontrolami negatywnymi. Co więcej, komórki EpCAM+ we krwi myszy były bardziej niejednorodne niż komórki CD45+ (0,58% w BM; 0,13% we krwi). Z obserwacji tych wynika, że komórki wykazujące ekspresję białek cytokeratyny są odtwarzalnie wykrywalne wśród komórek jednojądrzastych z ludzkiej i mysiej krwi oraz BM. Demonstrujemy metodę pobierania tkanek, cytometrii przepływowej i barwienia immunologicznego, które można wykorzystać do identyfikacji i określenia funkcji tych komórek nabłonka pan-cytokeratyny u zdrowych osób.

Zastosowanie tych metod pozwoliło na wizualizację rzadkich populacji komórek nabłonkowych we krwi i szpiku kostnym zdrowych ludzi oraz myszy. Przy zastosowaniu odpowiedniej kompensacji i kontroli, zgodnie z opisem, wyniki konsekwentnie wykazały, że 4%–5% komórek w mysim szpiku kostnym było EpCAM+, niezależnie od liczby zliczonych komórek, co przedstawiono w Rycina 4 i Rysunek 5W próbkach krwi mysiej mniej niż 0,5% komórek było EpCAM+, co pokazano w Rycina 6W próbkach ludzkiego szpiku kostnego 2%–5% komórek było EpCAM+, co pokazano w Rycina 7 i Rycina 8Choć zakres 2%–5% jest szeroki, wartości procentowe dla każdego pojedynczego dawcy były spójne wraz z przyrostem liczby przeliczonych komórek. W ludzkich próbkach krwi około 0,3% komórek było EpCAM+, co pokazano w Rysunek 9Nasze próbki kontrolne (brak barwienia, kontrola izotypowa oraz FMO) wykazały bardzo mało wyników fałszywie dodatnich dla EpCAM+, co pokazano w Rycina 4 i Rysunek 7Komórki z grup EpCAM+ i EpCAM-, które zostały posortowane na szkiełka, wykazały pozytywne barwienie na pan-cytokeratynę w próbkach EpCAM+ oraz ujemne barwienie na pan-cytokeratynę w próbkach EpCAM-, co przedstawiono w Rysunek 10Wyniki te wskazują, że eksperymenty zostały odpowiednio zaprojektowane i są powtarzalne.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający liczbę komórek GFP-dodatnich w zależności od liczby posortowanych komórek; kontrola K14Cre vs. hybryda K14Cre/mTmG." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Myszy transgeniczne Krt14Cre;mTmG z przyrostową liczbą komórek szpiku kostnego. Liczbę komórek szpiku kostnego myszy Krt1-14;mTmG liczono przyrostowo. Komórki GFP-dodatnie wskazują na ekspresję keratyny 14 i zostały zidentyfikowane za pomocą cytometrii przepływowej. Wraz ze wzrostem liczby liczonych komórek szpiku kostnego, populacja komórek dodatnich pod kątem keratyny 14 była łatwiejsza do zidentyfikowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat sortowania FACS komórek krwi i szpiku kostnego, cytospin EpCAM+/-, immunofluorescencja cytokeratyny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat postępowania dla komórek EpCAM+ i cytokeratyna+. Komórki szpiku kostnego i krwi zostały najpierw posortowane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) w celu oddzielenia komórek EpCAM+ od EpCAM-. Komórki te zostały posortowane do dwóch różnych probówek, a także na dwa różne szkiełka. Komórki posortowane do probówek zostały przeniesione na szkiełka za pomocą cytocentryfugi. Szkiełka zabarwiono następnie za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko pan-cytokeratynie, a następnie przeciwciałem wtórnym. Szkiełka przeanalizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu obserwacji ekspresji pan-cytokeratyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej, wykresy rozrzutu, bramkowanie populacji komórek, porównanie intensywności fluorescencji, filtrowanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej. Podczas analizy danych z cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania analitycznego, kontrola bez barwienia jest wykorzystywana do wyboru komórek zainteresowania. Komórki są najpierw selekcjonowane na podstawie SSC-A i FSC-A, które obrazują złożoność wewnętrzną oraz rozmiar komórek. (A) Wokół komórek rysowana jest bramka wielokątna. (B) Pojedyncze komórki są wyodrębniane poprzez bramkowanie SSC-A względem SSC-W. (C) Żywe komórki są wyodrębniane poprzez bramkowanie FSC-A względem DAPI. (D) Komórki negatywne pod kątem EpCAM są wykluczane poprzez bramkowanie po prawej stronie komórek negatywnych dla EpCAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna, ekspresja EpCAM, wykresy kropkowe, porównania braku barwienia i kontroli, kwantyfikacja komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza cytometryczna komórek EpCAM+ w szpiku kostnym myszy. W górnym panelu przedstawiono kontrole bez barwienia, izotypowe oraz FMO, a w dolnym panelu przyrostowe liczby 50 000, 100 000 i 500 000 komórek. Wykresy te obrazują spójność procentową niezależnie od liczby komórek, pomimo ogólnego wzrostu całkowitej liczby policzonych komórek. Panele po prawej stronie wskazują strategię bramkowania, omówioną wcześniej w sekcji analizy cytometrycznej i przedstawioną na Rycini 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy komórek szpiku kostnego z ekspresją EPCAM w różnych metodach barwienia dla szpiku kostnego myszy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Komórki EpCAM+ w szpiku kostnym myszy stanowią 5,17% ± 0,001% populacji. Przeanalizowano komórki szpiku kostnego trzech poszczególnych myszy. W celu zapewnienia rygoru naukowego zastosowano odpowiednie kontrole. Procent komórek dodatnich pozostał spójny we wszystkich próbkach ze względu na to, że myszy były genetycznie identyczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej; wykres słupkowy przedstawiający komórki EpCAM+ w stosunku do całkowitej liczby policzonych komórek krwi mysiej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Komórki EpCAM+ we krwi mysiej stanowią 0,45% ± 0,0006% populacji. Analizie poddano komórki krwi dwóch osobniczych myszy. Uwzględniono kontrole, aby wykazać, że zastosowano właściwą procedurę w celu uzyskania wiarygodnych wyników. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej, barwienie PE-EpCAM, porównanie kontroli i różnych liczb komórek, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Analiza cytometryczna przepływowa szpiku kostnego człowieka EpCAM+. W górnym panelu przedstawiono kontrole bez barwienia, izotypowe oraz FMO, a w dolnym panelu przyrostowe liczby komórek wynoszące 50 000, 100 000 i 500 000. Wykresy te obrazują spójność procentową niezależnie od liczby komórek, pomimo ogólnego wzrostu całkowitej liczby zliczonych komórek. Panele po prawej stronie wskazują strategię bramkowania, omówioną wcześniej w sekcji analizy cytometrii przepływowej i przedstawioną na Rysunku 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy cytometrii przepływowej; liczba komórek EpCAM+ w ludzkim szpiku kostnym z różnymi barwieniami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Komórki EpCAM+ w ludzkim szpiku kostnym stanowią 3,53% ± 0,006% populacji. Przeanalizowano trzy różne próbki ludzkiego szpiku kostnego. W celu zapewnienia rygoru naukowego zastosowano odpowiednie kontrole. Procent komórek dodatnich różni się ze względu na heterogeniczność genetyczną ludzi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy liczby komórek EPCAM-dodatnich w ludzkiej krwi przy zastosowaniu różnych barwień, dla trzech próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Komórki EpCAM+ w ludzkiej krwi stanowią 0,18% ± 0,0004% populacji. Przeanalizowano trzy różne próbki ludzkiej krwi. W celu zapewnienia rygoru naukowego zastosowano odpowiednie kontrole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna: barwienie DAPI i pan-cytokeratyną, identyfikacja i porównanie komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Immunofluorescencja preparatów EpCAM+ i EpCAM-. Do rozdzielenia komórek EpCAM+ i EpCAM- wykorzystano metodę FACS. Barwienie pan-cytokeratyny przeprowadzono przy użyciu przeciwciała pan-cytokeratynowego firmy DAKO. Nie stosowano kontroli bez przeciwciała pierwszorzędowego w normalnym serum, ponieważ pan-cytokeratyna jest przeciwciałem poliklonalnym. Wyniki te potwierdzają dokładność metody FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Ludzki szpik kostny lub krew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało</td>
			<td>Probówka nr</td>
			<td>Liczba komórek</td>
			<td>stężenie przeciwciał</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nebarwione</td>
			<td>1</td>
			<td>1x106</td>
			<td>X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wyłącznie DAPI</td>
			<td>2</td>
			<td>1x106</td>
			<td>1 µL/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kontrola izotypowa PE</td>
			<td>3</td>
			<td>1x106</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrola pojedynczego barwienia CD49f-PE</td>
			<td>4</td>
			<td>1x106</td>
			<td>20 µl w 100 µl na 1x106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niskie miareczkowanie EpCAM-PE</td>
			<td>5</td>
			<td>1x106</td>
			<td>3 µL w 100 µL na 1x106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tytracja medium EpCAM-PE</td>
			<td>6</td>
			<td>1x106</td>
			<td>4 µL w 100 µL na 1x106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wysokie miareczkowanie EpCAM-PE</td>
			<td>7</td>
			<td>1x106</td>
			<td>5 µL w 100 µL na 1x106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sortowanie komórek z wysoką ekspresją EpCAM-PE na szkiełkach</td>
			<td>8</td>
			<td>10x106</td>
			<td>50 µL w 1 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Panel barwień do cytometrii przepływowej. Przykład panelu barwień do cytometrii przepływowej dla mononuklearnych komórek krwi lub szpiku kostnego. W ramach kontroli uwzględniono: sam DAPI, kontrolę niebarwioną oraz kontrolę barwienia pojedynczym fluorochromem PE (jako lepszą kontrolę pozytywną zastosowano PE-CD49f). Kontrola FMO (fluorescence minus one) nie została uwzględniona w tym panelu, ponieważ zastosowano tylko jeden kolor (PE). Przy dodawaniu kolejnych kolorów fluorochromów, takich jak izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) lub alloficocyjanina (APC), należy uwzględnić kontrole FMO, pomijając jeden fluorochrom dla każdej kontroli FMO.
Plik uzupełniający 1: Liczenie żywych komórek przy użyciu hematocytometru. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/Suppli-1_65118.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł przedstawia powtarzalną metodę z nowymi odkryciami na temat obecności komórek nabłonkowych w normalnej ludzkiej i mysiej krwi i szpiku kostnym przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii immunofluorescencyjnej. Krt1-14; Transgeniczne myszy mTmG zastosowano jako metodę in vivo w celu potwierdzenia tych wyników.

Dowody na ekspresję EpCAM i cytokeratyny w komórkach nabłonkowych w normalnej ludzkiej i mysiej krwi i szpiku kostnym

Epithelial cells have been identified in the blood and bone marrow of patients with cancer and other diseases. However, the presence of normal epithelial ...

Technika ta demonstruje powtarzalną metodę izolowania komórek nabłonka znajdujących się we krwi i szpiku kostnym zdrowych osób w celu wykorzystania ich do dalszej analizy. Technika ta pozwala na izolację komórek nabłonkowych za ułamek kosztów automatycznej izolacji krążących komórek nowotworowych ze względu na dostępność cytometrii przepływowej. Metoda ta może mieć implikacje w biologii rozwojowej i biologii komórek macierzystych oraz terapiach regeneracyjnych.Może być również stosowany do badania gojenia się ran i utrzymania tkanek w tkankach nabłonkowych. Kości są bardzo małe i kruche, więc należy obchodzić się z nimi ostrożnie, aby zapobiec złamaniu lub utracie kości. Szpik kostny jest stosunkowo stabilny, więc możesz pracować powoli i ostrożnie, aby zapewnić prawidłowe zbiory.Na początek umieść mysz w pojemniku o pojemności 500 mililitrów i dodaj tyle jodu, aby pokryć połowę myszy. Delikatnie potrząśnij i zakręć pojemnikiem, aby zapewnić dokładne pokrycie. Następnie spłucz wodą dejonizowaną.Wykonaj jeszcze jedno płukanie jodem, a następnie dwa prania 70% etanolem. Umieść mysz w kapturze i połóż ją na plecach na tacy. Chwyć tylne nogi i rozsuń je, aż poczujesz trzask.Wykonaj jednocentymetrowe nacięcie na skórze myszy w pobliżu pachwiny. Włóż zamknięte nożyczki do nacięcia i otwórz nożyczki pod skórą, aby oddzielić je od otrzewnej. Przetnij skórę na nodze wokół uda, a następnie przetnij skórę w dół nogi, aby odsłonić mięśnie i kości.Przed przecięciem tylnej nogi należy dotknąć kości biodrowej, aby dokładnie poprowadzić nożyczki i zapobiec skaleczeniom kości udowej, gdzie znajduje się większość szpiku kostnego. Następnie usuń tylne nogi, przecinając wokół stawu biodrowego bez przecinania kości udowej. Umieść kończyny w tubie oznaczonej jako kończyny.Następnie usuń mięśnie, tkankę i tłuszcz wzdłuż jednej z kończyn, przecinając nożyczkami równolegle do kości. Następnie użyj skalpela, aby ostrożnie usunąć pozostały tłuszcz lub mięśnie, wykonując ruch skrobania prostopadle do kości. Po dokładnym oczyszczeniu kości oddziel kość udową i piszczelową w kolanie.Następnie za pomocą skalpela wykonaj nacięcia na obu końcach kości udowej i piszczelowej, gdzie nie ma widocznego szpiku kostnego. Wprowadzić wcześniej przygotowaną strzykawkę i igłę do kości. Jeśli występuje opór, przytnij koniec kości, aż nie będzie już oporu.Przytrzymaj kość mocno nad rurką oznaczoną jako szpik kostny i wstrzyknij roztwór do pobierania szpiku kostnego do kości. Następnie wypłucz szpik kostny do probówki. Powtórz tę czynność dla drugiego końca kości, aby zebrać resztę szpiku kostnego, aż kość stanie się całkowicie biała lub pusta.Używając pustej strzykawki o pojemności 10 mililitrów i igły 20G, rozbij grudki szpiku kostnego w probówce, przeciągając szpik kostny w górę iw dół w strzykawce od pięciu do 10 razy. Dodaj filtr 40 mikronów do czystej 50-mililitrowej probówki wirówkowej i przepłucz ją jednym mililitrem roztworu do pobierania szpiku kostnego. Przefiltruj szpik kostny przez filtr, aby usunąć wszelkie pozostałe grudki.Następnie oznacz rurkę przefiltrowanym szpikiem kostnym. Przefiltrowany szpik kostny należy przechowywać w lodówce lub na lodzie do czasu użycia tego samego dnia. Odwirować komórki szpiku kostnego w temperaturze 170 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Odkurzyć i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach jednego x buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować przez cztery minuty. Następnie dodaj 30 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco, aby zatrzymać reakcję buforu do lizy.Odwirowywać komórki przez osiem minut w temperaturze 170 G w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 10 do 20 mililitrach buforu barwiącyego. Najpierw podziel komórki na indywidualnie oznakowane probówki w oparciu o zastosowany panel barwiący, w tym kontrole kompensacyjne.Przygotuj niebarwione kontrole i kontrole izotopowe, aby zablokować niespecyficzne barwienie. Dla każdej fluory czwórki dodaj pojedynczą kontrolę barwienia, a także dodaj fluorescencję minus jeden kontrolę w połączeniu z pozostałymi czwórkami fluory. Następnie dodać przeciwciała zgodnie z zalecanym rozcieńczeniem i dobrze wymieszać, przesuwając spód probówek.Najlepiej stosować EpCAM sprzężony z fikoerytryną, aby uwidocznić niskie populacje komórek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Po inkubacji przynieś probówki do dwóch okapów BSL i dodaj jeden mililitr buforu barwiącego do każdej probówki.Następnie odwiruj probówki w temperaturze 170 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Po odwirowaniu doprowadzić zakryte probówki do okapu BSL two i odessać supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze buforu barwiącego i przesunąć dno probówek, aby wymieszać.Powtórz mycie i odwirowanie jeszcze dwa razy. Na koniec ponownie zawiesić podniebienie w 500 mikrolitrach buforu barwiącego przed cytometrią przepływową. Dodaj DAPI lub dyskryminator martwych komórek zgodnie z zaleceniami producenta.Korzystając z tego protokołu, uwidoczniono rzadkie populacje komórek nabłonkowych w szpiku kostnym myszy. Cztery do 5% komórek w mysim szpiku kostnym było EpCAM dodatnie, niezależnie od liczby zliczonych komórek. W próbkach ludzkiego szpiku kostnego od dwóch do 5% komórek było dodatnich pod względem EpCAM.Również odsetek komórek w każdym indywidualnym dawcy był spójny, ponieważ stopniowo zliczano więcej komórek. W próbkach krwi myszy mniej niż 0,5% komórek było dodatnich pod względem EpCAM. Natomiast w próbkach krwi ludzkiej liczba ta wynosiła około 0,3% komórek.Próbki kontrolne wykazały bardzo mało fałszywie dodatnich komórek EpCAM. Co więcej, komórki posortowane w grupie dodatniej EpCAM wykazały barwienie na obecność cytokeratyny pan. Podczas gdy osoby z grupy ujemnej EpCAM nie wykazały sygnału cytokeratyny.Najważniejsze jest utrzymanie czystego i sterylnego środowiska. Zapobiegnie to jakiemukolwiek zanieczyszczeniu próbki. Istnieje kilka dalszych zastosowań, które można zastosować do izolowanych komórek nabłonkowych w celu określenia ich funkcji.Należą do nich sekwencjonowanie RNA, eksperymenty in vivo z hodowlą komórkową i mikroskopia immunofluorescencyjna.

evidence-for-epcam-cytokeratin-expressing-epithelial-cells-normal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda cytometrii przepływowej do identyfikacji i analizy molekularnej mysich progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stadium różnicowania, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodowej myszy. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych CD71, Ter119 oraz wielkości komórek.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Opisano trójwymiarowy (3D) system hodowli dla hematopoezy z wykorzystaniem ludzkiej krwi pępowinowej oraz komórek szpiku kostnego z białaczką. Metoda opiera się na zastosowaniu porowatego syntetycznego rusztowania z poliuretanu pokrytego białkami macierzy pozakomórkowej. Rusztowanie to można dostosować do hodowli szerokiego zakresu komórek.

Ex vivo naśladowanie prawidłowej i nieprawidłowej hematopoezy u ludzi

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są prognostyczne w kilku nowotworach przerzutowych. Ten manuskrypt opisuje złoty standard systemu CellSearch (CSS) platformy wyliczania CTC i zwraca uwagę na typowe błędy błędnej klasyfikacji. Ponadto opisano dwa dostosowane protokoły do definiowanej przez użytkownika charakterystyki markerów CTC i liczenia CTC w przedklinicznych mysich modelach przerzutów przy użyciu tej technologii.

Adaptacja półautomatycznych testów na krążące komórki nowotworowe (CTC) do zastosowań klinicznych i przedklinicznych

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Hodowla CTC pozwala na głębszą funkcjonalną charakterystykę raka, poprzez badanie specyficznej ekspresji markerów oraz ocenę oporności na leki i zdolności do kolonizacji wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla CTC może być obiecującym narzędziem klinicznym dla medycyny spersonalizowanej w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.

Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Opisujemy protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki nabłonka grasicy myszy oraz barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrycznej przepływowej.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

Poznaj metodę izolacji komórek nabłonkowych z krwi i szpiku kostnego myszy oraz ludzi przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badania w biologii komórkowej i regeneracyjnej.

Dowody na ekspresję EpCAM i cytokeratyny w komórkach nabłonkowych w normalnej ludzkiej i mysiej krwi i szpiku kostnym

Przeglądaj więcej filmów