Name: Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj izolację komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i metody narażania ich na kontrolowane naprężenia ścinające oraz rozciąganie cykliczne. Protokół umożliwia badanie odpowiedzi mechanicznej w biologii naczyniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JEK jest wspierany przez granty z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 i 2013/17368-0] oraz Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 i 309179/2013-0). AAM jest wspierany przez granty z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) i Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

<ol><li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery%3A+the+intimal+hyperplastic+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li>
<li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+responses+to+mechanical+stress%3A+where+is+the+mechanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li>
<li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li>
<li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-%CE%BAB+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133(2020).</li>
<li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li>
<li>Girão-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493(2021).</li>
<li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li>
<li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery%3A+an+exploratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+Vessels%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+II.+Representative+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li>
<li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413(2020).</li>
<li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt%2FeNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li>
<li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li>
<li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes%2C+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+%28KLF2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li>
<li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li>
<li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype%3A+implications+for+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Odcinek żyły odpiszczelowej powinien mieć co najmniej 2 cm, aby skutecznie wyizolować hSVEC. Małe segmenty są trudne w obsłudze i wiążą końce naczynia, aby utrzymać roztwór kolagenazy w celu wyizolowania komórek. Zmniejszona powierzchnia świetlna nie daje wystarczającej liczby komórek do ekspansji kultury. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia substancjami innymi niż EC, manipulacja odcinkiem żyły odpiszczelowej musi być bardzo delikatna podczas całego zabiegu. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas wprowadzani...

Dysfunkcja komórek śródbłonka (EC) jest kluczowym czynnikiem powodującym niepowodzenie przeszczepu żyły odpiszczelowej1,2,3,4. Utrzymujący się wzrost naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania indukuje prozapalny fenotyp ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs)3,4,5,6. Leżące u ich podstaw szlaki molekularne nadal nie są w pełni poznane, a ustandaryzowane protokoły badań in vitro mogą wykorzystać wysiłki na rzecz uzyskania nowych spostrzeżeń w tej dziedzinie. W tym miejscu opisujemy prosty protokół izolacji, charakteryzowania i rozszerzania hSVEC oraz sposób wystawiania ich na zmienne poziomy naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania, naśladując warunki hemodynamiczne żylne i tętnicze.
hSVEC są izolowane przez inkubację kolagenazy i mogą być używane do przejścia 8. Protokół ten wymaga mniej manipulacji naczyniem w porównaniu z innymi dostępnymi protokołami7, co zmniejsza zanieczyszczenie komórkami mięśni gładkich i fibroblastami. Z drugiej strony wymaga większego segmentu naczynia o długości co najmniej 2 cm, aby uzyskać skuteczną ekstrakcję EC. W literaturze przedmiotu podano, że EC z dużych zbiorników można również uzyskać poprzez mechaniczne usuwanie7,8. Chociaż podejście fizyczne jest skuteczne, ma wady w postaci niskiej wydajności EC i wyższego zanieczyszczenia fibroblastami. Aby zwiększyć czystość, potrzebne są dodatkowe kroki przy użyciu kulek magnetycznych lub sortowania komórek, co zwiększa koszt protokołu ze względu na pozyskiwanie kulek i przeciwciał7,8. Metoda enzymatyczna daje szybsze i lepsze wyniki w zakresie czystości i żywotności EC7,8.
Najczęściej używanymi EC do badania dysfunkcji śródbłonka są ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Wiadomo, że fenotyp EC zmienia się w różnych łożyskach naczyniowych i konieczne jest opracowanie metod reprezentujących badane naczynie9,10. W związku z tym ustanowienie protokołu izolowania hSVEC i hodowli go pod wpływem stresu mechanicznego jest cennym narzędziem do zrozumienia wpływu dysfunkcji hSVEC na chorobę przeszczepów żył.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-0,02% roztwór EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>15 &micro; slide I 0,4 Luer&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa równoosiowa stacja załadowcza 25 mm&nbsp;</td><td>Flexcell Międzynarodowa korporacja</td><td>LS-3000B25. Szkiełko 8-dołkowe VJW</td><td></td></tr><tr><td>z wyjmowaną studzienką</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy (Lodowaty)</td><td>Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz akrylowy o grubości 1 cm</td><td>Przeciwciało z pleksi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab24590</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD31, FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD3101</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-VE-kadheryny</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Bioflex kolagen I</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>BF3001C</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Szew bawełniany EP 3,5 15 x 45 cm</td><td>Brasuture</td><td>AP524</td><td></td></tr><tr><td>Cyklofilinowy podkład do przodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom zaprojektowany</td><td></td></tr><tr><td>Cyklofilinowy odwrócony podkład</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 podłoże podstawowe</td><td>Lonza</td><td>CC3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots suplementy</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2657-029</td><td></td></tr><tr><td>System napinania Flexcell FX-5000</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX-5000T</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount wodne medium montażowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa z błony śluzowej jelit świń 5000 IU / ml</td><td>Blau Farmac&ecirc; utica</td><td>SKU 68027</td><td></td></tr><tr><td>System pompy Ibidi (pompa + jednostka płynowa)</td><td>Podkład do przodu Ibidi</td><td>10902</td><td></td></tr><tr><td>KLF2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td></td></tr><tr><td>podkład odwrotny KLF2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td></td></tr><tr><td>podkład do przodu KLF4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td></td></tr> podkład <tr><td>wsteczny KLF4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td></td></tr><tr><td>analizator tlenku azotu NOA 280</td><td>Sievers Instruments</td><td>NOA-280i-1</td><td></td></tr><tr><td>NOS3 starter do przodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td></td></tr><tr><td>odwrócony starter NOS3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw perfuzyjny 15 cm, ID 1,6 mm, czerwony, zbiorniki 10 ml</td><td>Ibidi</td><td>10962</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Jodek</td> <td>potasuZestaw do zielonego PCR Sigma-Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>QuanTitec SYBR</td> Platforma elastyczna <td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12K&nbsp;</td><td>Zestaw Applied Biosystems</td><td>4471087</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro&nbsp;</td><td>Quiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Szkło ślizgowe (24 mm x 60 mm)</td><td>Knittel Glass</td><td>VD12460Y1D.01</td><td></td></tr><tr><td>Azotyn sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31443</td><td></td></tr><tr><td>System syntezy pierwszej nici SuperScript IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091200</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieska bejca 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Operacja pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG) to zabieg rewaskularyzacji niedokrwiennego mięśnia sercowego. Żyła odpiszczelowa pozostaje używana jako przewód CABG pomimo zmniejszonej długotrwałej drożności w porównaniu z przewodami tętniczymi. Nagły wzrost stresu hemodynamicznego związany z tętnicą przeszczepu powoduje uszkodzenie naczyń krwionośnych, zwłaszcza śródbłonka, co może wpływać na niską drożność przeszczepu żyły odpiszczelowej (SVG). Tutaj opisujemy izolację, charakterystykę i ekspansję ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVEC). Komórki wyizolowane przez trawienie kolagenazą wykazują typową morfologię bruku i wyrażają markery komórek śródbłonka CD31 i VE-kadherynę. Aby ocenić wpływ naprężeń mechanicznych, w tym badaniu zastosowano protokoły w celu zbadania dwóch głównych bodźców fizycznych, naprężenia ścinającego i rozciągania, na arteryalizowanych SVG. hSVEC są hodowane w równoległej komorze przepływowej w celu wytworzenia naprężenia ścinającego, wykazując wyrównanie w kierunku przepływu i zwiększoną ekspresję KLF2, KLF4 i NOS3. hSVEC mogą być również hodowane w membranie krzemowej, która umożliwia kontrolowane rozciąganie komórkowe, naśladując rozciąganie żylne (niskie) i tętnicze (wysokie). Wzorzec F-aktyny komórek śródbłonka i wydzielanie tlenku azotu (NO) są odpowiednio modulowane przez rozciąganie tętnicy. Podsumowując, przedstawiamy szczegółową metodę izolacji hSVEC w celu zbadania wpływu hemodynamicznego obciążenia mechanicznego na fenotyp śródbłonka.

Zazwyczaj przylegające EC można zaobserwować 3-4 dni po ekstrakcji. hSVECs początkowo tworzą skupiska komórek i wykazują typową morfologię „bruku” (Rysunek 1B). Ekspresują one markery EC: CD31 (Rysunek 1C,D) oraz VE-kadherynę (Rysunek 1D). hSVECs można łatwo propagować na niepowlekanej, modyfikowanej płytce do hodowli komórkowej; komórki te zachowują fenotyp śródbłonka w hodowli do ośmiu pasaży.
<p class="jove_c...

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Żyła odpiszczelowa jest nagle narażona na stany tętnicze po operacji pomostowania aortalno-wieńcowego. Zrozumienie jego reakcji adaptacyjnej na stres mechaniczny może pomóc w projektowaniu narzędzi terapeutycznych zapobiegających niewydolności przeszczepu żyły. Ten protokół izolacji komórek śródbłonka jest bardzo prosty i wymaga jedynie inkubacji z kolagenazą.Przy minimalnej manipulacji naczyniami powoduje to zmniejszenie zanieczyszczenia komórkami mięśni gładkich i fibroblastami. Protokół izolowania ludzkich SVEC i hodowli ich pod wpływem naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania jest niezbędny do zrozumienia udziału sił mechanicznych w dysfunkcji komórek śródbłonka związanej z niewydolnością przeszczepu żyły odpiszczelowej. Wcześniejsza hodowla komórek śródbłonka jest bardzo wymagająca pod względem suplementów pożywki komórkowej.Konieczne jest dodanie czynników wzrostu, aby skutecznie wyizolować kulturę, ludzkie SVEC. W celu wyizolowania pierwotnych komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka lub ludzkich SVEC należy pobrać co najmniej dwu- lub trzycentymetrowy odcinek żyły odpiszczelowej. Pracując pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym, przenieś segment żyły na szalkę Petriego wypełnioną wstępnie podgrzanym PBS.Aby usunąć całą krew z wnętrza światła, włóż końcówkę pipety przymocowaną do pipety i wypełnioną PBS do jednego końca żyły i delikatnie ją przepłucz. Płucz go, aż przepływ prania stanie się całkowicie czysty. Następnie zamknij jeden koniec żyły sterylnym bawełnianym szwem.Ostrożnie napełnij naczynie jednym miligramem na mililitr roztworu kolagenazy typu 2 i zamknij drugi koniec naczynia bawełnianym szwem. Inkubować naczynie z roztworem kolagenazy w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie przeciąć jeden koniec naczynia nad 15-mililitrową rurką, aby zebrać roztwór kolagenazy przed przecięciem drugiego końca.Przepłucz powierzchnię światła jednym do dwóch mililitrów PBS, aby zebrać wszystkie oderwane komórki śródbłonka wewnątrz rurki za pomocą kolagenazy. Odwirować probówkę o sile 400 g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech do czterech mililitrach kompletnego podłoża komórkowego śródbłonka zawierającego dodatkowy roztwór heparyny.Umieść komórki w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych wstępnie pokrytym żelatyną o wadze 3% na objętość. Inkubować komórki w wilgotnej atmosferze przez cztery dni bez zmiany pożywki. Następnie zmieniaj podłoże co drugi dzień bez dodawania suplementacji heparyną.Zbadaj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że czerwone krwinki zostały usunięte. Po jednym do czterech dni po ekstrakcji, w zależności od wielkości i średnicy odcinka żyły, uwidocznij ludzkie SVEC za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, aby ocenić stopień zbieżności i morfologię kostki brukowej. Kontynuuj zmianę pożywki co dwa dni, aż komórki osiągną zbieżność od 70% do 80%.Pokryć szkiełko komory przepływowej żelatyną o zawartości 0,1% masy na objętość i inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zrównoważyć jednostkę płynową i sterylny zestaw perfuzyjny posiadający 10-milimetrowe zbiorniki, należy je inkubować przez noc w wilgotnej atmosferze. W eksperymencie naprężenia ścinającego wysiewaj 200 000 komórek śródbłonka zawieszonych w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej do szkiełka komory przepływowej pokrytej żelatyną.W celu przymocowania komórek do powierzchni hodowli, inkubuj komórki przez cztery godziny. Umieść zestaw do perfuzji na jednostce fluidycznej. Napełnij zbiorniki i zestaw perfuzyjny około 12 mililitrami wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża komórkowego śródbłonka.Usuń pęcherzyki powietrza z zestawu perfuzyjnego, aby zrównoważyć poziom obu zbiorników na pięciu mililitrach. Umieścić zespół fluidyczny na zamontowanym zestawie perfuzyjnym bez suwaka komory w inkubatorze i podłączyć jego elektryczny do pompy regulowanej komputerowo. Uruchamiając wstępnie zdefiniowany protokół w oprogramowaniu sterującym pompą, usuń wszystkie pęcherzyki powietrza ze zbiorników i zestawu perfuzyjnego.Weź jednostkę fluidyczną z zamontowanym zestawem perfuzyjnym do okapu z przepływem laminarnym i przymocuj szkiełka z monowarstwą ogniw konfluencji. Po umieszczeniu całego urządzenia wraz ze szkiełkami w inkubatorze należy podłączyć jego przewód elektryczny do pompy. W oprogramowaniu sterującym pompą dostosuj konfigurację jednostki płynowej, wybierając typ suwaka i ustawiając lepkość medium.W parametrach przepływu wprowadź wartość naprężenia ścinającego i ustaw czas trwania cyklu oraz typ przepływu. Następnie kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć eksperyment. Należy pamiętać, aby utrzymywać szkiełko z komórkami potraktowanymi tymi samymi pożywkami bez ekspozycji na przepływ, jak w kontrolach statycznych.Nałóż smar na bazie silikonu na górną i boczną część 25-milimetrowej, 6-dołkowej, równoosiowej stacji ładowania. Wysiewaj 400 000 komórek zawieszonych w trzech mililitrach do każdego dołka z 6-dołkowych płytek hodowlanych z elastycznym dnem pokrytych kolagenem. Inkubuj komórki w nawilżonym powietrzu, aż osiągną 100% zbieżności.Przed rozpoczęciem protokołu rozciągania należy raz umyć komórki wstępnie podgrzanym PBS i dodać trzy mililitry świeżej pożywki hodowlanej na dołek. Włóż płytę podstawy ze wszystkimi nasmarowanymi stacjami ładowania do inkubatora i odpowiednio połącz rurkę z wyposażeniem sterującym systemu bioreaktora rozciągającego ogniwa napinające. Przymocuj każdą płytkę hodowlaną do jednej czerwonej uszczelki dostarczonej przez system bioreaktora.Następnie umieść je na płycie podstawy w inkubatorze. Umieść wszystkie cztery płytki hodowlane w płycie podstawy, aby uzyskać odpowiednie podciśnienie i obciążenie rozciągające. Włącz sprzęt kontrolera i system komputerowy.Otwórz oprogramowanie sterujące FlexCell i skonfiguruj żądany schemat, w tym procent wydłużenia, kształt fali, częstotliwość i czas. Zapisz schemat. Włącz system próżniowy, a następnie wybierz schemat i kliknij start na ekranie komputera, aby uruchomić rozciąganie.Sprawdź, czy membrana silikonowa porusza się i rozciąga komórki. Przylegające komórki śródbłonka można było zaobserwować od 4 do 10 dni po ekstrakcji. Początkowo tworzą skupiska komórek o typowej morfologii bruku.Wykazywały one ekspresję markerów EC CD31 i VE-kadheryny. hSVEC podczas hodowli pod wpływem naprężeń ścinających ustawiają się w kierunku przepływu. Naprężenie ścinające wynoszące 20 dyn na centymetr kwadratowy przez 72 godziny indukuje ekspresję typowych genów mechanowrażliwych, KLF2, KLF4 i NOS3, co wskazuje na skuteczność bodźca ścinającego.Wynik cyklicznego rozciągania zależał od intensywności zastosowanej do ludzkich SVEC. Komórki pod niskim rozciągnięciem wykazywały korowy wzór F-aktyny podobny do komórek statycznych. Bez zmian w uwalnianiu tlenku azotu przez okres do 72 godzin, nasze poziomy rozciągliwości tętniczej przemodelowały cytoszkielet aktynowy po 24 godzinach i zmniejszyły uwalnianie NO po 72 godzinach.Oprócz badań nad naprężeniami mechanicznymi, naukowcy mogą wykorzystać wyizolowane komórki do wykonywania różnych metod w celu poszerzenia wiedzy na temat funkcji i dysfunkcji komórek śródbłonka. Zgodnie z zademonstrowanym protokołem możliwe jest badanie dowolnego innego rodzaju komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających i rozciągania.

human-saphenous-vein-endothelial-cell-isolation-exposure-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Mechanizmy prowadzące do rozwoju przerostu błony wewnętrznej (IH) i niewydolności przeszczepów żył są nadal słabo poznane. Badanie to opisuje system ex vivo do perfuzji ludzkich żył pod kontrolowanym przepływem i ciśnieniem. Ponadto oceniono skuteczność zbrojenia siatką zewnętrzną w celu ograniczenia rozwoju IH.

Procedura perfuzji żył odpiszczelowych człowieka ex vivo i wzmocnienia zewnętrznego

Różne poziomy i wzorce ścinania płynu są znane z modulowania ekspresji genów śródbłonka, fenotypu i podatności na choroby. Omawiamy montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": modelu, który wytwarza jednokierunkowe, okresowe wzorce naprężeń ścinających. Pierścienie ścinane są proste w montażu, ekonomiczne i mogą wytwarzać wysoką wydajność ogniw.

Montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających

Tutaj przedstawiono przebieg pracy dla hodowli i analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających. Uwzględniono fizyczny układ do jednoczesnego przechowywania i monitorowania wielu komór przepływowych w kontrolowanym środowisku oraz zastosowanie egzogennego referencyjnego RNA do ilościowej reakcji PCR.

Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką

Celem tego protokołu jest opisanie zmodyfikowanej równoległej komory przepływowej do wykorzystania w badaniu w czasie rzeczywistym aktywacji mechanowrażliwych kanałów jonowych przez naprężenie ścinające.

Elektrofizjologiczne zapisy prądów jonowych pojedynczych ogniw pod wpływem dobrze zdefiniowanego naprężenia ścinającego

Ten protokół opisuje metodę powlekania w celu ograniczenia wzrostu komórek śródbłonka do określonego obszaru 6-dołkowej płytki w celu przyłożenia naprężeń ścinających przy użyciu modelu wytrząsarki orbitalnej.

Segmentacja wzrostu komórek śródbłonka w 6-dołkowych płytkach na wytrząsarce orbitalnej do badań mechanobiologicznych

Tutaj ustalamy protokół jednoczesnej wizualizacji i analizy wielu kompleksów SMAD za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (PLA) w komórkach śródbłonka narażonych na patologiczne i fizjologiczne warunki stresu ścinającego płyny.

Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

Tutaj opracowaliśmy model ludzkiego narządu na chipie komórek mięśni gładkich aorty, aby odtworzyć in vivo biomechaniczne napięcie komórek mięśni gładkich w ludzkiej ścianie aorty.

Budowa modelu narządów na chipie komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do rekapitulacji naprężeń biomechanicznych w ścianie aorty

Opisano tutaj prosty proces różnicowania komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie szczegółowy protokół ich mechanicznej stymulacji. Pozwala to na badanie mechanobiologii rozwojowej komórek śródbłonka. Podejście to jest kompatybilne z dalszymi testami żywych komórek pobranych z chipa hodowlanego po stymulacji mechanicznej.

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

Poznaj izolację komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i metody narażania ich na kontrolowane naprężenia ścinające oraz rozciąganie cykliczne. Protokół umożliwia badanie odpowiedzi mechanicznej w biologii naczyniowej.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Przeglądaj więcej filmów