Name: Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metodę generowania sferoid 3D guza do badań oceny leków przy użyciu obrazowania wysokoprzepustowego i analizy głębokiego uczenia. To podejście zwiększa dokładność testów farmakologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom naszych laboratoriów za ich krytyczny wkład i sugestie. Badania te były wspierane przez kluczowy projekt Komisji Zdrowia Jiangsu (K2019030). Konceptualizacja została przeprowadzona przez C.W. i Z.C., metodologia została przeprowadzona przez W.H. i M.L., badanie zostało przeprowadzone przez W.H. i M.L., kuratoria danych została przeprowadzona przez W.H., Z.Z., S.X. i M.L., pierwotne przygotowanie projektu zostało wykonane przez Z.Z., J.Z., S.X., W.H., i X.L., recenzją i redakcją zajmowała się firma Z.C., administracją projektu zajmowały się C.W. i Z.C., a pozyskiwaniem finansowania zajmowała się firma C.W. Wszyscy autorzy zapoznali się z opublikowaną wersją manuskryptu i wyrazili na nią zgodę.

1. Tworzenie sferoidów
<ol>
	<li>Obróbka przeciwadhezyjna płytki hodowlanej
	<ol>
		<li>Do każdego dołka płytki 48-dołkowej z dnem w kształcie litery U nanieść 100 µL odczynnika przeciwadhezyjnego i pozostawić na 10 min. Po 10 min odessać odczynnik powlekający i przemyć dwukrotnie sterylnym PBS.</li>
		<li>Płytkę hodowlaną umieścić w inkubatorze (37 °C w wilgotnym powietrzu z 5% CO2) do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie, zbieranie i liczenie komórek
	<ol>
		<li>Do hodowli komórek w kolbach do hodowli komórkowej stosować medium specyficzne dla danej linii komórkowej (Tabela uzupełniająca 2). Na przykład komórki NCI-H23 oraz CT-26 hoduje się w RPMI 1640, a komórki HT-29 w medium McCoy's 5A. Oba te media są uzupełnione odpowiednio o 10% inaktywowanego cieplnie FBS i 1% P/S.</li>
		<li>Wszystkie komórki podczas proliferacji utrzymywać w standardowych warunkach hodowli (37 °C w wilgotnym powietrzu z 5% CO2). W poniższych krokach jako przykład zastosowano linię komórkową NCI-H23.</li>
		<li>Komórki hodowane w kolbie T25 przemyć dwukrotnie 1x PBS w celu usunięcia medium hodowlanego (zaleca się wybór komórek w fazie logarytmicznej i pasażowanie przy konfluencji 80%-90%).</li>
		<li>Namnożone komórki traktować 1 mL 0,25% trypsyny/EDTA przez 1-2 min w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO2. Potwierdzić kształt komórek (w tym przypadku zazwyczaj okrągły) pod mikroskopem, a następnie przerwać traktowanie trypsyną. W tym celu odessać zawiesinę trypsyny/EDTA z kolby T25 i przemyć komórki 4 mL świeżego medium.</li>
		<li>Przenieść całą zawiesinę (5 mL) do probówki 15 mL. Użyć 1 mL świeżego medium do wypłukania pozostałych komórek i dodać je do probówki. Wirować komórki przy 186,48 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć nadosad i dodać 10 mL świeżego medium do osadu komórkowego, a następnie delikatnie pipetować do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek.</li>
		<li>Odessać 0,1 mL zawiesiny komórkowej do nowej probówki wirówki, dodać 0,9 mL świeżego medium, a następnie dokładnie wymieszać zawiesinę pipetą.</li>
		<li>Pobrać 10 µL zawiesiny komórkowej w celu policzenia komórek. Powtórzyć ten proces dwa lub trzy razy i obliczyć wartość średnią.</li>
		<li>Rozcieńczyć zawiesinę tak, aby uzyskać końcową gęstość wysiewu 50 000 komórek/mL, zgodnie z stężeniem otrzymanym w procesie liczenia komórek w kroku 1.2.7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórek i formowanie sferoidów
	<ol>
		<li>Do każdego dołka płytki 48-dołkowej z dnem w kształcie litery U dodać 200 µL zawiesiny komórkowej.</li>
		<li>Owinąć płytkę folią uszczelniającą i wirować przy 119,35 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie wyjąć płytkę z wirówki i zdjąć folię ochronną. Następnie do kanału wodnego otaczającego dołki wlać 5-8 mL sterylnej wody (aby zapobiec odparowywaniu) i inkubować w 37 °C przez 5 dni. W tym okresie nie wymieniać ani nie uzupełniać wody w kanale wodnym.</li>
		<li>Obserwować agregację komórek podczas następnych 5 dni. 
		UWAGA: Zazwyczaj komórki zaczynają skupiać się w kolonie w ciągu 5 dni. Jednak proces tworzenia sferoidów może przebiegać szybciej lub wolniej w zależności od typu komórek i ich gęstości. Z tego powodu komórki należy obserwować każdego dnia jedną z trzech możliwych metod. Po pierwsze, komórki można obserwować przez dno płytki z dołkami. Gdy sferoidy jeszcze nie powstały, widoczna jest pojedyncza warstwa komórek na dnie. Gdy komórki utworzą sferoid, na dnie w kształcie litery U każdego dołka widoczna będzie gęsta struktura 3D. Inną metodą jest badanie komórek pod mikroskopem. Gdy komórki przekształcą się w sferoid nowotworowy, struktura ta składa się z trzech warstw (warstwy proliferacyjnej, warstwy nieaktywnej i rdzenia nekrotycznego, od zewnątrz do wnętrza sferoidu), które wykazują gradient przezroczystości. Wreszcie, do celów obserwacyjnych można wykorzystać kolor medium hodowlanego. Jest to pomocne, gdy struktura trójwarstwowa nie jest wyraźnie widoczna nawet przy użyciu mikroskopu cyfrowego. Gdy medium zmieni kolor z purpurowoczerwonego na żółty, można rozpocząć proces osadzania sferoidów w żelu. Medium nie powinno być wymieniane w okresie agregacji komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie w żelu 
	UWAGA: Żele należy przechowywać w temperaturze poniżej −20 °C. W szczególności żele powinny być umieszczone z dala od drzwi zamrażarki, aby uniknąć wahań temperatury. Należy pamiętać, że na tym etapie procesu żele znajdują się w stanie zamrożonym.
	<ol>
		<li>Wyjąć zamrożony żel z zamrażarki (−20 °C) i przez cały czas trwania eksperymentu trzymać go w kasetce z lodem.</li>
		<li>Obserwować sferoidy komórkowe pod mikroskopem. Przed rozpoczęciem osadzania w żelu stan sferoidów należy ponownie sprawdzić za pomocą mikroskopu cyfrowego.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć 150 µL medium. Płytkę należy również umieścić w kasetce z lodem.</li>
		<li>Osadzić każdy sferoid w żelu, powoli dodając płynny żel od strony ścianki dołka, jednocześnie poruszając schłodzoną końcówką pipety wokół i wewnątrz dołka. Odczekać 5 min, a jeśli żel nie rozprzestrzeni się równomiernie, delikatnie wymieszać go końcówką pipety 10 µL. Każdy dołek zawiera sferoid nowotworowy, 25 µL żelu o stężeniu 3,5 mg/mL oraz 50 µL kompletnego medium hodowlanego. Do kontroli należy również dodać 75 µL medium. 
		UWAGA: Każdy dołek zawiera jeden sferoid.</li>
		<li>Inkubować płytkę w 37 °C przez 30 min do pełnego zakończenia hydrożelacji. Potwierdzić stan żelowania pod mikroskopem.</li>
		<li>Nałożyć 125 µL świeżego medium na każdą próbkę.</li>
		<li>Hodować sferoidy przez kolejne 7-10 dni. Przygotować grupy sferoidów po cztery do sześciu dołków w każdej i wybrać co najmniej trzy z nich do analizy. 
		​UWAGA: W przypadku przeprowadzania testu lekowego przygotować dwie grupy dla jednej próbki. Jedną grupę wykorzystuje się do badania żywotności, a drugą do rejestracji obrazów i analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Leczenie preparatem
<ol>
	<li>Rozpuścić lek zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować 100-krotne roztwory robocze w DMSO. Przygotować co najmniej pięć dawek leku w serii rozcieńczeń. W tym przykładzie zastosowano lek terapeutyczny stosowany w raku płuc, AMG 510. Skład przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 1.</li>
	<li>Użyć 0,1% DMSO jako kontroli pozytywnej.</li>
	<li>Dodać 125 µL medium z lekiem do każdego dołka i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze (37 °C w nawilżonym powietrzu z 5% CO2). Na tym etapie każdy dołek zawiera sferoid nowotworowy, 25 µL żelu o stężeniu 3,5 mg/mL oraz 175 µL medium. Kontrole zawierają 200 µL medium.</li>
</ol>
3. Żywotność sferoidów
<ol>
	<li>Oceń żywotność sferoidów za pomocą zestawu do testu Alamar Blue zgodnie z wytycznymi producenta. Po przeprowadzeniu inkubacji z Alamar Blue zmierz żywotność przy użyciu fotometru do mikropłytek (absorbancja przy 570 nm i 600 nm).</li>
	<li>Zmierz żywotność odpowiednio w 1., 4., 7. i 10. dniu po osadzeniu sferoidów w żelu lub zgodnie z instrukcją. 
	UWAGA: W przypadku testu Alamar Blue wymagany jest czas reakcji wynoszący co najmniej 16 h. W związku z tym dodaj 20 µL Alamar Blue po południu w dniu 0, 3, 6 i 9.</li>
	<li>Odsącz 100 µL medium znad osadu z każdej studni do nowej płytki testowej i dodaj 80 µL świeżego medium do każdej studni płytki hodowlanej. Następnie zastąp kolejne 100 µL medium z lekiem. Upewnij się, że w studni nie pozostały resztki Alamar Blue. 
	​UWAGA: Wymiana medium jest przeprowadzana przy każdym badaniu żywotności; medium z lekiem w grupach analizy obrazowej również musi zostać wymienione w tym samym dniu.</li>
</ol>
4. Obserwacja sferoidów i analiza głębokiego uczenia na podstawie obrazów w teście lekowym
<ol>
	<li>Obrazowanie
	<ol>
		<li>Przed obrazowaniem odessać 100 µL pożywki.</li>
		<li>Umieścić płytkę na stoliku mikroskopu. Wykonać cyfrowe zdjęcia sferoidów za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu z obiektywem 10x (początkowo obiektywem 2x). Mikroskop może automatycznie ustawić ostrość i wycentrować sferoidy. 
		UWAGA: Funkcja autofokusa oraz zastosowany algorytm zostały wcześniej opisane przez Yazdanfar et al.17.</li>
		<li>Odczekać do zakończenia automatycznego obrazowania. Dla każdego sferoidu pozyskiwane są cztery obrazy. Następnie powstaje obraz zintegrowany, który jest przetwarzany przez oprogramowanie połączone z systemem obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging system).</li>
		<li>Kliknąć przycisk „Image patch process” i wybrać obrazy zintegrowane w oprogramowaniu.</li>
		<li>Wybrać „U-NET model” i wpisać współczynnik konwersji (dla obrazów z obiektywu 10x współczynnik konwersji wynosi 3,966). Kliknąć w dolnej części ekranu, aby rozpocząć przetwarzanie obrazów. Następnie zapisać dane dotyczące średnicy, obwodu i chropowatości w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
		<li>Obliczyć wskaźnik nadmiarowego obwodu (excess perimeter index, EPI). EPI jest stosunkiem obwodu sferoidu (P0) do obwodu równoważnego (Pe), obliczanym zgodnie z rów. 1. Zmierzyć powierzchnię sferoidu w płaszczyźnie ogniskowej (S) za pomocą programu Image J. Następnie obliczyć obwód równoważny sferoidu zgodnie z rów. 2. 
		EPI = (Po− Pe)/Pe       (Eq. 1) 
		<img alt="Równanie do obliczania obwodu, Pe = 2π√(S/π); formuła matematyczna do analizy geometrycznej." src="/files/ftp_upload/65125/65125eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1">      (Eq. 2) 
		UWAGA: Obwód sferoidu jest generowany przez oprogramowanie z wykorzystaniem algorytmów głębokiego uczenia opartych na opracowanym modelu U-NET.</li>
		<li>Dodać 100 µL świeżej pożywki z lekiem i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze (37 °C w powietrzu zwilżonym z 5% CO2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inhibicja wzrostu sferoidów
	<ol>
		<li>Obliczyć inhibicję wzrostu guza (tumor growth inhibition, TGI) zgodnie z rów. 3. Względna objętość sferoidu (relative spheroid volume, RTV) to objętość końcowa podzielona przez objętość początkową (rów. 4). Objętość sferoidu (V) jest obliczana automatycznie przez oprogramowanie zgodnie z rów. 5 na podstawie uzyskanej średnicy sferoidu. 
		TGI = (RTVcontrol− RTVtreatment)/RTVcontrol × 100%      (Eq. 3) 
		RTV = Vterminal/Voriginal       (Eq. 4) 
		V = 4/3π(d/2)3      (Eq. 5) 
		UWAGA: TGI jest wyznaczany w odniesieniu do inhibicji wzrostu in vivo, gdzie masę guza zastąpiono wartością RTV. RTVcontrol to względna objętość sferoidu w grupie kontrolnej, RTVtreatment to względna objętość sferoidu w grupie badanej lekiem, Vterminal to objętość sferoidu w ostatnim dniu, Voriginal to objętość sferoidu w pierwszym dniu hodowli, a d oznacza średnicę sferoidu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li>
<li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li>
<li>Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-Ts%3A+New+perspectives+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy.</a> FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).</li>
<li>Shokooohi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+targeted+therapy+and+immunotherapy+on+advanced+nonsmall-cell+lung+cancer+outcomes+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world.</a> Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).</li>
<li>Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+to+target+RAS+signaling+in+human+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy.</a> Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116(2021).</li>
<li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).</li>
<li>Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stretchable+scaffold+with+electrochemical+sensing+for+3D+culture%2C+mechanical+loading%2C+and+real-time+monitoring+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells.</a> Advanced Science. 8 (13), 2003738(2021).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+%28HIF-1%29+ad+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species.</a> FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+spheroids+for+the+prediction+of+the+effects+of+radiation+and+hyperthermia+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments.</a> Scientific Reports. 10, 1653(2020).</li>
<li>Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+The+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerns%2C+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606(2018).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+morphological+and+physiological+monitoring+of+three-dimensional+tumor+spheroids+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59020(2019).</li>
<li>Yazdanfar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+robust+image-baed+autofocusing+for+digital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy.</a> Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770(2021).</li>
<li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 603640(2020).</li>
<li>Anastasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+factors+shaping+the+cancer+metabolism+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape.</a> British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+clinical+significance+of+mechanical+tumor+microenvironment%3A+Cancer+cell+sensing%2C+mechanobiology+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communications%22%5BJournal%5D)">Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis.</a> Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).</li>
<li>Zhu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+KRAS+cancers%3A+From+druggable+therapy+to+druggable+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 159(2022).</li>
<li>Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+in+vitro+tumor+models+for+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy.</a> Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).</li>
<li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li>
<li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroids%3A+An+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li>
<li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikrośrodowisko odgrywa ważną rolę we wzroście guza. Może wpływać na dostarczanie macierzy zewnątrzkomórkowych, gradienty tlenu, odżywianie i interakcje mechaniczne, a tym samym wpływać na ekspresję genów, szlaki sygnałowe i wiele funkcji komórek nowotworowych 19,20,21. W wielu przypadkach komórki 2D nie wywołują takich efektów lub nawet wywołują odwrotne efekty, wpływając w ten sposób na ocenę leczenia farmakologicznego. Jednak...

Rak jest jedną z najbardziej przerażających chorób, nie tylko ze względu na wysoką śmiertelność1. W ostatnich latach możliwości leczenia raka wzrosły wraz z wprowadzeniem nowych terapii2,3,4,5. Dwuwymiarowe (2D) i trójwymiarowe (3D) modele in vitro są wykorzystywane do badania nowotworów w warunkach laboratoryjnych. Jednak modele 2D nie są w stanie natychmiast i dokładnie ocenić wszystkich ważnych parametrów, które wskazują na wrażliwość przeciwnowotworową; W związku z tym nie są one w stanie w pełni odwzorować interakcji in vivo w testowaniu terapii lekowej<klasa SUP="xref">6.
Od 2020 roku globalny rynek kultur trójwymiarowych (3D) znacznie się rozwinął. Według jednego z raportów NASDAQ OMX, globalna wartość rynku kultur komórkowych 3D przekroczy 2,7 miliarda dolarów do końca 2025 roku. W porównaniu z metodami hodowli 2D, hodowla komórek 3D wykazuje korzystne właściwości, które można zoptymalizować nie tylko pod kątem proliferacji i różnicowania, ale także pod kątem długoterminowego przeżycia7,8. W ten sposób można symulować mikrośrodowiska komórkowe in vivo, aby uzyskać dokładniejszą charakterystykę guza, a także profilowanie metaboliczne, dzięki czemu można lepiej zrozumieć zmiany genomowe i białkowe. Z tego powodu systemy testów 3D powinny być obecnie włączane do głównego nurtu działań związanych z opracowywaniem leków, zwłaszcza tych, które koncentrują się na badaniach przesiewowych i ocenie nowych leków przeciwnowotworowych. Trójwymiarowe wzrosty unieśmiertelnionych, ustalonych linii komórkowych lub pierwotnych kultur komórkowych w strukturach sferoidalnych posiadają in vivo cechy nowotworów, takie jak niedotlenienie i penetracja leków, a także interakcja, odpowiedź i oporność komórek, i mogą być uważane za rygorystyczny i reprezentatywny model do przeprowadzania badań przesiewowych leków in vitro9,10,11.
Jednak te modele kultur 3D również cierpią na kilka problemów, których rozwiązanie może zająć trochę czasu. Sferoidy komórkowe mogą być tworzone przy użyciu tych protokołów, ale różnią się one pewnymi szczegółami, takimi jak czas hodowli lub zatapianie żeli12, więc te skonstruowane sferoidy komórkowe nie mogą być dobrze kontrolowane w ograniczonym zakresie rozmiarów. Wielkość sferoid może mieć wpływ na spójność badania żywotności i analizy obrazowej. Mikrośrodowiska wzrostu i czynniki wzrostu również się różnią, co może prowadzić do różnych morfologii ze względu na różnice w różnicowaniu między komórkami13. Obecnie istnieje oczywista potrzeba standardowej, prostej i opłacalnej metody konstruowania wszystkich typów nowotworów o kontrolowanych rozmiarach.
Z innej perspektywy, chociaż do oceny morfologii, żywotności i tempa wzrostu opracowano testy jednorodne i metody obrazowania o wysokiej zawartości, wysokoprzepustowe badania przesiewowe modeli 3D pozostają wyzwaniem z różnych powodów podawanych w literaturze, takich jak brak jednolitości w położeniu, rozmiarze i morfologii sferoid nowotworowych14,15,16.
W przedstawionym tutaj protokole wymieniamy każdy krok w budowie sferoid 3D guzów i opisujemy metodę obserwacji i analizy sferoidów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu obrazowania o wysokiej zawartości, który obejmuje autofokus, automatyczne obrazowanie i analizę, wśród innych korzystnych cech. Pokazujemy, w jaki sposób ta metoda może wytworzyć sferoidy guza 3D o jednolitym rozmiarze, które są odpowiednie do obrazowania o wysokiej przepustowości. Sferoidy te wykazują również wysoką wrażliwość na leczenie farmakologiczne nowotworów, a zmiany morfologiczne w sferoidach można monitorować za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości. Podsumowując, wykazujemy solidność tej metodologii jako środka do generowania konstruktów 3D guzów do celów oceny leków.

<table><tbody><tr><td>0,5-10 &m; L Końcówki do pipet</td><td>AXYGEN</td><td>T-300</td><td></td></tr><tr><td>1,5&nbsp; ml Mikroprobówki odporne na gotowanie</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&mu; L Końcówki do pipet</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Rurka wirówkowa</td><td>Nest</td><td>601052</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Końcówki do pipet</td><td>AXYGEN</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>Żel 3D</td><td>Avatarget</td><td>MA02</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa dolna płytka</td><td>U Avatarget</td><td>P02-48UWP</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Gniazdo probówki wirówkowej</td><td></td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Thermo</td><td>&nbsp; </td><td></td>DAL1100</tr><tr><td>Płyn do płukania zapobiegający przywieraniu</td><td>STEMCELL</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>Certyfikat FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>aladdyna</td><td>W433884-500ml</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Excel sofware&nbsp;</td>Oprogramowanie pryzmatyczne <td>Microsoft Office</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad&nbsp;</td><td>Oprogramowanie GraphPad&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High Content Imager i system SMART</td><td>Avatarget</td><td>1-I01</td><td></td></tr><tr><td>Image J oprogramowanie</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suplement insuliny-transferyny-selenu-A (100X)</td><td>Gibco</td><td>51300-044</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/ streptomycyna Sol</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Scientific Kolba Fluoroskan Ascent</td><td></td><td>Thermo Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>JET Biofil</td><td>TCF012050</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, 0,25% (1X)</td><td>Hyclon</td><td>SH30042,01</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie sferoid 3d guza do badań oceny leków

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

W ostatnich dziesięcioleciach, oprócz komórek hodowanych jednowarstwowo, opracowano trójwymiarowe sferoidy nowotworowe jako potencjalnie potężne narzędzie do oceny leków przeciwnowotworowych. Jednak konwencjonalne metody hodowli nie mają możliwości manipulowania sferoidami guza w jednorodny sposób na poziomie trójwymiarowym. Aby rozwiązać ten problem, w niniejszym artykule przedstawiamy wygodną i skuteczną metodę konstruowania sferoid guza średniej wielkości. Dodatkowo opisujemy metodę analizy obrazowej z wykorzystaniem oprogramowania analitycznego opartego na sztucznej inteligencji, które może zeskanować całą płytę i uzyskać dane na temat sferoid trójwymiarowych. Zbadano kilka parametrów. Dzięki zastosowaniu standardowej metody budowy sferoidów guza oraz wysokoprzepustowego systemu obrazowania i analizy, skuteczność i dokładność testów lekowych wykonywanych na trójwymiarowych sferoidach może zostać znacznie zwiększona.

Rycina 1A, B przedstawia proces wykorzystywany do tworzenia sferoidów nowotworowych w niniejszym badaniu. Najpierw wysiano komórki na płytkę 48-dołkową z dnem w kształcie litery U. Krok ten jest niemal identyczny z tym stosowanym w hodowli komórkowej 2D. Płytkę przechowywano w inkubatorze w otoczeniu wody, aby osadzone komórki mogły rozpocząć tworzenie sferoidów w procesie samorganizacji. W normalnych warunkach operacyjnych większość typów sferoidów nowotworowych została w p...

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

W protokole tym zademonstrowano standaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych guzów sferoidów. Metodologia ta zapewniła analizę wysokiego obwodu i wysokiej zawartości konstruktów nowotworowych 3D. Dzięki zastosowaniu standardowej metody budowy sferoidów nowotworowych oraz wysokoprzepustowego systemu obrazowania i analizy, skuteczność i dokładność testów lekowych tworzonych na trójwymiarowych sferoidach może zostać znacznie zwiększona.W tym protokole użyliśmy AMG510 do potraktowania sferoidy NCI-H23 jako przykładu. Na podstawie eksperymentu mogliśmy zaobserwować znaczący wpływ leku przeciwnowotworowego na sferoidy guza. Na początek odpipetuj 100 mikrolitrów odczynnika przeciwadhezyjnego do każdej studzienki 48-dołkowej płytki z dnem studzienki w kształcie litery U i trzymaj przez 10 minut.Po 10 minutach odessać odczynnik powlekający i dwukrotnie przemyć wysterylizowanym PBS. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym powietrzu z 5% dwutlenkiem węgla do momentu użycia. Obserwuj komórki pod mikroskopem.Następnie umyj komórki hodowane w kolbie T25 dwukrotnie PBS w celu usunięcia pożywki hodowlanej i potraktuj rozszerzone komórki jednym mi

generation-of-3d-tumor-spheroids-for-drug-evaluation-studies

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.

Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Przedstawiono protokół do zrobotyzowanego drukowania sferoid komórek rakowych na wysokoprzepustowej 96-dołkowej płytce przy użyciu wodnego systemu dwufazowego.

Zrobotyzowana produkcja sferoid komórek rakowych z wodnym dwufazowym systemem do testowania leków

Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.

Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Poznaj metodę generowania sferoid 3D guza do badań oceny leków przy użyciu obrazowania wysokoprzepustowego i analizy głębokiego uczenia. To podejście zwiększa dokładność testów farmakologicznych.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

Przeglądaj więcej filmów