Name: Wydłużenie żywotności neutrofili za pomocą CLON-G i testu spontanicznej śmierci in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj metodę wydłużenia żywotności neutrofili za pomocą medium CLON-G do ponad pięciu dni z zachowaniem funkcjonalności. Protokół umożliwia analizę cytometrią przepływową i mikroskopią fluorescencyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten projekt był wspierany przez Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Fundusz Innowacji Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (CAMS) dla Nauk Medycznych (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Specjalny Fundusz Badawczy dla Uniwersytetów Centralnych, Peking Union Medical College (3332022062) oraz Program Wsparcia Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (NO. 2021YJ0480).

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie oraz Państwowym Kluczowym Laboratorium Hematologii Eksperymentalnej (SKLEH) zatwierdziły i monitorowały wszystkie procedury. <silna klasa="xfig">Rysunek 1 przedstawia schemat hodowli neutrofili za pomocą CLON-G i testu zgonu in vitro.
1. Wydłużenie żywotności neutrofili za pomocą CLON-G
UWAGA: Wszystkie wymienione operacje i materiały muszą być sterylne. Upewnij się, że wszystkie roztwory są dobrze wymieszane i równomiernie rozprowadzone.
<ol>
	<li>Konserwacja komponentów CLON-G
	<ol>
		<li>Rozpuścić 50 mg Q-VD-oph (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 100 mM przez dodanie 973,7 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i pipetować ciecz do momentu, aż mieszanina stanie się klarowna. Podwielokrotność 50 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: DMSO jest szkodliwą cieczą chemiczną. Noś fartuch laboratoryjny, okulary i maskę, aby uniknąć kontaktu ze skórą, kontaktu z oczami i wdychania.</li>
		<li>Rozmrozić Hsp70 (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 4 °C i odwirować zawartość fiolki. Podaniec 1 μl Hsp70 na probówkę na lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Hsp70 jest białkiem; Bardzo zimne przechowywanie jest konieczne, aby utrzymać go stabilnie. Unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania.</li>
		<li>Rozpuścić 1 mg DFO (patrz tabela materiałów) w 7,61 ml RPMI 1640 w celu uzyskania zapasu 200 μM. Podwielokrotność 500 μl na probówkę i zachować w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Rozpuścić 0,1 g NAC (patrz tabela materiałów) w 2,5 ml RPMI 1640 w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i dostosować pH do 7-7,4 za pomocą NaOH. Dodaj RPMI 1640 do końcowej objętości 3,06 ml, aby uzyskać zapas NAC o pojemności 200 mM. Przefiltruj go za pomocą jednostki filtrującej 0,2 μm. Porcja 500 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Rozpuszczanie NAC w tak wysokim stężeniu nie jest łatwe, a wirowanie może pomóc w jego rozpuszczeniu. Czerwień fenolowa w RPMI 1640 jest doskonałym wskaźnikiem pH; kiedy NAC jest po prostu rozpuszczony, kolor jest żółtawy; Dostosuj go, aż stanie się różowawy. Roztwory podstawowe NAC są stabilne przez okres do 1 miesiąca w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Rozpuścić 10 mg Nec-1s (patrz Tabela Materiałów) w 20 mM za pomocą 1,8 ml DMSO i pipetować mieszaninę, aż stanie się klarowna. Porcjować 50 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C. Chronić przed światłem.</li>
		<li>Rozpuścić 250 μg G-CSF (patrz tabela materiałów) do 200 μg/ml w 1.25 ml RPMI 1640. Podwielokrotność 50 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 2x pożywki hodowlanej CLON-G
	<ol>
		<li>Przygotuj podłoże podstawowe. Dodaj 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,5 ml pen-strep (antybiotyki) do probówki o pojemności 50 ml, aby uzyskać RPMI 1640 z 20% FBS i 1% PS jako pożywką zasadową. 
		UWAGA: To wysokie stężenie FBS jest wykorzystywane do zapewnienia przedłużonej hodowli neutrofili, która może być większa niż 5 dni. Jeśli czas hodowli wynosi 1-2 dni, wystarczy 10%-15% FBS.</li>
		<li>Rozmrozić wszystkie roztwory podstawowe składników CLON-G na lodzie.</li>
		<li>Rozcieńczyć 1 μl Hsp70 do 20 μM, dodając 606 μl podłoża zasadowego. Rozcieńczyć 1 μl z 200 μg/mL G-CSF do 20 μg/ml przez dodanie 9 μl pożywki zasadowej.</li>
		<li>Dodać 976 μl podłoża zasadowego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 1 μL Q-VD-oph (100 mM), 10 μL DFO (200 μM), 1 μL Hsp70 (20 μM), 10 μL NAC (200 mM), 1 μL Nec-1s (20 mM) i 1 μL G-CSF (20 μg / ml), aby uzyskać 1 ml 2x pożywki CLON-G. 
		UWAGA: Pożywkę 2x CLON-G należy zużyć natychmiast po przygotowaniu. 2x CLON-G można przechowywać tymczasowo w temperaturze 4 °C. Resztki 20 μM Hsp70 należy wyrzucić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiew neutrofili
	<ol>
		<li>Wyizoluj mysie neutrofile przez wirowanie gradientowe zgodnie z poprzednim raportem25. Zawiesić wyizolowane mysie neutrofile w pożywce podstawowej (1 milion komórek/100 μl). 
		UWAGA: Unikaj aktywacji neutrofili poprzez delikatne obchodzenie się z nimi. Unikaj pienienia się podczas całego procesu.</li>
		<li>Dodać 500 μl 2x pożywki CLON-G, 400 μl pożywki zasadowej i 100 μl zawiesiny komórkowej do 24-dołkowych płytek do hodowli nietkankowych (patrz tabela materiałów) i delikatnie pipetować trzy do czterech razy. 
		UWAGA: Wysokie stężenia składników w pożywce 2x CLON-G mogą uszkodzić neutrofile; Unikaj dodawania ich do siebie bez podłoża podstawowego. Płytka hodowlana bez hodowli tkankowej jest konieczna, aby uniknąć adhezji neutrofili.</li>
		<li>Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5 % CO2 bez zakłóceń. 
		UWAGA: Nie ma potrzeby wymiany pożywki komórkowej w ciągu 7 dni. Końcowe stężenia kompozycji CLON-G to 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s i 10 ng/mL G-CSF.</li>
		<li>Wybarwić hodowane neutrofile barwnikiem złożonym Wrighta Giemsy (patrz Tabela Materiałów) i przeanalizować za pomocą mikroskopu świetlnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A-D). Alternatywnie, wybarwić przeciwciałami APC-CD11b i PE-Cy7-Ly6G i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E-I), jak opisano wcześniej26.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test in vitro spontanicznej śmierci neutrofili
<ol>
	<li>Analiza cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Hodowla izolowała neutrofile o gęstości 1 miliona komórek/ml w pożywce podstawowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . 24-dołkowa płytka hodowlana nie jest hodowana tkankowo. Dodaj 1 ml pożywki komórkowej na dołek.</li>
		<li>Rozpuścić 1 g CaCl2 w 45 ml soli fizjologicznej, aby uzyskać 200 mM CaCl2. Przefiltruj go za pomocą jednostki filtrującej 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj mieszankę barwiącą. Dodać 7 μl soli fizjologicznej na próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml jodku propydu (PI) i 200 mM roztworu CaCl2 w ilości 1 μl każdy na próbkę. Dobrze wymieszaj. Roztwór należy zużyć natychmiast po przygotowaniu.</li>
		<li>Delikatnie odpipetować pożywkę komórkową pięć do siedmiu razy, aby dobrze wymieszać, a następnie przenieść 100 μl do probówki do cytometrii przepływowej w żądanych punktach czasowych. 
		UWAGA: Unikaj pienienia się podczas całego procesu.</li>
		<li>Zliczaj kulki do liczenia wirów (patrz tabela materiałów), aby dobrze je wymieszać. Pobrać pipetę z 10 μl dobrze wymieszanych kulek liczących do tej samej probówki do cytometrii przepływowej, jak w kroku 2.1.4.</li>
		<li>Dodać 10 μl przygotowanej mieszaniny barwiącej (krok 2.1.3) do probówki do cytometrii przepływowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut z dala od światła.</li>
		<li>Dodaj 100 μl soli fizjologicznej do probówki i dobrze wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie kulek i komórek do liczenia.</li>
		<li>Wykonaj analizę cytometrii przepływowej pożywki komórkowej. Zbieraj komórki z niską szybkością z ~400 zdarzeniami/s. Bramkować ogniwa APC-PE-Cy7- do FSC-A i SSC-A oraz bramkować nienaruszone komórki z pośrednimi pozycjami FSC-A i SSC-A do FITC-Annexin-V i PE-PI; populacja Aneksyny-V−PI− jest klasyfikowana jako zdrowe komórki. 
		UWAGA: Poniższe równania określają całkowitą liczbę zdrowych komórek w próbce i żywotność neutrofili: 
		Całkowita liczba zdrowych komórek w próbce27 = (1,000/liczba koralików do liczenia) × liczba populacji Annexin-V−PI− × 10 
		Żywotność neutrofili = całkowita liczba zdrowych komórek we wskazanym czasie/całkowita liczba zdrowych komórek w czasie zero</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test obrazu fluorescencyjnego
	<ol>
		<li>Hodowla izolowanych neutrofili o gęstości 1 miliona komórek/ml w pożywce podstawowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na płytce konfokalnej z 2 ml pożywki komórkowej na płytkę. 
		UWAGA: Konfokalny mikroskop fluorescencyjny ma najlepszą jakość obrazu, ale każdy mikroskop fluorescencyjny z kanałami 488/561/DIC jest wystarczający do wsparcia tego eksperymentu.</li>
		<li>Delikatnie wyjmij płytkę we wskazanym momencie. Równomiernie dodać do płytki po 10 μl 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml PI i 200 mM CaCl2. Bejcować w temperaturze pokojowej przez 5 min. 
		UWAGA: Unikaj potrząsania podczas całego procesu. Równomiernie i delikatnie dodawać środki barwiące.</li>
		<li>Rejestruj obrazy fluorescencji w kanałach 488 (annexin-V)/561 (PI)/DIC za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego z soczewką obiektywową 20x (patrz tabela materiałów). Ustaw czas ekspozycji kanału 488 na 500 ms, kanału 561 na 200 ms, a kanału DIC na 100 ms. Wybierz 5-10 losowych obszarów dla każdej płyty. Typy komórek są zdefiniowane w naszym wcześniej opublikowanym raporcie14.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badania zostały przeprowadzone przy braku konfliktu interesów.

Neutrofile odgrywają istotną rolę w odporności wrodzonej i nabytej, a ich homeostaza jest ściśle regulowana. Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami w ludzkiej krwi obwodowej i mają solidny i szybki obrót. Zdrowa osoba dorosła może uwalniać 1 x 109 neutrofili/kg dziennie ze szpiku kostnego28. Śmierć neutrofili stała się więc jedną z zagadkowych zagadek w tej dziedzinie i wiele wysiłku włożono w ich lepsze zrozumienie. Udowodniono, że kaspaza 29,30,31,32, LMP 3...

Neutrofile są znane z tego, że zawierają arsenał obfitych granulek cytoplazmatycznych, oksydazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), enzymów przeciwdrobnoustrojowych i różnych organelli, które bronią przed inwazją mikrobów; dodatkowo, są bardzo ruchliwe i są pierwszymi komórkami rekrutowanymi do miejsca zapalenia, co oznacza, że neutrofile są pierwszą linią obrony wrodzonego układu odpornościowego1, 2. Terapia transfuzją granulocytów stała się zatem obiecującą metodą leczenia klinicznego zakażeń związanych z neutropenią w celu przejściowego zwiększenia odporności na neutrofile3,4,5. Ostatnie odkrycia wyraźnie pokazały, że neutrofile funkcjonują również jako wielopłaszczyznowe efektory w wielu scenariuszach fizjopatologicznych6. Średnia długość życia neutrofili wynosi mniej niż 24 godziny, a zatem podstawowe badania neutrofili i zastosowanie badań neutrofili są niezwykle trudne ze względu na ograniczenia związane ze stabilnymi manipulacjami genetycznymi i długoterminowym przechowywaniem7,8,9,10,11. Istnieją pewne linie komórkowe, które mogą częściowo wykazywać niektóre funkcje neutrofili, takie jak HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste12. Te linie komórkowe mogą osiągnąć skuteczną edycję genów i krioprezerwację; Jednak nadal różnią się one znacznie od pierwotnych neutrofili i dlatego nie mogą wiernie podsumować funkcji neutrofili<klasa SUP="xref">13. Tak więc większość badań w tej dziedzinie nadal opiera się na świeżo wyizolowanych pierwotnych neutrofilach. Dziedzina ta nadal opiera się na generowaniu kosztownych i czasochłonnych myszy z warunkowym nokautem w celu zbadania określonych funkcji genów w neutrofilach, ale obecnie nie istnieją żadne modele ludzkie.
Po włożeniu wysiłku w zbadanie heterogenicznych procesów związanych ze śmiercią neutrofili i wielu szlaków, które regulują te procesy14,15, niedawno zgłoszono nową terapię o nazwie CLON-G (kaspazy-lizosomalne przenikanie błony-utleniacz-necroptoza hamowanie plus czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów)16. CLON-G składa się z Q-VD-oph (chinolilo-valyl-O-methyllaspartyl-[-2,6-difluorofenoksy]-ketonu metylowego), Hsp70 (białko szoku cieplnego 70), DFO (deferoksamina), NAC (N-acetylocysteina), Nec-1s (nekrostyna-1) i G-CSF (czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów). Spontaniczna śmierć neutrofili odbywa się za pośrednictwem wielu szlaków, w tym apoptozy, nekroptozy i piroptozy. Q-VD-oph hamuje apoptozę neutrofili jako inhibitor pan-kaspazy poprzez celowanie w kaspazę 1, kaspazę 3, kaspazę 8 i kaspazę 917. Nekroptoza neutrofili jest zależna od szlaku sygnałowego obejmującego kinazę białkową-1 oddziałującą z receptorem (RIPK1) i białko podobne do domeny kinazy o mieszanej linii (MLKL)18. Jako inhibitor RIPK1, Nec-1 hamują nekroptozę neutrofili. Hsp70 i DFO mogą hamować przepuszczalność błony lizosomalnej (LMP), co może indukować apoptozę neutrofili19 i pyroptozę20. Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają istotną rolę w śmierci neutrofili, pośrednicząc w LMP19 i apoptozie21 oraz hamując sygnały przeżycia22. Jako przeciwutleniacz, który może zmniejszać akumulację ROS, NAC opóźnia śmierć neutrofili. Jako czynnik wzrostu, G-CSF aktywuje sygnały przeżycia neutrofili i hamuje apoptozę wywołaną kalpainą23,24. Dzięki jednoczesnemu celowaniu w wiele szlaków spontanicznej śmierci neutrofili, długość życia neutrofili może zostać skutecznie wydłużona do ponad 5 dni bez uszczerbku dla ich funkcji. Leczenie CLON-G rozszerza możliwości zachowania, transportu i manipulacji genami neutrofili, co może przyspieszyć badania w społeczności neutrofili. Tymczasem, w oparciu o wiedzę na temat śmierci neutrofili, obecnie zatwierdzone protokoły oznaczania śmierci komórek mogą powodować nieoczekiwane uszkodzenia neutrofili14, więc protokoły te zostały dopracowane, aby były bardziej odpowiednie do badań neutrofili. Niniejszy raport zawiera szczegółowe protokoły hodowli neutrofili za pomocą CLON-G oraz test śmierci komórkowej in vitro neutrofili myszy przy użyciu cytometrii przepływowej i obrazowania fluorescencyjnego. CLON-G jest skuteczny zarówno w przypadku neutrofili myszy, jak i ludzi; Jednak próbki myszy są tutaj pokazane, aby uprościć ten protokół. Stężenie NAC wynosi 1 mM dla neutrofili myszy i 10 μM dla neutrofili ludzkich. Hsp70 jest specyficzny dla gatunku i dlatego powinien być stosowany w zależności od źródła neutrofili. W przypadku tego protokołu nie ma znaczenia, czy neutrofile są izolowane z krwi obwodowej lub szpiku kostnego i w jaki sposób są izolowane.
Na potrzeby obecnego badania, neutrofile zostały wyizolowane ze szpiku kostnego myszy, aby uzyskać wystarczającą ilość neutrofili do eksperymentów, ponieważ około 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrofili można uzyskać ze szpiku kostnego, podczas gdy tylko 1 x 106 neutrofili można wyizolować z krwi obwodowej pojedynczej 8-12 tygodniowej myszy C57BL/6 (dowolnej płci). Wirowanie gradientowe przeprowadzono w celu uniknięcia możliwych uszkodzeń i aktywacji w wyniku mechanicznej stymulacji sortowania FACS lub sortowania MACS.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Pall Corporation</td><td>4612</td><td>Filtrat przygotowany Składniki CLON-G.</td></tr><tr><td>Mikroprobówka wirówkowa 1,5 ml</td><td>LABSELECT</td><td>MCT-001-150</td><td>Laboratoryjny materiał eksploatacyjny.</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>LABSELECT</td><td>CT-002-15</td><td>Materiał eksploatacyjny laboratoryjny.</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>Płytka do hodowli neutrofili.</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 50 ml</td><td>LABSELECT</td><td>CT-002-50</td><td>Materiał eksploatacyjny laboratoryjny.</td></tr><tr><td>BD LSRII</td><td>BD</td><td></td><td>Przyrząd do analizy śmierci neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>Pomocnik wiązania Aneksyny-V z fosfatydyloseryną.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Perkinelmer</td><td>UltraVIEW VOX</td><td>Instrument do fluorescencyjnej analizy śmierci neutrofili.</td></tr><tr><td>Płytka konfokalna</td><td>NEST</td><td>801001-20mm</td><td>Laboratoryjny materiał eksploatacyjny do badania obrazu fluorescencyjnego.</td></tr><tr><td>Liczenie kulek</td><td>Thermo Fisher</td><td>C36950</td><td>Kwantyfikacja w analizie cytometrii przepływowej śmierci neutrofili.</td></tr><tr><td>DFO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9533</td><td>Element CLON-G. Inhibitor LMP.</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>Rozpuszczalnik do Q-VD-oph i Nec-1s.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>Składnik pożywki podstawowej do hodowli neutrofili. Zaopatrzenie w składniki odżywcze.</td></tr><tr><td>FITC-Annexin-V</td><td>BD</td><td>51-65874X</td><td>Annexin-V może wiązać się z fosfatydyloseryną starzejących się komórek. To jest na kanale FITC.</td></tr><tr><td>HSP70</td><td>Abcam</td><td>ab113187</td><td>Składnik CLON-G. Inhibitor LMP.</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>Komponent CLON-G. Antyoksydant.</td></tr><tr><td>Nec-1s</td><td>EMD Millipore</td><td>852391-15-2</td><td>Składnik CLON-G. Inhibitor nekroptozy.</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny (PS)</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>Składnik pożywki podstawowej do hodowli neutrofili. Antybiotyki chroniące komórki przed komutacją bakterii.</td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td>Do oznaczania śmierci neutrofili. Mała cząsteczka fluorescencyjna, która wiąże się z DNA&nbsp; ale nie może biernie przenikać do komórek, które mają nienaruszoną błonę plazmatyczną.</td></tr><tr><td>Q-VD-oph</td><td>Selleck chem</td><td>S7311</td><td>Składnik CLON-G. Inhibitor pan-kaspazy.</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów do wstrzykiwań (komórka CHO)(G-CSF)</td><td>Chugai Pharma China</td><td>GRANOCYTE</td><td>Składnik CLON-G.&nbsp; Promuj przeżycie neutrofili poprzez szlak Akt.</td></tr><tr><td>Rurki z polistyrenu okrągłodennego</td><td>Falcon</td><td>100-0102</td><td>Laboratoryjny materiał eksploatacyjny do analizy cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>Składnik podstawowej pożywki do hodowli neutrofili.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>LEAGENE</td><td>R00641</td><td>Roztwór do analizy śmierci neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>FENG CHUAN</td><td>13-011-00029</td><td>Regulacja pH dla NAC.</td></tr><tr><td>Roztwór barwienia Wright-Giemsa</td><td>Solarbio</td><td>G1020</td><td>Barwienie cytospinowe neutrofili</td></tr></tbody></table>.

wydłużenie żywotności neutrofili za pomocą clon-g i testu spontanicznej śmierci in vitro

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

Średnia długość życia neutrofili jest krótsza niż 24 godziny, co ogranicza podstawowe badania nad neutrofilami i zastosowanie badań nad neutrofilami. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że wiele szlaków może pośredniczyć w spontanicznej śmierci neutrofili. Opracowano koktajl poprzez jednoczesne ukierunkowanie na te szlaki, kaspazy-lizosomalne hamowanie przenikania błony-utleniacza-nekroptozy oraz czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (CLON-G), który wydłużył żywotność neutrofili do ponad 5 dni bez znaczącego pogorszenia funkcji neutrofili. Równolegle opracowano również wiarygodny i stabilny protokół oceny i oceny śmierci neutrofili. W tej pracy wykazaliśmy, że CLON-G może przedłużyć żywotność neutrofili in vitro do ponad 5 dni, a także wykazujemy wydłużenie życia neutrofili za pomocą FACS i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. W niniejszym raporcie przedstawiono procedury przygotowania CLON-G i przedstawiono test spontanicznego zgonu neutrofili in vitro, który może być wykorzystany do badania neutrofili, a następnie do badania śmierci neutrofili, zapewniając w ten sposób wiarygodne źródło informacji dla społeczności neutrofili.

Morfologia po barwieniu metodą Wrighta-Giemsy (Rycina 2A-D) oraz fenotypy FACS (Rycina 2E-J) neutrofili traktowanych CLON-G nie uległy zmianie. Żywotność neutrofili traktowanych CLON-G po 24 h wynosiła około 90%+ na podstawie analizy cytometrii przepływowej (Rycina 3) i testów obrazowania fluorescencyjnego (Rycina 4). Niższa żywotność m...

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie CLON-G do przedłużenia żywotności neutrofili do ponad 5 dni i zapewnia wiarygodną procedurę oceny śmierci neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.

Wydłużenie żywotności neutrofili za pomocą CLON-G i testu spontanicznej śmierci in vitro

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

Nasz protokół zapewnia pożywkę koktajlową, która przedłuża żywotność neutrofili do ponad pięciu dni bez uszczerbku dla funkcji neutrofili. Oferuje również niezawodną dializę in vitro dla neutrofili. Leczenie CLON-G rozszerza możliwości zachowania, transportu i manipulacji genami neutrofili, co może przyspieszyć badania w społeczności neutrofili.Na początek przygotuj podłoże podstawowe, dodając RPMI 1640 FBS i pen-strep do 50-mililitrowej probówki. W tym samym czasie rozmrozić wszystkie roztwory podstawowe składników CLON-G na lodzie. Następnie rozcieńczyć HSP 70 i 200 mikrogramów na mililitr G-CSF w pożywce podstawowej.Przenieś 976 mikrolitrów podłoża zasadowego do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Do tego dodać składniki CLON-G, aby przygotować jeden mililitr pożywki 2x CLON-G, jak opisano w manuskrypcie. Następnie przygotuj kulturę neutrofili, zawieszając izolowane neutrofile myszy w pożywce podstawowej.Dodać pożywkę CLON-G, a następnie pożywkę zasadową do 24-dołkowych płytek bez hodowli tkankowych. Następnie dodać 100 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórkowej i delikatnie pipetować trzy do czterech razy. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5%

neutrophil-lifespan-extension-with-clon-g-an-vitro-spontaneous-death

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym protokole przedstawiamy metodę pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych

Zastosowanie testu kolonogennego do oceny żywotności reprodukcyjnej jest uznane od ponad 50 lat. W niniejszym materiale przedstawiamy ogólną procedurę przeprowadzania testu kolonogennego z wykorzystaniem komórek adherentnych.

Test klonogenny: komórki adherentne

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Opisujemy tutaj metodę uzyskiwania i identyfikowania nowo scharakteryzowanej subpopulacji gigantycznych fagocytów pochodzących z neutrofili. Komórki te rozwijają się w hodowli ze świeżych neutrofili ludzkiej krwi i charakteryzują się fagocytozą, autofagią, niezwykle dużymi rozmiarami i wydłużoną żywotnością. Metoda ta jest niezbędna do dalszego badania tej unikalnej subpopulacji pochodzącej z neutrofili.

Opracowanie i identyfikacja nowej subpopulacji ludzkich fagocytów olbrzymich pochodzących z neutrofili in vitro

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Ten protokół opisuje, jak używać metody analitycznej MEDUSA do ilościowego określenia efektu regulacji śmierci każdego nokautu genu. Zawiera instrukcje dotyczące określania warunków eksperymentalnych, które optymalizują czułość, oraz samouczek krok po kroku dotyczący wykonywania analizy.

MEDUSA do identyfikacji genów regulujących śmierć w danych z profilowania chemogenetycznego

Ten protokół zapewnia prostą, niedrogą procedurę ilościowego określania wskaźnika śmiertelności zarodkowej u Caenorhabditis elegans. Umożliwia bezpośrednie wykrywanie zaburzeń zarodkowych w populacjach bez specjalistycznego sprzętu lub doświadczenia w wybieraniu dżdżownic. Protokół może być stosowany do ilościowego określania wpływu mutacji genetycznych, wyciszenia genów za pośrednictwem interferencji RNA i diety.

Określanie wskaźnika śmiertelności embrionalnej u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę wydłużenia żywotności neutrofili za pomocą medium CLON-G do ponad pięciu dni z zachowaniem funkcjonalności. Protokół umożliwia analizę cytometrią przepływową i mikroskopią fluorescencyjną.

Wydłużenie żywotności neutrofili za pomocą CLON-G i testu spontanicznej śmierci in vitro

Przeglądaj więcej filmów