Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Jest to pierwszy protokół pozwalający na różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu o dobrych właściwościach barierowych, dojrzałych połączeniach ścisłych i ekspresji cząsteczek adhezyjnych komórek śródbłonka pośredniczących w migracji komórek odpornościowych do centralnego układu nowicjusza. Komórki podobne do EECM-BMEC pozwalają badać migrację komórek odpornościowych przez barierę krew-mózg za pomocą modeli bariery krew-mózg pochodzących od pacjentów w sposób w pełni autologiczny. Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym w komórki podobne do EECM-BMEC pozwoliło nam zidentyfikować wewnętrzne defekty bariery w tych modelach in vitro pacjentów ze stwardnieniem rozsianym.

Ta metoda hodowlana pozwoli nam zatem w przyszłości zidentyfikować szlaki molekularne leżące u podstaw tych zaburzonych właściwości barierowych. Metody te mogą być stosowane w szerszym spektrum chorób, w których morfologia surowicy i infiltracja komórek odpornościowych do OUN mają kluczowe znaczenie dla tych patogenez, na przykład udar mózgu lub neuroinfekcja. Próbując tej techniki po raz pierwszy, użyj tej samej ilości materiałów komórkowych.

Gęstość wysiewu jest kluczem do sukcesu tego protokołu i musi być dostosowana w zależności od użytych klonów. Procedurę zademonstruje Kinya Matsuo, adiunkt z mojego laboratorium. W piątym dniu hodowli komórek progenitorowych śródbłonka odessać pożywkę ze studzienek i dodać jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego do każdej studzienki.

Inkubuj płytkę przez sześć do ośmiu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą mikropipety zdysocjuj i ponumeruj komórki. Następnie przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, aby przefiltrować do 50-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów pożywki DMEM/F-12 10.

Aby zatrzymać reakcję trawienia, dodaj pożywkę DM DMEM/F-12 10 do oznaczenia 50 mililitrów. Dokładnie odpipetować i zarezerwować 10 mikrolitrów do policzenia komórek. Odwiruj 50-mililitrową probówkę o masie 200 g przez pięć minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza, aby otoczyć komórki.

Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 mililitrami pożywki DMEM/F-12 10. Przenieś zawiesinę komórek do świeżej 15-mililitrowej probówki. Wirować przy 200 g przez pięć minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza, aby ponownie zagnieździć komórki.

Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w pierwszym buforze przepływowym. Następnie dodać odczynnik blokujący FCR w stosunku jeden do 100 i inkubować przez pięć minut. Następnie dodaj rozcieńczony izotiocyjanian fluoresceiny w stosunku jeden do 200 lub przeciwciało CD31 znakowane FITC.

Inkubować zawiesinę przez 30 minut w ciemności w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 10 mililitrów pierwszego buforu przepływowego do próbki i zarezerwować 10 mikrolitrów zawiesiny do analizy cytometrii przepływowej w celu określenia frakcji komórek CD31-dodatnich. Odwirować komórki o masie 200 g przez pięć minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu przepływowego jednego roztworu. Następnie dodaj pięć mikrolitrów koktajlu selekcyjnego FITC na 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej. Dokładnie wymieszać roztwór, pipetując i inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów nanocząstek magnetycznych na 100 mikrolitrów zawiesiny komórek. Dobrze odpipetować mieszaninę i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Przenieś zawiesinę komórek do pięciomililitrowej rurki cytometrii przepływowej i dodaj jeden bufor przepływowy, aby uzyskać całkowitą objętość 2,5 mililitra.

Następnie umieść rurkę cytometrii przepływowej w magnesie na pięć minut. W ciągłym ruchu odwróć magnes i zdekantuj zawiesinę komórek zawierającą nieznakowane komórki przeciwciała FITC CD31. Utrzymuj magnes i rurkę w pozycji odwróconej przez dwie do trzech sekund, a następnie usuń pozostały płyn.

Zassać wszelkie kropelki na krawędzi rurki przed przywróceniem rurki do pozycji pionowej. Wyjmij rurkę cytometrii przepływowej z magnesu i dodaj 2,5 mililitra pierwszego bufora przepływowego, aby umyć pozostałe komórki dodatnie CD31. Delikatnie odpipetuj komórki w górę i w dół dwa lub trzy razy, aby je ponownie zawiesić.

Następnie umieść rurkę przepływową w magnesie na pięć minut. Powtórz mycie co najmniej cztery razy, aby usunąć nieoznakowane komórki FITC CD31 z probówki. Wyjmij rurkę przepływową z magnesu i ponownie zawieś oczyszczone dodatnie ogniwa CD31 z żądaną ilością odpowiedniego medium.

Zarezerwować dwie 10-mikrolitrowe podwielokrotności zawiesiny, jedną do zliczania komórek, a drugą do przeprowadzenia analizy cytometrii przepływowej w celu oceny czystości komórek CD31 dodatnich w próbkach do sortowania komórek aktywowanych po aktywacji magnetycznej. Usunąć pożywkę HECSR z sześciu płytek dołkowych zawierających populacje komórek śródbłonka i nieśródbłonka. Następnie dodaj jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego do każdej studzienki.

Uważnie obserwuj morfologię komórki pod mikroskopem. Kiedy komórki śródbłonka wydają się jasne i okrągłe, zwykle w ciągu dwóch do pięciu minut, odłącz je, stukając w krawędź płytki. Komórki nieśródbłonkowe pozostają przyczepione do płytki.

Za pomocą mikropipety ostrożnie zebrać oderwane komórki śródbłonka, nie naruszając komórek nieśródbłonka i przenieść je do 15 mililitrów lub 50 mililitrów probówki wirówkowej zawierającej cztery mililitry DMEM/F-12 10 na mililitr odczynnika dysocjacyjnego. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki HECSR do studzienek zawierających pozostałe przyłączone komórki nieśródbłonkowe, aby ustalić komórki przypominające mięśnie gładkie lub SMLC i umieść płytkę w inkubatorze. Przenieść zawiesinę komórek śródbłonka do probówki wirówkowej.

Dokładnie wymieszać i zachować 10 mikrolitrów zawiesiny do liczenia komórek. Odwirować pozostałe komórki w temperaturze 200 g przez pięć minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki HECSR.

Następnie usuń kolagen do roztworu z wcześniej przygotowanej płytki sześciodołkowej kodowanej kolagenem i dodaj dwa mililitry zawiesiny komórek śródbłonka do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Barwienie immunofluorescencyjne cząsteczek połączeń komórkowych podobnych do EECM-BMEC, w tym klaudyny-5, okludyny i kadheryny VE, zastosowano do oceny morfologii komórek oraz obecności połączeń ciągłych i dojrzałych.

Stymulacja komórek podobnych do EECM-BMEC wysiewanych na szkiełkach komorowych cytokinami prozapalnymi, takimi jak czynnik martwicy nowotworu alfa i interferon gamma rozcieńczone w pożywce kondycjonowanej SMLC, zwiększała ekspresję cząsteczek adhezyjnych, takich jak ICAM-1 i VCAM-1. Reprezentatywne obrazy markerów komórek mięśni gładkich, w tym aktyny mięśni gładkich alfa, kalponiny i białka mięśni gładkich 22 alfa, pokazano tutaj. Stymulacja komórek podobnych do EECM-BMEC cytokinami prozapalnymi, takimi jak czynnik martwicy nowotworu alfa i interferon gamma, regulowała ekspresję na powierzchni komórki kilku cząsteczek adhezyjnych, w tym ICAM-1, VCAM-1 i selektyny P.

Co więcej, stymulacja cytokinami zapalnymi również zwiększała ekspresję cząsteczek adhezyjnych śródbłonka i promowała zwiększoną liczbę komórek odpornościowych, które przylegały do monowarstw komórkowych podobnych do EECM-BMEC. Komórki podobne do EECM-BMEC są również obiecujące dla dogłębnego zrozumienia mechanizmów patofizjologicznych na poziomie bariery krew-mózg oraz jako cenne narzędzie do opracowania nowego celu terapeutycznego dla stabilizacji bariery krew-mózg