Name: Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę różnicowania komórek iPSC do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu z wykorzystaniem EECM. Ta technika umożliwia badanie migracji komórek immunologicznych przez barierę krew-mózg.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HN był wspierany przez Uehara Memorial Foundation, ECTRIMS Postdoctoral Research Exchange Fellowship, JSPS w ramach Wspólnego Programu Badawczego realizowanego we współpracy z SNSF (JRPs) Grant No. Grant JPJSJRP20221507 i KAKENHI nr 22K15711, program JST FOREST (numer grantu JPMJFR2269, Japonia), grant Fundacji YOKOYAMA na rzecz Farmakologii Klinicznej nr YRY-2217, FUNDACJA ICHIRO KANEHARA, Fundacja Badań Neurologicznych Narishige, Fundacja NOVARTIS (Japonia) na rzecz Promocji Nauki oraz FUNDUSZ UNIWERSYTECKI YAMAGUCHI. BE było wspierane przez Szwajcarskie Towarzystwo Stwardnienia Rozsianego i Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (granty 310030_189080 i ZLJZ3_214086) oraz grant Strategicznego Japońsko-Szwajcarskiego Programu Nauki i Technologii (SJSSTP) IZLJZ3_214086.

<ol><li>Castro Dias, M., Mapunda, J. A., Vladymyrov, M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+junctional+complexes+of+endothelial%2C+epithelial+and+glial+brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structure and junctional complexes of endothelial, epithelial and glial brain barriers.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5372(2019).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li>
<li>Marchetti, L., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+trafficking+across+the+blood-brain+barrier+in+the+absence+and+presence+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immune cell trafficking across the blood-brain barrier in the absence and presence of neuroinflammation.</a> Vascular Biology. 2 (1), H1-H18 (2020).</li>
<li>Yang, C., Hawkins, K. E., Dore, S., Candelario-Jalil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+mechanisms+of+blood-brain+barrier+damage+in+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 316 (2), C135-C153 (2019).</li>
<li>Nishihara, H., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers+and+multiple+sclerosis%3A+novel+treatment+approaches+from+a+brain+barriers+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers and multiple sclerosis: novel treatment approaches from a brain barriers perspective.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 273, 295-329 (2020).</li>
<li>Pan, Y., Nicolazzo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+blood-brain+barrier+and+blood-spinal+cord+barrier+dynamics+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+Impact+on+medication+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Altered blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier dynamics in amyotrophic lateral sclerosis: Impact on medication efficacy and safety.</a> British Journal of Pharmacology. 179 (11), 2577-2588 (2022).</li>
<li>Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+Alzheimer+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).</li>
<li>Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+pathology+in+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+disease%3A+implications+for+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy.</a> Cell Transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).</li>
<li>Song, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+comparison+of+human+and+mouse+brain+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels.</a> Scientific Reports. 10 (1), 12358(2020).</li>
<li>Lecuyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+ALCAM+in+neuroinflammation+and+blood-brain+barrier+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dual role of ALCAM in neuroinflammation and blood-brain barrier homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (4), E524-E533 (2017).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>DeStefano, J. G., Jamieson, J. J., Linville, R. M., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+in+vitro+tissue-engineered+blood-brain+barrier+models%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Benchmarking in vitro tissue-engineered blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 32(2018).</li>
<li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), e99733(2014).</li>
<li>Hollmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 9(2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li>
<li>Praca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+brain+capillary-like+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Derivation of brain capillary-like endothelial cells from human pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 599-611 (2019).</li>
<li>Al-Ahmad, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+expression+and+activity+of+glucose+transporters+between+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+and+hCMEC%2FD3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of expression and activity of glucose transporters between stem cell-derived brain microvascular endothelial cells and hCMEC/D3 cells.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 313 (4), C421-C429 (2017).</li>
<li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isogenic+neurovascular+unit+model+comprised+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells%2C+pericytes%2C+astrocytes%2C+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">An isogenic neurovascular unit model comprised of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, and neurons.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 25(2019).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+for+studying+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions.</a> The FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).</li>
<li>Lu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+epithelium+misidentified+as+brain+microvascular+endothelium+requires+ETS+factors+to+acquire+vascular+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived epithelium misidentified as brain microvascular endothelium requires ETS factors to acquire vascular fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (8), e2016950118(2021).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-purified+rat+brain+microvascular+endothelial+cell+cultures+exhibit+improved+barrier+properties+in+response+to+glucocorticoid+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction.</a> Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).</li>
<li>Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crawl%2C+cross%3A+the+T+cell+code+to+breach+the+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers.</a> Trends in Immunology. 33 (12), 579-589 (2012).</li>
<li>Duband, J. L., Gimona, M., Scatena, M., Sartore, S., Small, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calponin+and+SM+22+as+differentiation+markers+of+smooth+muscle%3A+spatiotemporal+distribution+during+avian+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Calponin and SM 22 as differentiation markers of smooth muscle: spatiotemporal distribution during avian embryonic development.</a> Differentiation. 55 (1), 1-11 (1993).</li>
<li>Gastfriend, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+mediates+acquisition+of+blood-brain+barrier+properties+in+na%C3%AFve+endothelium+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling mediates acquisition of blood-brain barrier properties in naïve endothelium derived from human pluripotent stem cells.</a> eLife. 10, e70992(2021).</li>
<li>Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+expression+of+E-+and+P-selectins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo.</a> Circulation Research. 79 (3), 560-569 (1996).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+blood-brain+barrier+dysfunction+contributes+to+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).</li>
</ol>

BE otrzymało grant od firmy Biogen na badania nad rozszerzonym dawkowaniem natalizumabu w celu wpływu na migrację limfocytów T przez barierę krew-mózg oraz grant od CSL Behring na zbadanie molekularnych podstaw dysfunkcji bariery krew-mózg w zaburzeniach neurologicznych. HN i BE są wynalazcami tymczasowych amerykańskich zgłoszeń patentowych związanych z ogniwami podobnymi do EECM-BMEC (63/084980 i 63/185815).

Punkty krytyczne i rozwiązywanie problemów Przed rozpoczęciem różnicowania EPC badacze powinni upewnić się, że w hodowlach hiPSC nie wystąpiły żadne spontaniczne zdarzenia różnicowania komórek. Brak spontanicznie różnicujących się komórek i zastosowanie czystych kolonii hiPSC ma kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników. Gęstość wysiewu hiPSC w dniu -3 jest ważna dla uzyskania wysokiej czystości EPC CD31+ po MACS. Gęstość wysiewu dla każdej linii hiPSC i każdego przejścia może wymagać optymalizacji. W zależności od linii hiPSC i liczby przejścia, gęstość wysiewu może wynosić od 75 x 103 do 400 x 103 hiPSC na studzienkę płytki 12-dołkowej (20-100 x 103/cm2). Minimalnym punktem kontrolnym zagęszczenia hiPSC jest gęstość komórek w dniu 2. HiPSC powinny osiągnąć 100% zbieżność najpóźniej do dnia 2. Jeśli hiPSC nie zlewają się do dnia 2, czystość EPC CD31 + po MACS będzie zwykle dość niska. W takim przypadku można zwiększyć gęstość wysiewu hiPSC. Jeśli duża liczba różnicujących się komórek oderwie się od płytki około 3 do 5 dnia, początkowa gęstość wysiewu hiPSC może zostać zmniejszona. Z naszego doświadczenia wynika, że CHIR99021 7-8 μM jest optymalnym stężeniem dla zastosowanych tutaj linii hiPSC, ale stężenie może wymagać optymalizacji dla innych linii hiPSC, które mogą inaczej reagować na leczenie inhibitorem. Czystość CD31+ EPC powinna być potwierdzona przed i po MACS. Przed kontynuacją MACS wstępnie posortowana mieszanina komórek powinna składać się z >10% komórek CD31+ . Procent komórek CD31 + wynoszący <6% zwykle powoduje <80% EPC po MACS. W tej sytuacji konieczna jest optymalizacja początkowej gęstości wysiewu i/lub zagęszczenia CHIR99021.
Dla udanego selektywnego pasażowania i generowania czystych monowarstw EC, czystość EPC CD31+ po MACS ma kluczowe znaczenie. Jeśli czystość po MACS wynosi <90%, zaleca się jedno lub dwa dodatkowe prania (kroki 1.4.11-1.4.12). Idealnie, czystość po MACS powinna wynosić >95%. Gęstość wysiewu EPC na płytkach pokrytych kolagenem powinna być zoptymalizowana zgodnie z linią hiPSC, aby osiągnąć 100% zbieżność w ciągu 3-7 dni. Czekanie, aż EC będą w 100% zlewne, zwykle prowadzi do pomyślnego selektywnego przejścia. Jednak nawet w przypadku w 100% zlewających się EC SMLC niektórych linii hiPSC również odłączają się wcześnie. W takim przypadku skuteczne może być selektywne pasażowanie przy niższym zbieganiu (np. ≤80%). Jeśli niektóre SMLC odczepią się wcześniej niż EC, EC często nie mogą zostać uratowane z mieszanej populacji EC-SMLC. W takim przypadku pomocne może być skrócenie czasu aktywacji odczynnika dysocjacyjnego w pasażujących EC i powtarzającym się selektywnym pasażowaniu. Użycie komercyjnego odczynnika dysocjacyjnego zamiast trypsyny jako odczynnika dysocjacyjnego jest korzystne dla selektywnego pasażowania, ponieważ trypsyna nie pozwala na oddzielne odłączenie EC i SMLC. Nasze testy przepuszczalności z wykorzystaniem znaczników małocząsteczkowych oraz testowanie poziomów ekspresji cząsteczek ścisłych i adhezyjnych wskazują, że EPC, komórki podobne do EECM-BMEC i SMLC mogą być przechowywane w ciekłym azocie przez co najmniej 2 lata.
Znaczenie i ograniczenia metody Metoda różnicuje CD31+ EPC od hiPSC poprzez zastosowanie chemicznych inhibitorów GSK-3 do aktywacji sygnalizacji Wnt / β-kateniny. Po pozytywnej selekcji CD31 + EPC przez MACS, EPC są hodowane w określonym podłożu śródbłonkowym, które sprzyja różnicowaniu się w mieszane populacje śródbłonka i SMLC. Selektywne pasażowanie tych mieszanych populacji o różnych właściwościach adhezyjnych pozwala na oddzielenie EC od SMLC. Po jednym lub dwóch pasażach komórki podobne do EECM-BMEC wykazują właściwości barierowe i ekspresję cząsteczek adhezyjnych śródbłonka, które przypominają te z pierwotnych ludzkich BMEC. Jednoczesna hodowla z SMLC lub ich supernatantami indukuje indukowaną cytokiną ekspresję VCAM-1.
In vivo BBB utrzymuje homeostazę OUN poprzez ustanowienie niskiej przepuszczalności cząsteczki w warstwie przykomórkowej i transkomórkowej, poprzez transport składników odżywczych przez specyficzne transportery i kontrolę transportu komórek odpornościowych do OUN. Do badań bariery krew-mózg niezbędny jest odpowiedni model, który wyświetla odpowiednie cząsteczki i funkcje, które są przedmiotem zainteresowania. Produkcja komórek podobnych do EECM-BMEC przy użyciu zdefiniowanych odczynników i próbek od pacjentów lub osób zdrowych zapewnia skalowalny model ludzkiej bariery krew-mózg. Zalety modelu wykorzystującego komórki podobne do EECM-BMEC w porównaniu z innymi modelami BBB to: 1) morfologia i profil transkryptomu śródbłonka30, który przypomina pierwotny ludzki BMEC; 2) obecność dojrzałych połączeń ścisłych; 3) pożądane właściwości barierowe; oraz 4) silna ekspresja cząsteczek adhezyjnych śródbłonka, w tym ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, selektyny E i P, CD99, cząsteczki adhezyjnej komórek czerniaka (MCAM) i aktywowanej cząsteczki adhezji komórek leukocytów (ALCAM)22. W związku z tym model ten jest szczególnie przydatny do badania interakcji między komórkami odpornościowymi a BMEC. Chociaż przepuszczalność znaczników małocząsteczkowych jest wyższa dla komórek podobnych do EECM-BMEC niż wcześniej zgłaszana dla komórek podobnych do BMECpochodzących z iPSC 14,15, właściwości barierowe dość dobrze wypadają w porównaniu z tymi opisanymi dla pierwotnych ludzkich BMEC. To podobieństwo wskazuje, że komórki podobne do EECM-BMEC mogą być dobrym modelem BBB in vitro. Ekspresja selektyny E na komórkach podobnych do EECM-BMEC w warunkach fizjologicznych musi być brana pod uwagę przy użyciu tego modelu do badania niezapalnych barier krew-mózg, które nie mają konstytutywnej ekspresji selektyny E in vivo31. W naszym poprzednim badaniu wykazaliśmy, że komórki podobne do EECM-BMEC mogą fenokopować barierę krew-mózg, jak obserwowano w mózgach pacjentów ze stwardnieniem rozsianym w odniesieniu do zakłóconych połączeń ścisłych. Powoduje to większą przepuszczalność małych cząsteczek i zwiększoną ekspresję funkcjonalnej cząsteczki adhezyjnej, pośredniczącej w zwiększonej adhezji i transmigracji komórek odpornościowych przez komórki podobne do BMEC32. Ponadto wykazaliśmy, że aktywacja sygnalizacji Wnt / β-kateniny może złagodzić przerwanie połączeń ścisłych i zwiększoną ekspresję VCAM-1 w komórkach podobnych do EECM-BMEC pochodzących z MS32. Wyniki te wskazują, że model jest rzeczywiście przydatny do badania roli bariery krew-mózg w chorobach neuroimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane.
Podsumowując, komórki podobne do EECM-BMEC są obiecującym narzędziem do dogłębnego zrozumienia mechanizmów patofizjologicznych na poziomie bariery krew-mózg oraz jako narzędzie do opracowania nowych celów terapeutycznych dla stabilizacji bariery krew-mózg. W przyszłości model może zostać zastosowany do badania dysfunkcji bariery krew-mózg w szerszym spektrum chorób i może otworzyć drogę do nowatorskich podejść terapeutycznych.

Jednostka nerwowo-naczyniowa (NVU) w centralnym układzie nerwowym (OUN) składa się z wysoce wyspecjalizowanych komórek śródbłonka mikronaczyniowego (ECs), perycytów osadzonych w błonie podstawnej śródbłonka, jak również błony podstawnej miąższu i stóp końcowych astrocytów1. W obrębie NVU komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są kluczowymi elementami tworzącymi barierę krew-mózg (BBB). BMEC tworzą złożone i ciągłe połączenia ścisłe i mają wyjątkowo niską aktywność pinocytotyczną w porównaniu z mikronaczyniowymi EC w narządach obwodowych, co pozwala BBB hamować wolną parakomórkową dyfuzję cząsteczek rozpuszczalnych w wodzie do OUN. Ekspresja specyficznych transporterów napływu i pomp odpływowych przez BMEC zapewnia pobieranie i eksport składników odżywczych i szkodliwych cząsteczek, odpowiednio, z klasy CNS2. Ponadto bariera krew-mózg ściśle kontroluje wnikanie komórek odpornościowych do OUN poprzez ekspresję niskich poziomów cząsteczek adhezyjnych śródbłonka, kluczowych dla transportu komórek odpornościowych do CNS3. W warunkach fizjologicznych poziomy ekspresji cząsteczek adhezyjnych na powierzchni BMEC, takich jak cząsteczka adhezji międzykomórkowej-1 (ICAM-1) i cząsteczka adhezji komórek naczyniowych-1 (VCAM-1), są niskie, ale poziomy te wzrastają w niektórych zaburzeniach neurologicznych2. Rozkład morfologiczny i funkcjonalny bariery krew-mózg występuje w wielu chorobach neurologicznych, takich jak udar mózgu4, stwardnienie rozsiane (MS)5 i kilka chorób neurodegeneracyjnych6,7,8. Szczegółowe badania charakterystyki komórkowej i molekularnej BMEC zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych są podejściem do identyfikacji nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na barierę krew-mózg.
Do niedawna do badania BBB używano podstawowych lub nieśmiertelnych BMEC ludzi i gryzoni. Nie jest jednak jasne, czy wnioski oparte na zwierzęcych modelach BBB można łatwo zastosować do ludzkiego BBB, ponieważ ekspresja kilku ważnych cząsteczek, w tym cząsteczek adhezyjnych i rozpuszczonych białek nośnikowych, różni się między ludźmi a gryzoniami9,10. Chociaż ludzkie linie BMEC, takie jak hCMEC/D3, wyrażają odpowiednie poziomy cząsteczek adhezyjnych11, te unieśmiertelnione BMEC na ogół nie mają skomplikowanych ścisłych połączeń i solidnych właściwości barierowych12. Podstawowe ludzkie BMEC są przydatne do badania funkcji barierowych13, ale nie są łatwo dostępne dla wszystkich badaczy. Co więcej, pierwotne BMEC od pacjentów mogą być trudne do uzyskania, ponieważ muszą być one pobrane za pomocą biopsji mózgu lub operacji, która jest wykonywana tylko w określonych warunkach klinicznych.
Ostatnie postępy w technologii komórek macierzystych umożliwiły różnicowanie różnych typów komórek ludzkich, wynikających ze źródeł komórek macierzystych, takich jak ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC). Modele pochodzące z hiPSC pozwalają nam ustalić modele patofizjologiczne przy użyciu próbek pochodzących od pacjenta. Kilka typów komórek pochodzących z hiPSC można połączyć w celu stworzenia autologicznych kokultur lub organoidów, które lepiej naśladują warunki fizjologiczne. Kilka powszechnie stosowanych protokołów14,15,16,17,18,19 mogą być używane do różnicowania komórek podobnych do BMEC pochodzących z hiPSC, które mają silne właściwości bariery dyfuzyjnej z ekspresją transporterów specyficznych dla BBB i pomp wypływowych, i są przydatne do badania parakomórkowej dyfuzji małych Molekuły, mechanizmy transportu molekularnego i dostarczanie leków do mózgu20,21. Jednak wcześniejsze badania wykazały, że szeroko stosowane komórki podobne do BMEC pochodzące z hiPSC nie mają ekspresji kluczowych cząsteczek adhezyjnych śródbłonka, w tym VCAM-1, selektyn i ICAM-2, które są odpowiedzialne za pośredniczenie w interakcjach między komórkami odpornościowymi a klasą BBB22. Ponadto doniesiono, że poprzednie BMEC pochodzące z hiPSC wykazują mieszane cechy śródbłonka i nabłonka na poziomie transkrypcji23. W związku z tym opracowaliśmy metodę rozszerzonej hodowli komórek śródbłonka (EECM), nowatorski protokół, który umożliwia różnicowanie hiPSC w komórki podobne do BMEC, które przypominają pierwotne ludzkie BMEC pod względem morfologii, charakterystyki bariery i ekspresji cząsteczki adhezyjnej śródbłonka. Protokół ten opisuje szczegółowe procedury metodologiczne różnicowania hiPSC do komórek podobnych do BMEC wykazujących dojrzały fenotyp immunologiczny.

<table><tbody><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,22 mm</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówka wirówkowa</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Sitko do komórek Falcon</td><td></td><td>Falcon 352340</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Probówka okrągłodenna</td><td>SPL</td><td>40005</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa, okrągłodenna</td><td>SPL</td><td>34096</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr>Zaawansowany mikroskop fluorescencyjny <td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>All-in-One</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement (503), bez surowicy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), 7,5% w dPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Bufor rozcieńczający CellAdhere</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>ST-07183</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komorowe</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1263</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV z ludzkiego łożyska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych Corning (12-dołkowe)</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych Corning (6-dołkowe)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Wewnętrzna nasadka do probówki kriogenicznej 2,0 ml</td><td>Watson</td><td>1396-201S</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO), sterylny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (13), [+] 4,5 g/L D-glukozy, [-] L-glutamina, [-] pirogronian</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s d) PBS (bez wapnia, magnezu)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s zmodyfikowany Orzeł" s mieszanina pożywki i składników odżywczych F-12 (DMEM-F12)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pozytywnej selekcji EasySepFITC II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18558</td><td></td></tr><tr><td>EasySepMagnet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego0,02% w DPBS</td><td>Sigma</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z osocza bydlęcego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Oprogramowanie Sigma-Aldrich</td><td>GE17144002</td><td></td></tr><tr><td>FIJI (wersja 2.0.0)</td><td>Obraz J, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo wersja10</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Surowica śródbłonka ludzkiego Free Medium (hESFM)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2)</td><td>Tocris</td><td>233-FB-500</td><td></td></tr><tr><td>iPS ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste</td><td>Riken RBC</td><td>HPS1006</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny (100x)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15160-047</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwinimagnezowa hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (1003)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, obniżony czynnik wzrostu</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (1003)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus-cGMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>ST-100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny zestaw mTeSR1 (podłoże podstawowe plus suplement 53)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Millipore</td><td>104005</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko IFN-gamma</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko IL-2</td><td>BD Biosciences</td><td>554603</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko TNF-alfa</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-020</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>FEATHER</td><td>2975-11</td><td></td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone</td><td>BD Biosciences</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Sód pirogronian</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>- Transwells - Membrana PC, 0,4 mm, 12 mm,</td><td>Corning</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>078180</td><td></td></tr><tr><td>Woda, sterylna, hodowla</td> <td>komórkowaSigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Brain Microvascular Endothelial Cell-Like Cells with a Mature Immune Phenotype

Dysfunkcja bariery krew-mózg (BBB) jest patologicznym znakiem rozpoznawczym wielu chorób neurodegeneracyjnych i neurozapalnych wpływających na ośrodkowy układ nerwowy (OUN). Ze względu na ograniczony dostęp do próbek BBB związanych z chorobą, nadal nie wiadomo dokładnie, czy nieprawidłowe funkcjonowanie bariery krew-mózg jest przyczyną rozwoju choroby, czy raczej konsekwencją procesu neurozapalnego lub neurodegeneracyjnego. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) stanowią zatem nową okazję do stworzenia modeli BBB in vitro od zdrowych dawców i pacjentów, a tym samym do zbadania specyficznych dla choroby cech bariery krew-mózg u poszczególnych pacjentów. Ustalono kilka protokołów różnicowania w celu uzyskania komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC) z hiPSC. Rozważenie konkretnego pytania badawczego jest niezbędne do prawidłowego wyboru odpowiedniego protokołu różnicowania BMEC. W tym miejscu opisujemy metodę rozszerzonej hodowli komórek śródbłonka (EECM), która jest zoptymalizowana pod kątem różnicowania hiPSC w komórki podobne do BMEC o dojrzałym fenotypie immunologicznym, co pozwala na badanie interakcji komórka odpornościowa - BBB. W tym protokole hiPSC są najpierw różnicowane w śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) poprzez aktywację sygnalizacji Wnt / β-kateniny. Otrzymana hodowla, która zawiera komórki przypominające mięśnie gładkie (SMLC), jest następnie sekwencyjnie pasażowana w celu zwiększenia czystości komórek śródbłonka (EC) i wywołania właściwości specyficznych dla bariery krew-mózg. Jednoczesna hodowla EECM-BMEC z tymi SMLC lub kondycjonowaną pożywką z SMLC pozwala na odtwarzalną, konstytutywną i regulowaną cytokiną ekspresję cząsteczek adhezyjnych EC. Co ważne, komórki podobne do EECM-BMEC mają właściwości barierowe porównywalne z pierwotnymi ludzkimi BMEC, a ze względu na ekspresję wszystkich cząsteczek adhezyjnych EC, komórki podobne do EECM-BMEC różnią się od innych modeli BBB pochodzących z hiPSC in vitro. Komórki podobne do EECM-BMEC są zatem modelem z wyboru do badania potencjalnego wpływu procesów chorobowych na poziomie bariery krew-mózg, z wpływem na interakcję komórek odpornościowych w spersonalizowany sposób.

Test przepuszczalności 
Przepuszczalność fluoresceiny sodowej obliczono poprzez pomiar intensywności fluorescencji medium pobranego z dolnej komory w 15, 30, 45 i 60 min. W każdym punkcie czasowym pobierano łącznie 150 µL medium, a brakującą objętość 150 µL uzupełniano medium hECSR. Intensywność fluorescencji odczytywano za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek (pobudzenie 485 nm/emisja 530 nm), a poprawne sygnały, objętości klirensu i przepuszczalności obliczono zgodnie z wcześniej opisanym wzorem18 (Tabela 2). Zaleca się potwierdzenie, czy intensywność fluorescencji fluoresceiny sodowej wzrasta w czasie. W celu zapewnienia powtarzalności w jednym teście należy użyć wielu filtrów – co najmniej w trzech powtórzeniach. Dla komórek typu EECM-BMEC pochodzących od zdrowej kontroli przepuszczalność fluoresceiny sodowej (376 Da) powinna być niższa niż 0,3 x 10-3 cm/min. Aby potwierdzić utworzenie konfluentnej warstwy komórek typu EECM-BMEC, po zakończeniu tego testu należy przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne białek połączeń komórkowych dla komórek typu EECM-BMEC na każdym filtrze wykorzystanym w testach przepuszczalności.
Barwienie immunofluorescencyjne 
Barwienie immunofluorescencyjne cząsteczek połączeń komórkowych w komórkach przypominających BMEC pochodzących z EECM, w tym klaudyny-5, okludyny i VE-kadheryny1wykorzystano do oceny morfologii komórek oraz obecności ciągłych i dojrzałych połączeń (Rycina 4). Monowarstwy komórek typu EECM-BMEC na membranach wkładów filtrujących utrwalono zimnym metanolem (-20 °C) przez 20 s, zablokowano buforem blokującym (Tabela 1), a następnie inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Komórki typu EECM-BMEC wykazywały wrzecionowaty kształt oraz zygzakowate połączenia, co stanowi charakterystyczne cechy morfologiczne BMEC.27Stymulacja komórek typu EECM-BMEC wysianych na szkiełkach komorowych cytokinami prozapalnymi, takimi jak czynnik martwicy nowotworu-α (TNF-α) i interferon-γ (IFN-γ) (0,1 ng/mL TNF-α + 2 IU/mL IFN-γ) rozcieńczonych w pożywce warunkowanej pochodzącej z linii SMLC, spowodowała upregulację ekspresji cząsteczek adhezyjnych, takich jak ICAM-1 i VCAM-1.28 (Rysunek 5). Reprezentatywne obrazy markerów komórek mięśni gładkich, w tym α-aktyny mięśni gładkich (SMA), kalponiny oraz białka mięśni gładkich 22-alfa (SM22a)29są przedstawione w Rycina 6SMLC wysiane na szkiełku komorowym utrwalono 4% paraformaldehydem przez 10 min, zablokowano buforem blokującym, a następnie inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi.
Analiza cytometryczna ekspresji cząsteczek adhezyjnych powierzchni komórkowej w komórkach typu EECM-BMEC 
Reprezentatywne wyniki ekspresji powierzchniowej śródbłonkowych cząsteczek adhezyjnych w komórkach typu EECM-BMEC przedstawiono na Rysunku 7. Stymulacja cytokinami prozapalnymi, takimi jak TNF-α i INF-γ, zwiększyła ekspresję powierzchniową kilku cząsteczek adhezyjnych, w tym ICAM-1, VCAM-1 i P-selektyny. Hodowla komórek typu EECM-BMEC w medium warunkowanym przez SMLC zwiększyła powierzchniową ekspresję śródbłonkowego VCAM-1. Efekt indukcji powierzchniowej ekspresji VCAM-1 może różnić się w zależności od partii medium warunkowanego przez SMLC. Zaleca się przechowywanie kilku partii medium warunkowanego pobranego z SMLC pochodzących z tego samego źródła hiPSC podczas różnicowania SMLC, aby zweryfikować, która partia indukuje odpowiednią ekspresję VCAM-1.
Test adhezji komórek odpornościowych w warunkach statycznych 
Liczba przytwierdzonych komórek odpornościowych korelowała z poziomem ekspresji funkcjonalnych cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórek podobnych do EECM-BMEC. Stymulacja cytokinami zapalnymi zwiększyła ekspresję śródbłonkowych cząsteczek adhezyjnych i spowodowała wzrost liczby komórek odpornościowych przylegających do monowarstw komórek podobnych do EECM-BMEC (Rycina 8). Przeprowadzony eksperyment wykazał funkcjonalność cząsteczek adhezyjnych w komórkach podobnych do EECM-BMEC, co czyni ten model odpowiednim do badania oddziaływań między komórkami odpornościowymi a komórkami śródbłonka.
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające SSC i FSC dla sortowania komórek przed i po MACS z użyciem FITC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Oczyszczanie EC CD31+. Wykresy kropkowe reprezentatywnych danych z cytometrii przepływowej z bramkowania rozproszenia EC oraz barwienia populacji komórek przeciwko CD31 znakowanemu FITC przed (krok 1.4.7) i po (krok 1.4.14) MACS. MACS zwiększa czystość EPC CD31+ w populacji. Skróty: SSC = side scatter; FSC = forward scatter; FITC = fluorescein isothiocyanate; MACS = magnetic activated cell sorting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres objętości oczyszczania w funkcji czasu; równania dla Pe, 1/Pe; eksperyment filtracyjny; analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przepuszczalność monowarstwy EECM-BMEC (10-3 cm/min) obliczona na podstawie surowej intensywności fluorescencji fluoresceiny sodowej. Liniowy nachylenie objętości oczyszczania oblicza się za pomocą regresji liniowej dla każdego filtra (Rycina 3A). Przepuszczalność fluoresceiny sodowej oblicza się za pomocą dwóch wzorów (Rycina 3B). (A) Liniowe nachylenie objętości oczyszczania w funkcji czasu obliczono za pomocą regresji liniowej dla filtra 1 (mc1) oraz filtra kontrolnego (mf). mc1 i mf są odpowiednio współczynnikami Xc1 i Xf. (B) Wzór do obliczania przepuszczalności fluoresceiny (Pe) przy użyciu mc i mf (Wzór 1). Jednostki Pe przekształcono przy użyciu powierzchni filtra (Wzór 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii konfokalnej białek komórek śródbłonka: claudin-5, occludin, VE-cadherin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Komórki EECM-BMEC-like wykazują dojrzałe połączenia komórkowe. Barwienie immunofluorescencyjne na claudin-5, occludin lub VE-cadherin (czerwony) w komórkach EECM-BMEC-like hodowanych na membranach wkładów filtracyjnych. Jądra komórkowe zabarwiono przy użyciu 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (niebieski). Barwienie przeprowadzono na tych samych wkładach filtracyjnych, które wykorzystano w testach przepuszczalności. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza ekspresji ICAM-1 i VCAM-1, mikroskopia immunofluorescencyjna, komórki stymulowane i niestymulowane." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Ekspresja cząsteczek adhezyjnych śródbłonka w komórkach EECM-BMEC-like. Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono na komórkach EECM-BMEC-like hodowanych na membranach wkładów filtracyjnych w obecności CM pochodzącej z SMLC. Przedstawiono immunobarwienie dla ICAM-1 lub VCAM-1 (czerwony) dla niestymulowanych oraz stymulowanych 1 ng/mL TNF-α + 20 IU/mL IFN- γ komórek EECM-BMEC-like. Jądra barwiono DAPI (niebieski). Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej dla α-SMA, kalponiny i SM-22 w komórkach; filamenty aktynowe w kolorze czerwonym, jądra w kolorze niebieskim." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Charakterystyka SMLCs. Przedstawiono immunocytochemię α-aktyny mięśni gładkich (SMA), kalponiny lub białka mięśni gładkich 22-Alfa (SM22a) (kolor czerwony) dla SMLCs hodowanych na szkiełkach komorowych. Jądra zostały zabarwione DAPI (kolor niebieski). Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej pokazujące intensywność fluorescencji ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E-selektyny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Ekspresja cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórek śródbłonka w komórkach typu EECM-BMEC. Przedstawiono wyniki analizy cytometrii przepływowej ekspresji cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórek typu EECM-BMEC. Komórki typu EECM-BMEC hodowano z wykorzystaniem pożywki kondycjonowanej pochodzącej z SMLC. Niebieskie, czerwone i szare linie na nałożonych histogramach przedstawiają odpowiednio stan niestymulowany (NS), stan stymulowany 1 ng/mL TNF-α + 20 IU/mL IFN-γ oraz kontrolę izotypową. Oceńiono ekspresję powierzchniową śródbłonkowych cząsteczek adhezyjnych, w tym cząsteczki adhezji międzykomórkowej 1 (ICAM-1), ICAM-2, cząsteczki adhezji komórek naczyniowych 1 (VCAM-1), P-selektyny, E-selektyny, CD99 oraz cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka i płytek krwi-1 (PECAM-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie adhezji limfocytów T; obrazy mikroskopii fluorescencyjnej i analiza wykresu rozrzutu efektu TNFα+INFγ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Adhezja komórek odpornościowych do komórek EECM-BMEC-like. (A) Obrazy fluorescencyjnie znakowanych adherentnych komórek odpornościowych na monowarstwach komórek EECM-BMEC-like niestymulowanych (NS) oraz stymulowanych 0,1 ng/mL TNF-α + 2 IU/mL IFN-γ (TNF-α + IFN-γ). Obrazy odpowiadają środkom studzienek. Pasek skali = 50 µm. (B) Liczba fluorescencyjnie znakowanych komórek odpornościowych na monowarstwach niestymulowanych oraz stymulowanych TNF-α + IFN-γ komórek EECM-BMEC-like. Liczba adherentnych komórek odpornościowych na pola widzenia (FOV) została policzona automatycznie przy użyciu oprogramowania FIJI. Kropki reprezentują liczbę przyłączonych limfocytów T. Słupki przedstawiają wartość średnią, a słupki błędów odchylenie standardowe (SD) z ośmiu prób. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Szczegóły dotyczące konkretnych odczynników do analiz. Opisano nazwy i dokładne ilości składników dla każdego konkretnego odczynnika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/Table1_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Przykład surowych danych z fluorescencyjnego czytnika płytek do obliczeń Pe. Liczby zapisane pogrubioną czcionką to surowa intensywność fluorescencji fluoresceiny sodowej zmierzona czytnikiem płytek. Aby dokładnie przeanalizować dane, konieczne jest usunięcie sygnału tła z wartości surowych oraz uwzględnienie wszelkich strat sygnału wynikających z pobierania próbek z dolnej komory, a następnie skorygowanie sygnału. Na przykład, po odjęciu tła, próbka z 15 min wykazuje sygnał wynoszący 100 względnych jednostek fluorescencji (RFU), a próbka z 30 min wykazuje sygnał 150 RFU. Skorygowany sygnał w 30 min wynosi (150 RFU + brakujące wartości w 15 min [100 RFU x 150 µL/1,500 µL]), co daje 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU. Objętość klirensu = (1,500 x [SB,t])/(ST,60 min), gdzie 1,500 to objętość dolnej komory (1,500 µL), SB,t to skorygowany sygnał w czasie t, a ST,60 min to sygnał górnej komory w 60 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/Table2_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj opisujemy protokół, rozszerzoną metodę hodowli komórek śródbłonka (EECM), która umożliwia różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC). Komórki te wykazują ekspresję cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka, a zatem są modelem bariery krew-mózg odpowiednim do badania interakcji komórek odpornościowych in vitro.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a pathological hallmark of many neurodegenerative and neuroinflammatory diseases affecting the central nervous ...

Jest to pierwszy protokół pozwalający na różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu o dobrych właściwościach barierowych, dojrzałych połączeniach ścisłych i ekspresji cząsteczek adhezyjnych komórek śródbłonka pośredniczących w migracji komórek odpornościowych do centralnego układu nowicjusza. Komórki podobne do EECM-BMEC pozwalają badać migrację komórek odpornościowych przez barierę krew-mózg za pomocą modeli bariery krew-mózg pochodzących od pacjentów w sposób w pełni autologiczny. Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym w komórki podobne do EECM-BMEC pozwoliło nam zidentyfikować wewnętrzne defekty bariery w tych modelach in vitro pacjentów ze stwardnieniem rozsianym.Ta metoda hodowlana pozwoli nam zatem w przyszłości zidentyfikować szlaki molekularne leżące u podstaw tych zaburzonych właściwości barierowych. Metody te mogą być stosowane w szerszym spektrum chorób, w których morfologia surowicy i infiltracja komórek odpornościowych do OUN mają kluczowe znaczenie dla tych patogenez, na przykład udar mózgu lub neuroinfekcja. Próbując tej techniki po raz pierwszy, użyj tej samej ilości materiałów komórkowych.Gęstość wysiewu jest kluczem do sukcesu tego protokołu i musi być dostosowana w zależności od użytych klonów. Procedurę zademonstruje Kinya Matsuo, adiunkt z mojego laboratorium. W piątym dniu hodowli komórek progenitorowych śródbłonka odessać pożywkę ze studzienek i dodać jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego do każdej studzienki.Inkubuj płytkę przez sześć do ośmiu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą mikropipety zdysocjuj i ponumeruj komórki. Następnie przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, aby przefiltrować do 50-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów pożywki DMEM/F-12 10.Aby zatrzymać reakcję trawienia, dodaj pożywkę DM DMEM/F-12 10 do oznaczenia 50 mililitrów. Dokładnie odpipetować i zarezerwować 10 mikrolitrów do policzenia komórek. Odwiruj 50-mililitrową probówkę o masie 200 g przez pięć minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza, aby otoczyć komórki.Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 mililitrami pożywki DMEM/F-12 10. Przenieś zawiesinę komórek do świeżej 15-mililitrowej probówki. Wirować przy 200 g przez pięć minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza, aby ponownie zagnieździć komórki.Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w pierwszym buforze przepływowym. Następnie dodać odczynnik blokujący FCR w stosunku jeden do 100 i inkubować przez pięć minut. Następnie dodaj rozcieńczony izotiocyjanian fluoresceiny w stosunku jeden do 200 lub przeciwciało CD31 znakowane FITC.Inkubować zawiesinę przez 30 minut w ciemności w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 10 mililitrów pierwszego buforu przepływowego do próbki i zarezerwować 10 mikrolitrów zawiesiny do analizy cytometrii przepływowej w celu określenia frakcji komórek CD31-dodatnich. Odwirować komórki o masie 200 g przez pięć minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza.Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu przepływowego jednego roztworu. Następnie dodaj pięć mikrolitrów koktajlu selekcyjnego FITC na 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej. Dokładnie wymieszać roztwór, pipetując i inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza.Następnie dodaj pięć mikrolitrów nanocząstek magnetycznych na 100 mikrolitrów zawiesiny komórek. Dobrze odpipetować mieszaninę i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Przenieś zawiesinę komórek do pięciomililitrowej rurki cytometrii przepływowej i dodaj jeden bufor przepływowy, aby uzyskać całkowitą objętość 2,5 mililitra.Następnie umieść rurkę cytometrii przepływowej w magnesie na pięć minut. W ciągłym ruchu odwróć magnes i zdekantuj zawiesinę komórek zawierającą nieznakowane komórki przeciwciała FITC CD31. Utrzymuj magnes i rurkę w pozycji odwróconej przez dwie do trzech sekund, a następnie usuń pozostały płyn.Zassać wszelkie kropelki na krawędzi rurki przed przywróceniem rurki do pozycji pionowej. Wyjmij rurkę cytometrii przepływowej z magnesu i dodaj 2,5 mililitra pierwszego bufora przepływowego, aby umyć pozostałe komórki dodatnie CD31. Delikatnie odpipetuj komórki w górę i w dół dwa lub trzy razy, aby je ponownie zawiesić.Następnie umieść rurkę przepływową w magnesie na pięć minut. Powtórz mycie co najmniej cztery razy, aby usunąć nieoznakowane komórki FITC CD31 z probówki. Wyjmij rurkę przepływową z magnesu i ponownie zawieś oczyszczone dodatnie ogniwa CD31 z żądaną ilością odpowiedniego medium.Zarezerwować dwie 10-mikrolitrowe podwielokrotności zawiesiny, jedną do zliczania komórek, a drugą do przeprowadzenia analizy cytometrii przepływowej w celu oceny czystości komórek CD31 dodatnich w próbkach do sortowania komórek aktywowanych po aktywacji magnetycznej. Usunąć pożywkę HECSR z sześciu płytek dołkowych zawierających populacje komórek śródbłonka i nieśródbłonka. Następnie dodaj jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego do każdej studzienki.Uważnie obserwuj morfologię komórki pod mikroskopem. Kiedy komórki śródbłonka wydają się jasne i okrągłe, zwykle w ciągu dwóch do pięciu minut, odłącz je, stukając w krawędź płytki. Komórki nieśródbłonkowe pozostają przyczepione do płytki.Za pomocą mikropipety ostrożnie zebrać oderwane komórki śródbłonka, nie naruszając komórek nieśródbłonka i przenieść je do 15 mililitrów lub 50 mililitrów probówki wirówkowej zawierającej cztery mililitry DMEM/F-12 10 na mililitr odczynnika dysocjacyjnego. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki HECSR do studzienek zawierających pozostałe przyłączone komórki nieśródbłonkowe, aby ustalić komórki przypominające mięśnie gładkie lub SMLC i umieść płytkę w inkubatorze. Przenieść zawiesinę komórek śródbłonka do probówki wirówkowej.Dokładnie wymieszać i zachować 10 mikrolitrów zawiesiny do liczenia komórek. Odwirować pozostałe komórki w temperaturze 200 g przez pięć minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki HECSR.Następnie usuń kolagen do roztworu z wcześniej przygotowanej płytki sześciodołkowej kodowanej kolagenem i dodaj dwa mililitry zawiesiny komórek śródbłonka do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Barwienie immunofluorescencyjne cząsteczek połączeń komórkowych podobnych do EECM-BMEC, w tym klaudyny-5, okludyny i kadheryny VE, zastosowano do oceny morfologii komórek oraz obecności połączeń ciągłych i dojrzałych.Stymulacja komórek podobnych do EECM-BMEC wysiewanych na szkiełkach komorowych cytokinami prozapalnymi, takimi jak czynnik martwicy nowotworu alfa i interferon gamma rozcieńczone w pożywce kondycjonowanej SMLC, zwiększała ekspresję cząsteczek adhezyjnych, takich jak ICAM-1 i VCAM-1. Reprezentatywne obrazy markerów komórek mięśni gładkich, w tym aktyny mięśni gładkich alfa, kalponiny i białka mięśni gładkich 22 alfa, pokazano tutaj. Stymulacja komórek podobnych do EECM-BMEC cytokinami prozapalnymi, takimi jak czynnik martwicy nowotworu alfa i interferon gamma, regulowała ekspresję na powierzchni komórki kilku cząsteczek adhezyjnych, w tym ICAM-1, VCAM-1 i selektyny P.Co więcej, stymulacja cytokinami zapalnymi również zwiększała ekspresję cząsteczek adhezyjnych śródbłonka i promowała zwiększoną liczbę komórek odpornościowych, które przylegały do monowarstw komórkowych podobnych do EECM-BMEC. Komórki podobne do EECM-BMEC są również obiecujące dla dogłębnego zrozumienia mechanizmów patofizjologicznych na poziomie bariery krew-mózg oraz jako cenne narzędzie do opracowania nowego celu terapeutycznego dla stabilizacji bariery krew-mózg.

differentiation-human-induced-pluripotent-stem-cells-to-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje protokół indukowania różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki śródbłonka mózgu.

Generowanie komórek śródbłonka mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film pokazuje procedurę różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w komórki podobne do mikrogleju. Proces ten polega na formowaniu ciał embrionalnych, przenoszeniu ich do powlekanych studzienek i wykorzystywaniu określonych czynników wzrostu do kierowania różnicowaniem w prymitywne prekursory makrofagów, które ostatecznie różnicują się w komórki podobne do mikrogleju.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki podobne do mikrogleju

Ten film demonstruje wieloetapowy proces różnicowania ludzkich iPSC w mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu. Powstałe w ten sposób zróżnicowane komórki ściśle naśladują komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, charakteryzujące się ścisłymi połączeniami, co czyni je idealnymi do badań nad chorobami mózgu.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Celowanie w komórki rezydujące w mózgu w celu bezpośredniego przeprogramowania linii otwiera nowe perspektywy dla naprawy mózgu. Tutaj opisujemy protokół, w jaki sposób przygotować kultury wzbogacone o perycyty rezydujące w mózgu z kory mózgowej dorosłego człowieka i przekształcić je w indukowane neurony przez ekspresję czynników transkrypcyjnych Sox2 i Ascl1 za pośrednictwem retrowirusa.

Przeprogramowanie linii komórek pochodzących z perycytów mózgu dorosłego człowieka na neurony indukowane

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Ten protokół szczegółowo opisuje dostosowaną metodę pozyskiwania, rozszerzania i kriokonserwacji mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu uzyskanych przez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, oraz badania właściwości bariery krew-mózg w modelu ex vivo.

Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje proces różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w komórki podobne do mikrogleju do eksperymentów in vitro. Dołączamy również szczegółową procedurę generowania ludzkich synaptosomów z dolnych neuronów ruchowych pochodzących z iPSC, które można wykorzystać jako substrat do testów fagocytozy in vitro przy użyciu systemów obrazowania żywych komórek.

Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu z rezydującym mikroglejem poprzez włączenie do rozwoju organoidów komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do rozwoju organoidów.

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Poznaj metodę różnicowania komórek iPSC do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu z wykorzystaniem EECM. Ta technika umożliwia badanie migracji komórek immunologicznych przez barierę krew-mózg.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym (Wideo) | JoVE Journal

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Przeglądaj więcej filmów