Komórkowa platforma impedancji elektrycznej do oceny inhibitorów wirusa Zika w czasie rzeczywistym

Infekcje wirusowe są bardzo dynamiczne, a tradycyjne testy końcowe w wirusologii mają ograniczenie polegające na tym, że wybrany punkt końcowy może prowadzić do pominięcia informacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki impedancji elektrycznej opartej na komórkach możliwe jest śledzenie infekcji wirusowej i aktywności związków przeciwwirusowych w czasie rzeczywistym. Tę procedurę zademonstruje Eef Meyen, technik laboratoryjny z naszego laboratorium.

Aby rozpocząć, przygotuj płytkę CEI, biorąc 96-dołkową płytkę z elektrodą międzypalcową. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki do hodowli wzrostu do każdej studzienki i wypełnij przestrzenie między studzienkami DPBS. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cztery godziny.

Aby wysiać komórki A549, należy odłączyć je od kolby hodowlanej, jak opisano w manuskrypcie i ponownie zawiesić w świeżej pożywce wzrostowej. Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki. Policz żywe komórki i rozcieńcz je w świeżej pożywce wzrostowej, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek.

Po inkubacji usunąć pożywkę do hodowli wzrostu za pomocą pipety wielokanałowej z płytki 96-dołkowej. Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny komórek na dołek. Po zrównoważeniu komórek umieść płytkę w urządzeniu CEI, aby skonfigurować i przeprowadzić test CEI.

Otwórz oprogramowanie urządzenia, a następnie w okienku Zbieranie danych kliknij pozycję Konfiguracja, aby ustawić nowy eksperyment. Podłącz laptopa do urządzenia ECIS. Skonfiguruj płytkę, sprawdzając impedancje studni, jak wskazano kolorem zielonym.

W okienku Konfiguracja studni wybierz typ tablicy zgodnie z używanym oprogramowaniem kulturowym i kliknij tryb czasu Multiple Frequency. Następnie rozpocznij pomiar, naciskając Start. Utrzymuj związek na lodzie.

Wykonać 10-krotnie skoncentrowane rozcieńczenie za pomocą zrównoważonej pożywki testowej w pięciomililitrowej probówce polipropylenowej, a następnie dodać związek. W okienku Data Collection Setup (Ustawienia zbierania danych) kliknij przycisk Pause (Wstrzymaj), a po zakończeniu bieżącego punktu czasowego wyjmij płytkę z 96 dołkami. Obserwuj przyleganie i tworzenie się monowarstw komórek pod mikroskopem świetlnym.

Następnie odessać 20 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej i dodać 20 mikrolitrów roztworu złożonego lub nośnika do żądanych studzienek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 15 minut. Aby przygotować roztwór wirusa, rozmrozić fiolkę z zapasem wirusa.

Po wykonaniu rozcieńczeń w żądanym MOI z pożywką testową w 15-mililitrowej probówce polipropylenowej, dodaj zapas wirusa. Po dodaniu rozcieńczenia wirusa do przypisanych studzienek dodaj 100 mikrolitrów pożywki testowej do studzienek kontrolnych komórek. Następnie należy odkazić zastosowane pojemniki z wirusem.

Umieść płytkę z powrotem w urządzeniu CEI i kliknij Wznów, aby kontynuować pomiary przez sześć kolejnych dni. Aby przeanalizować dane, kliknij przycisk Zakończ, aby zakończyć eksperyment i dodać Wprowadź podsumowanie eksperymentu. Po zakończeniu zbierania danych wybierz przycisk OK. Wybierz żądaną częstotliwość w okienku Wykres

Upewnij się, że wszystkie studnie są zaznaczone w okienku Konfiguracja studni i kliknij Plik, następnie Eksportuj dane, a następnie Dane wykresu, aby wyeksportować dane w formacie arkusza kalkulacyjnego. Test CEI wykazał, że kinetyka infekcji była w dużym stopniu zależna od typu komórki, a komórki U87 były podatne na zakażenie wirusem Zika tylko przy wysokich MOI. Testy CEI wykazały również, że w pełni rozwinięta monowarstwa komórkowa jest w dużym wysiewie komórek i nie może dalej rozprzestrzeniać się po elektrodach CEI, co prowadzi do niewielkiej różnicy między kontrolą komórki a kontrolą wirusa.

W przypadku U87, większego typu komórek, zbyt gęste wysiewanie komórek mogło doprowadzić do całkowitego oderwania monowarstwy komórki. Reprezentatywny szczep wirusa Zika afrykańskiego MR766 w linii azjatyckiej PRVABC59 wykazywał podobne wzorce CEI. Ma PRVABC59 jednak nieco wolniejsze właściwości indukujące efekt cytopatyczny co znajduje również odzwierciedlenie w wartościach CIT50.

Profile impedancji trzech różnych MOI obu szczepów wirusa Zika wykazały, że określone stężenie związku opóźniało spadek impedancji spowodowany zakażeniem wirusem Zika. Test CEI wykazał, że aktywność przeciwwirusowa była zależna od obliczeń MOI i AUCN określających wartości IC50. Ocenione wartości CIT50 wykazały złożone potencje w kinetyce wzrostu komórek i infekcji.

CEI to potężna technologia służąca do oceny i charakteryzowania związków przeciwko replikacji wirusa Zika w czasie rzeczywistym, bez znaczników i w sposób nieinwazyjny.