Name: Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów z ludzkiej tkanki keloidowej. Protokół zapewnia czyste, żywotne komórki niezbędne do badań nad biologią blizn przerostowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (granty o numerach 81903189 i 82073418) oraz Fundacji Nauki i Technologii w Kantonie (grant numer 202102020025).

To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Szpitala Dermatologicznego Południowego Uniwersytetu Medycznego (2020081). Świadoma zgoda pacjenta została uzyskana przed pobraniem tkanek od osób.
1. Przygotowanie
UWAGA: Następujące procedury powinny być wykonywane w sterylnym środowisku pod koterią bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę hodowlaną, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztworu penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B (PSA) do zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy.</li>
	<li>Przygotować buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) z PSA, dodając 1% PSA do 1x PBS. Przygotuj PBS z FBS, dodając 1% FBS do 1x PBS.</li>
	<li>Przygotuj kilka wysterylizowanych nożyczek, kleszczyków i skalpeli przez autoklawowanie.</li>
</ol>
2. Uzyskiwanie usuniętych tkanek
<ol>
	<li>Uzyskaj tkanki od pacjentów z bliznowcami za pomocą operacji. Zebrać świeże tkanki keloidu do sterylnej torby do pakowania lub sterylnej probówki wirówkowej i przenieść je do szafy bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium tak szybko, jak to możliwe. 
	UWAGA: W tym protokole rozmiar nabytej tkanki keloidowej wynosił około ~20 x 20 x 10 mm3, a rozmiar może się różnić w zależności od operacji.</li>
</ol>
3. Izolacja
<ol>
	<li>Usuń tkankę keloidową za pomocą sterylnej pęsety i umieść ją w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 10-25 ml PBS z 1% PSA na 10 minut. Następnie przygotuj płytkę 6-dołkową i dodaj 4 ml PBS uzupełnionego 1% PSA do każdej studzienki. Wyjmij chusteczkę za pomocą wysterylizowanej pęsety i umyj ją dwukrotnie PBS uzupełnionym 1% PSA. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę sekwencyjnie z jednego dołka do drugiego.</li>
	<li>Usuń warstwy tkanki tłuszczowej i naskórka za pomocą nożyczek chirurgicznych lub skalpela chirurgicznego i pozostaw warstwę skóry właściwej nietkniętą. Przytnij i rozetnij warstwę skóry właściwej na3-5 mm 2 kawałki nożyczkami, przenieś te kawałki za pomocą sterylnych kleszczy do następnej studzienki i ponownie umyj je w PBS z 1% roztworem PSA.</li>
</ol>
4. Kultura
<ol>
	<li>Umieść kawałki tkanki skóry właściwej na szalkach Petriego za pomocą wysterylizowanych kleszczy; upewnij się, że liczba kawałków wynosi od 10 do 30, a odległość między każdym kawałkiem wynosi >5 mm. Umieść szalki Petriego do góry nogami w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut, aż kawałki tkanek trochę wyschną i przykleją się do szalki Petriego. Następnie dodać DMEM uzupełniony 10% FBS i 1% PSA i ostrożnie umieścić szalki Petriego w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Fibroblasty to morfologicznie i funkcjonalnie niejednorodna populacja komórek. Biorąc pod uwagę tę złożoność, etapy izolacji i hodowli należy wykonywać ostrożnie; Równomiernie wybierz kawałki keloidowej tkanki skórnej i dobrze wymieszaj te kawałki przed umieszczeniem ich na szalce Petriego.</li>
	<li>Po 3 dniach zastąp połowę supernatantu kompletną pożywką hodowlaną. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni. Obserwuj fibroblasty pod mikroskopem w 40-krotnym powiększeniu każdego dnia. 
	UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać delikatnie. Nie przesuwaj szalki Petriego przez 2 dni po izolacji, ponieważ kawałki tkanki potrzebują czasu, aby przylgnąć do szalek Petriego.</li>
	<li>Gdy fibroblasty rosnące wokół fragmentów tkanek osiągną około 90% zbieżności, usuń fragmenty tkanki i pożywkę hodowlaną. Umyj fibroblasty sterylnym 1x PBS i dodaj 2 ml sterylnego 1x roztworu trypsyny-EDTA do płytek. Inkubować komórki przez około ~3-5 minut w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Delikatnie postukaj w naczynie hodowlane i obserwuj je pod mikroskopem. Gdy większość komórek oderwie się od płytki, dodaj 2 ml kompletnej pożywki, aby zakończyć proces trawienia.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować probówkę o masie 300 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnym podłożu. Wysiewać fibroblasty do 9-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2</li>.
</ol>
5. Konserwacja i konserwacja
<ol>
	<li>Około 3-4 dni później, gdy fibroblasty osiągną 80% zbieżności, powtórz kroki 4.2-4.4 i pasażuj fibroblasty w stosunku 1:3. Użyj pasażowanych fibroblastów do dalszych eksperymentów. 
	UWAGA: Hodowlę fibroblastów należy zatrzymać po 10 pasażach, ponieważ komórki mogą zacząć wykazywać zmienione cechy w porównaniu z oryginalnymi komórkami.</li>
	<li>Kriokonserwuj pasażowane komórki P1-P3 w ciekłym azocie do dalszego wykorzystania.
	<ol>
		<li>Powtórz kroki 4.2-4.3. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować probówkę przez 3 minuty przy stężeniu 300 × g. Ostrożnie wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do zamrażania komórek zawierającej 90% FBS i 10% DMSO, a następnie przenieść zawiesinę do krioprobówek komórkowych.</li>
		<li>Przenieś komórki do zamrożonego pudełka, a następnie umieść zamrożone pudełko w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Po 1 dniu przenieś komórki do ciekłego azotu w celu długotrwałej konserwacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Identyfikacja fibroblastów za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego
<ol>
	<li>Umieść okrągłe szkiełka nakrywkowe na 24-dołkowej płytce i posaz pasażowane fibroblasty w stężeniu 1 ×10 4 komórek/basenik. Gdy fibroblasty osiągną 60% zbieżności, usuń pożywkę hodowlaną. Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu, aby utrwalić fibroblasty przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przemyj 3x PBS przez 1 minutę za każdym razem. 
	UWAGA: Policz liczbę komórek za pomocą szkiełka hemocytometrycznego pod mikroskopem lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Usunąć PBS, inkubować z 0,5% Triton X-100 przez 20 minut w celu przepuszczalności błon komórkowych, a następnie przemywać 3x PBS przez 1 minutę za każdym razem. Dodaj PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej i moczyć przez 30 minut. Następnie usuń go i dodaj przeciwciało PDGFR-α/wimentyny rozcieńczone w rozcieńczalniku przeciwciał w stosunku 1:1,000. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia usuń przeciwciało pierwszorzędowe, przemyj komórki 3x PBS przez 3 minuty i dodaj przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor-555 kozie przeciwciało anty-królicze IgG rozcieńczone rozcieńczalnikiem przeciwciał w stosunku 1:200 do moczenia przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usuń przeciwciało drugorzędowe i przemyj komórki 3x PBS. Wyjmij okrągłe szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszków, umieść je na szkiełkach i dodaj 50 μl 5 μg/ml roztworu 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w celu zabarwienia jąder komórkowych. Przechowuj próbki w wilgotnym, ciemnym pudełku i obserwuj je pod laserowym konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym. 
	UWAGA: Dodaj ujemną grupę kontrolną bez przeciwciała pierwszorzędowego, ale z przeciwciałem drugorzędowym, aby wykluczyć barwienie niespecyficzne.</li>
</ol>
7. Identyfikacja fibroblastów za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zebrać osad komórkowy do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i ponownie zawiesić z 50 μl PBS zawierającego 1% FBS. Inkubować z anty-CD90 przez 30 minut w ciemności i dodać kontrolną izotyp anty-IgG do grupy kontrolnej. Następnie dodać 200 μl PBS zawierającego 1% FBS i odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 300 × g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 200 μl PBS zawierającego 1% FBS. Zawiesić zawiesinę i przefiltrować przez sitko komórkowe (siatka 70). Dodać do przesączu roztwór podstawowy DAPI o stężeniu 5 μg/ml w stosunku 1:100, a następnie uzyskać wyniki za pomocą cytometrii przepływowej. Ustaw rozproszenie do przodu (FSC) jako odciętą, a rozproszenie boczne (SSC) jako rzędną i zakreśl główną populację komórek. Wybierz populację komórek i ustaw fikoerytrynę jako odciętą, a liczbę jako rzędną do analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).</li>
<li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212(2022).</li>
<li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keloid+disorder%3A+Genetic+basis%2C+gene+expression+profiles%2C+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840(2022).</li>
<li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars%3A+A+critically+appraised+topic%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li>
<li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo%2C+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring%3A+Human+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li>
<li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li>
<li>Künzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858(2019).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+explants+culture+method%3A+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li>
<li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).</li>
<li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li>
<li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+regulates+cell+growth%2C+apoptosis%2C+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+%28TGF-beta%29%2FSMAD+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li>
<li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+explant+culture%3A+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815(2021).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+PDGFR%CE%B1+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).</li>
<li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

Uzyskanie pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych stanowi krytyczną podstawę do dalszych badań. Do tej pory istniały dwie metody pozyskiwania pierwotnych fibroblastów: trawienie enzymatyczne i hodowla eksplantatów 11,12,13,14. Jednak obie tradycyjne metody mają ograniczenia, takie jak podatność na zanieczyszczenie, mieszanie z innymi typami komórek, długi okres hodowli i niski wskaźnik su...

Keloid, choroba fibroproliferacyjna, objawia się ciągłym wzrostem blaszek, które często atakują otaczającą normalną skórę bez samoograniczenia i powodują różne stopnie swędzenia, bólu oraz kosmetycznych i psychologicznych obciążeń dla pacjentów1. Fibroblasty, pierwotne komórki zaangażowane w bliznowce, odgrywają zasadniczą rolę w powstawaniu i rozwoju tej choroby poprzez nadmierną proliferację, nadmiarową produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej i zdezorganizowane kolageny2,3. Jednak leżąca u podstaw patogeneza pozostaje niejasna i nadal brakuje skutecznej metody terapeutycznej w przypadku keloidu; W związku z tym istnieje pilna potrzeba dalszych badań4,5.
Ponieważ nie ma idealnego modelu zwierzęcego do badań nad keloidami in vivo6,7,Zbudowanie modelu in vitro poprzez pozyskanie pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych może zapewnić wykonalność i wiarygodność dla badań nad keloidami2,6. Komórki pierwotne to te, które pochodzą bezpośrednio z żywej tkanki i ogólnie uznaje się, że komórki te mogą bardziej przypominać stan fizjologiczny i tło genetyczne wielu osób w porównaniu z liniami komórkowymi8,9. Hodowla komórek pierwotnych zapewnia potężny środek do badania wzrostu i metabolizmu komórek, a także innych fenotypów komórkowych.
Obecnie istnieją dwie metody pozyskiwania pierwotnych fibroblastów: trawienie enzymatyczne i hodowla eksplantatów. Zidentyfikowano jednak kilka przeszkód w uzyskaniu pierwotnych fibroblastów, takich jak ryzyko zanieczyszczenia różnymi bakteriami lub grzybami, mieszanie się z innymi typami komórek, które nie są łatwe do usunięcia, długi okres cyklu hodowli, późniejsze zmiany w charakterystyce komórek w porównaniu z oryginalnymi komórkami i tak dalej9. Dlatego opracowanie wykonalnego i skutecznego procesu otrzymywania pierwotnych fibroblastów jest podstawą do dalszych badań i zastosowań. Badanie to opisuje zoptymalizowany protokół ekstrakcji pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, które mogą skutecznie i stabilnie dostarczać czyste i żywotne fibroblasty.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml sterylna probówka wirówkowa</td><td>JETBIOFIL</td><td>CFT002015</td><td></td></tr><tr><td>15 ml sterylna probówka wirówkowa</td><td>JETBIOFIL</td><td>8076</td><td></td></tr><tr><td>4% poliformaldehyd</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td>Utrwalanie komórek</td></tr><tr><td>50 ml sterylna probówka wirówkowa</td><td>JETBIOFIL</td><td>8081</td><td>Umieść tkankę keloidową</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-555 koza anty-królik IgG&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Alexa&nbsp; Fluor&nbsp; 555&nbsp;</td><td>Drugie przeciwciało do testu barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Anti human CD90</td><td>BioLegend</td><td>B301002</td><td>Zidentyfikuj czystość fibroblastów</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0262</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 seria A2</td><td>Izolacja i hodowla komórek</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>aladyn B265993</td><td></td><td>Blokowanie do testu barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Inkubator dwutlenku węgla</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td>Służy do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Krioprobówki komórkowe</td><td>Corning</td><td>43513</td><td>Przechowuj komórki w niskotemperaturowej</td></tr><tr><td>maszynie odśrodkowej</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST 16R</td><td>Odrzutowy supernatant&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C1006</td><td>Barwienie jądra komórkowego</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td>Stosowanie do konserwacji komórek</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Roztwór pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu BI</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD</td><td>BD FACSCelesta</td><td>Obserwacja tożsamość komórek</td></tr><tr><td>zamrożonych w pudełku</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 5100-0050</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>AIR-HD25</td><td>Obserwacja testu barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Przeciwciało PDGFR-&alpha</td><td>CST</td><td>3174T</td><td>Pierwsze przeciwciało do barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny-Am</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td>Dodać roztwór pożywki hodowlanej, aby uniknąć zanieczyszczenia</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>JETBIOFIL</td><td>7556</td><td>Hodowla fibroblastów</td></tr><tr><td>Roztwór soli buforowany</td><td>fosforanem Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Roztwór pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Królik (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>5742S</td><td>Jako kontrola cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełko nakrywkowe</td><td>Biosharp</td><td>801007</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>Wybij otwory w błonie komórkowej</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Stosowany do pasażowania komórek</td></tr><tr><td>Przeciwciało wimentyny</td><td>Abcam</td><td>ab8978</td><td>Pierwsze przeciwciało do testu barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr></tbody></table>

izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Fibroblasty, główny typ komórek w tkance keloidowej, odgrywają istotną rolę w tworzeniu i rozwoju keloidów. Izolacja i hodowla pierwotnych fibroblastów pochodzących z tkanki keloidowej stanowią podstawę do dalszych badań nad funkcją biologiczną i mechanizmami molekularnymi bliznowców, a także nowych strategii terapeutycznych w ich leczeniu. Tradycyjna metoda otrzymywania fibroblastów pierwotnych ma ograniczenia, takie jak zły stan komórkowy, mieszanie się z innymi typami komórek oraz podatność na zanieczyszczenia. W tym artykule opisano zoptymalizowany i łatwy do odtworzenia protokół, który może zmniejszyć występowanie ewentualnych problemów podczas uzyskiwania fibroblastów. W tym protokole fibroblasty można obserwować 5 dni po izolacji i osiągają prawie 80% zbiegu po 10 dniach hodowli. Następnie fibroblasty są pasażowane i weryfikowane za pomocą PDGFRα i przeciwciał wimentyny do testów immunofluorescencyjnych oraz przeciwciał CD90 do cytometrii przepływowej. Podsumowując, fibroblasty z tkanki keloidowej można łatwo pozyskać za pomocą tego protokołu, który może stanowić obfite i stabilne źródło komórek w laboratorium do badań keloidów.

Harmonogram protokołu przedstawiono w Rysunku 1A. Reprezentatywne obrazy procesu izolacji pokazano na Rysunku 2; warstwy naskórka i tkanki tłuszczowej zostały ostrożnie usunięte, a warstwę skóry właściwej podzielono na małe fragmenty o wielkości 3-4 mm2, które następnie zaszczepiono w szalkach Petriego.
Jak pokazano na rycinie 3A, kilka wypustek fibroblastów z fragmentów tkanki zaobserwowan...

To badanie opisuje zoptymalizowany protokół tworzenia pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, które mogą skutecznie i stabilnie dostarczać czystych i żywotnych fibroblastów.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

Izolacja i hodowla pierwotnych fibroblastów pochodzących z tkanki keloidowej są podstawą do dalszych badań keloidów. Fibroblasty z tkanki keloidowej można łatwo pozyskać za pomocą tego protokołu, który może stanowić obfite i stabilne źródło komórek w laboratorium do badań keloidów. Zacznij od użycia sterylnej pęsety, aby umieścić tkankę keloidu w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów zawierającej od 10 do 25 mililitrów PBS uzupełnionej 1% PSA.W międzyczasie dodaj cztery mililitry roztworu PBS PSA do każdego dołka sześciodołkowej płytki. Teraz wyjmij chusteczkę z probówki i przemyj ją dwukrotnie roztworem PBS PSA. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę sekwencyjnie z jednego dołka do drugiego.Następnie usuń warstwy tłuszczu i naskórka nożyczkami chirurgicznymi, pozostawiając skórę właściwą nietkniętą. Użyj nożyczek, aby wyciąć przyciętą skórę właściwą na trzy do pięciu milimetrów kwadratowych i przenieś je do następnej studzienki za pomocą sterylnych kleszczy. Umyj kawałki w roztworze PBS PSA.Za pomocą wysterylizowanych kleszczy umieść od 10 do 30 kawałków tkanki skóry właściwej w odstępach mniejszych niż pięć milimetrów od siebie na szalkach Petriego. Umie

isolation-culture-characterization-primary-dermal-fibroblasts-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

Protokół hodowli eksplantów fibroblastów z biopsji wycinanych ze skóry ludzkiej jest technicznie niezawodną i prostą metodą pozyskiwania komórek skóry w ciągu 4-8 tygodni w celu zamrożenia około 15-20 milionów komórek o niskim numerze pasażu.

Kultura eksplantacyjna z biopsji wycinkowej skóry do izolacji pierwotnych ludzkich fibroblastów

Ten film demonstruje protokół izolacji i hodowli komórek Schwanna z ludzkich tkanek skóry właściwej. Ludzka skóra właściwa zawiera różne typy komórek, w tym fibroblasty i komórki Schwanna. Po wyizolowaniu komórki są traktowane środkiem antymitotycznym w celu wyeliminowania proliferujących fibroblastów, w wyniku czego uzyskuje się czystą hodowlę komórek Schwanna.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek Schwanna z ludzkiej skóry właściwej

Opisujemy metodę izolowania naiwnych multipotencjalnych komórek prekursorowych pochodzenia skórnego (SKP) z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów. Pokazujemy, że te SKP pochodzące z kultur fibroblastów mają podobne właściwości komórek macierzystych do tych pochodzących bezpośrednio z biopsji ludzkiej skóry. Komórki te wyrażają marker grzebienia nerwowego, nestynę, oprócz markerów multipotencjalnych, takich jak OCT4 i Nanog.

Izolacja naiwnych dorosłych komórek macierzystych z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę keratynocytów jamy ustnej pochodzących z podniebienia dorosłej myszy. Podano również metodę oceny z wykorzystaniem barwienia immunologicznego.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Badanie gojenia się ran związanych z urazami mięśniowo-szkieletowymi często wymaga oceny interakcji in vitro między komórkami Schwanna (SC), keratynocytami i fibroblastami. Protokół ten opisuje izolację, hodowlę i charakterystykę tych pierwotnych komórek z ludzkiego napletka.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych komórek Schwanna, keratynocytów i fibroblastów z ludzkiego napletka

Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów z ludzkiej tkanki keloidowej. Protokół zapewnia czyste, żywotne komórki niezbędne do badań nad biologią blizn przerostowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej

Przeglądaj więcej filmów