Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej
28 lipca 2023
To badanie opisuje zoptymalizowany protokół tworzenia pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, które mogą skutecznie i stabilnie dostarczać czystych i żywotnych fibroblastów.
Izolacja i hodowla pierwotnych fibroblastów pochodzących z tkanki keloidowej są podstawą do dalszych badań keloidów. Fibroblasty z tkanki keloidowej można łatwo pozyskać za pomocą tego protokołu, który może stanowić obfite i stabilne źródło komórek w laboratorium do badań keloidów. Zacznij od użycia sterylnej pęsety, aby umieścić tkankę keloidu w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów zawierającej od 10 do 25 mililitrów PBS uzupełnionej 1% PSA.
W międzyczasie dodaj cztery mililitry roztworu PBS PSA do każdego dołka sześciodołkowej płytki. Teraz wyjmij chusteczkę z probówki i przemyj ją dwukrotnie roztworem PBS PSA. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę sekwencyjnie z jednego dołka do drugiego.
Następnie usuń warstwy tłuszczu i naskórka nożyczkami chirurgicznymi, pozostawiając skórę właściwą nietkniętą. Użyj nożyczek, aby wyciąć przyciętą skórę właściwą na trzy do pięciu milimetrów kwadratowych i przenieś je do następnej studzienki za pomocą sterylnych kleszczy. Umyj kawałki w roztworze PBS PSA.
Za pomocą wysterylizowanych kleszczy umieść od 10 do 30 kawałków tkanki skóry właściwej w odstępach mniejszych niż pięć milimetrów od siebie na szalkach Petriego. Umieść naczynia do góry nogami w inkubatorze, aż kawałki wyschną i przykleją się do naczynia. Następnie dodaj siedem mililitrów DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% PSA i inkubuj naczynia jak poprzednio.
Po trzech dniach zastąp połowę supernatantu kompletną pożywką hodowlaną. Obserwuj fibroblasty codziennie pod 40-krotnym powiększeniem mikroskopowym. Usuń fragmenty tkanki z pożywki hodowlanej, gdy fibroblasty osiągną 90% zbieżności.
Umyj fibroblasty w PBS i dodaj dwa mililitry sterylnego roztworu EDTA trypsyny. Po inkubacji komórek w nawilżonym inkubatorze delikatnie postukaj w naczynie hodowlane i obserwuj je pod mikroskopem. Dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki na koniec do trawienia, gdy większość komórek się odłączy.
Teraz przenieś zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i odwiruj probówkę o sile 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnym podłożu. Zasiej fibroblasty w dziewięciocentymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej i inkubuj w wilgotnym inkubatorze.
Aby przeprowadzić analizę immunofluorescencyjną po wyhodowaniu fibroblastów na okrągłych szkiełkach nakrywkowych i inkubacji ich w przeciwciałach pierwszorzędowych i wtórnych, dodaj 50 mikrolitrów roztworu DAPI do szkiełka w celu wybarwienia jąder komórkowych. Umyte szkiełka nakrywkowe ułożyć na szkiełkach podstawowych za pomocą kleszczy. Na koniec przenieś próbki do wilgotnego ciemnego pudełka w celu mikroskopii fluorescencyjnej.
Wyrostki fibroblastów w tkance obserwowano po pięciu dniach od przetworzenia. Fibroblasty wykazywały wysokie tempo proliferacji i osiągnęły konfluencję po 10 dniach. Fibroblasty miały wydłużone i wrzecionowate ciała komórkowe, które były ustawione w wiązki przy dużym zbiegu.
Barwienie immunofluorescencyjne dało dodatnią czerwoną immunofluorescencję fibroblastów i niebieską immunofluorescencję jądra komórkowego. Testy cytometrii przepływowej wykazały dodatni wynik CD90 w prawie wszystkich fibroblastach. W badaniu tym opisano zoptymalizowaną metodę i przedstawiono jasne instrukcje dotyczące rozwiązania istniejących wyzwań i zwiększenia szans na sukces w izolacji i hodowli fibroblastów keloidowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje zoptymalizowany protokół izolacji pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, który pozwala na skuteczne i stabilne pozyskiwanie czystych i żywotnych fibroblastów. Izolacja i hodowla tych fibroblastów są kluczowe dla rozwoju badań nad keloidami.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Hodowla komórek
- Izolacja fibroblastów
- Badania nad keloidami
Wstęp
- Keloidy są nieprawidłowymi bliznami, których badanie może być problematyczne.
- Pierwotne fibroblasty są kluczowe dla zrozumienia biologii keloidów.
- Istniejące protokoły mogą nie zapewniać wystarczającej żywotności komórek.
- Celem niniejszego badania jest usprawnienie procesu izolacji.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji fibroblastów z tkanek keloidowych.
- Zapewnienie stabilnego źródła fibroblastów do badań laboratoryjnych.
- Pogłębienie wiedzy na temat powstawania i leczenia keloidów.
Zastosowane metody
- Użycie sterylnych pincet i probówek do wirowania podczas manipulacji tkanką.
- Przemywanie tkanki keloidowej roztworem PBS uzupełnionym o 1% PSA.
- Sekwencyjne przenoszenie tkanki pomiędzy studzienkami w płytce sześciodołkowej.
- Ustanowienie warunków hodowli dla wzrostu fibroblastów.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja żywych fibroblastów z tkanek keloidowych.
- Protokół zapewnia obfitą liczbę komórek do celów badawczych.
- Fibroblasty zachowały stabilność i żywotność w czasie.
- Umożliwienie dalszych badań nad biologią keloidów.
Wnioski
- Zoptymalizowany protokół jest skuteczny w izolacji fibroblastów.
- Stanowi podstawę dla przyszłych badań nad keloidami.
- Zwiększa potencjał do postępów terapeutycznych w leczeniu keloidów.
Najczęściej zadawane pytania
Przemysłowe znaczenie praktyczne
Niezawodna izolacja i hodowla pierwotnych fibroblastów skóry właściwej z tkanki keloidowej odpowiada na krytyczną potrzebę tworzenia relewantnych dla choroby modeli komórkowych we wczesnych etapach odkrywania leków. Niniejszy protokół umożliwia stały dostęp do czystych, zwalidowanych populacji fibroblastów, wspierając badania mechanistyczne oraz walidację celów terapeutycznych w obrębie włóknistych schorzeń skóry. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną i ciągłość translacyjną w testowaniu hipotez terapeutycznych w ramach portfeli badawczych nad keloidami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków sterowanych przez fibroblasty, które są zaangażowane w patogenezę keloidów.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez dostarczenie funkcjonalnie zwalidowanych komórek pierwotnych.
- Ułatwia badania mechanistyczne w celu wyjaśnienia istotności celu w chorobach włóknistych.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wczesnych decyzjach dotyczących selekcji projektów w portfolio.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia powtarzalne źródło pierwotnych fibroblastów do standaryzacji testów.
- Umożliwia opracowanie ilościowych testów komórkowych do oceny związków.
- Wspiera powtarzalność i skalowalność w procesach przesiewowych.
- Zmniejsza zmienność poprzez minimalizację zanieczyszczeń i domieszek komórek innych niż fibroblasty.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele in vitro do istotnych dla choroby ludzkich typów komórek w badaniach translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w badaniach nad keloidami.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów na leki antyfibrotyczne.
- Stanowi platformę do odkrywania i walidacji biomarkerów, przy wsparciu badań następczych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół sytuuje izolację pierwotnych fibroblastów keloidowych na styku wczesnego etapu odkryć i badań przedklinicznych, umożliwiając solidną walidację celów oraz opracowanie testów dla programów badawczych nad włóknieniem skóry.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w patogenezie keloidów.
- Przesiew: Dostarcza zwalidowane, powtarzalne systemy komórkowe do opracowywania analiz ilościowych.
- Analityka: Umożliwia charakteryzację opartą na immunofluorescencji i cytometrii przepływowej w celu potwierdzenia tożsamości komórek.
- Badania translacyjne: Zapewnia istotne dla choroby modele komórkowe do przedklinicznej oceny potencjalnych środków terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia standaryzowany protokół możliwy do dostosowania przez różne zespoły badawcze i projekty.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad keloidami.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów pracy z pierwotnymi komórkami.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową w programach na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów antyfibrotycznych.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w sterylnym obchodzeniu się z tkankami oraz technikach pierwotnych hodowli komórkowych.
- Wymaga dostępu do zaplecza hodowli komórkowych, immunofluorescencji oraz aparatury do cytometrii przepływowej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności izolacji i charakterystyki komórek.
- Może wymagać adaptacji dla innych źródeł tkanek włóknistych lub skórnych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują zmienność między dawcami oraz dostępność tkanek.
