Name: Obrazowanie na żywo odbioru łagiewki pyłkowej rzodkiewnika i podwójnego zapłodnienia metodą semi-in vitro cum septum (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę semi-in vitro cum septum do badania odbioru łagiewki pyłkowej i podwójnego zapłodnienia u Arabidopsis thaliana. Technika zwiększa odbiorczość zalążków i umożliwia obserwację interakcji gametofitów z wysoką wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sarze Simonini i Stefano Bencivendze za przekazanie konstruktu pFG:roGFP2-ORP1-NLS oraz Christofowi Eichenbergerowi, Johannowi Almendingerowi, Vincentowi Sutterowi i Celii Baroux za ich rady dotyczące mikroskopii. Uprzejmie dziękujemy za rady Ravi Palanivelu, Philippowi Denningerowi, Sharon Kessler, Markowi Johnsonowi, Tomokazu Kawashimie i wszystkim innym uczestnikom Międzynarodowej Konferencji na temat Rozmnażania Roślin Seksualnych 2022, którzy wykazali zainteresowanie protokołem dotyczącym przegrody płciowej SIV. Prace te były wspierane przez Uniwersytet w Zurychu oraz granty ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki dla U.G.

UWAGA: Listę materiałów i sprzętu użytych w tym protokole znajduje się w Tabeli materiałów.
1. Uwagi dotyczące projektowania eksperymentu obrazowania
<ol>
	<li>Ustal czas obrazowania oraz częstotliwość próbkowania niezbędną do uchwycenia zjawiska, które ma zostać zaobserwowane. Na przykład, zgodnie z twierdzeniem Nyquista-Shannona o próbkowaniu, częstotliwość próbkowania musi być większa niż dwukrotność najwyższej częstotliwości sygnału wejściowego. W związku z tym, aby dokładnie zarejestrować oscylacje [Ca2+]cyt w komórkach synergid, należy wykonywać obrazowanie mniej więcej co 10 s, natomiast w celu pomiaru prędkości plemników po wyrzuceniu z rurki pyłkowej, należy zapewnić rozdzielczość czasową mniejszą niż 1 s10.</li>
	<li>Wybierz markery fluorescencyjne dla badanych komórek, które wykazują wystarczającą jasność w stosunku do tła autofluorescencji. W przypadku stosowania biosensorów wybierz linie najjaśniejsze, które nie zaburzają funkcji komórki, ponieważ są one zazwyczaj bardziej czułe i wymagają krótszego czasu ekspozycji.</li>
	<li>Rozważ, który rodzaj mikroskopii fluorescencyjnej i jakie powiększenie są najbardziej odpowiednie do uchwycenia pożądanego zjawiska. Stosuj mikroskopię szerokopolową oraz obiektywy o niskim powiększeniu, aby rejestrować światło z większej głębokości ostrości, utrzymywać ostrość w czasie, obrazować większe obiekty, takie jak całe zalążki, lub używać sensorów ratiometrycznych, które są podatne na artefakty przesunięcia chromatycznego. Stosuj CLSM lub 2PEM z obiektywami o wysokim powiększeniu dla lepszej rozdzielczości obiektów komórkowych i subkomórkowych, pamiętając jednak o trudnościach w utrzymaniu ostrości w czasie.</li>
	<li>Oszacuj liczbę próbek do obrazowania w jednym eksperymencie. Na przykład, stosując obiektyw 10x z minimalnym czasem próbkowania wynoszącym ~30 s dla obrazowania trzech przegród, można obrazować do 40 zdarzeń zapłodnienia na eksperyment, biorąc pod uwagę czas wymagany na działanie funkcji autofokusa i wieloetapowej akwizycji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki do kiełkowania pyłku
<ol>
	<li>Przygotować płynną pożywkę do kiełkowania pyłku (5mM CaCl2, 1mM MgSO4, 5mM KCl, 0.01% [w/v] H3BO3 oraz 10% [w/v] sacharozy), wykorzystując 1 M roztwory stokowe każdego z mikroelementów, przechowywane w temperaturze −20 °C. Dostosować pH do wartości 7.5 za pomocą 0.1 M KOH. Przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C do 2 tygodni. 
	UWAGA: Wartość pH może z czasem spadać.</li>
	<li>Dodać 2.5 mL płynnej pożywki do zlewki o pojemności 10 mL, a następnie powoli dodać 32 mg agarozy o bardzo niskiej temperaturze topnienia (~1.3%), stosując szybko obracający się mieszadło magnetyczne, aby uniknąć powstawania grudek.</li>
	<li>Stopić agarozę na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C, a następnie delikatnie poruszać zlewką, aby zebrać kondensat ze ścianek.</li>
	<li>Pipetować 130 µL pożywki do otworu o średnicy 14 mm w szklanej płytce dennej o średnicy 35 mm i obracać płytką, aż pożywka pokryje cały otwór.</li>
	<li>Odssać pipetą łącznie 40 µL z centrum płytki, pozostawiając całkowitą objętość 90 µL. 
	UWAGA: Z otworu można odessać więcej pożywki, aby uzyskać mniejszą objętość całkowitą; może być to konieczne w przypadku obiektywów o dużym powiększeniu i krótkiej odległości roboczej. Należy jednak pamiętać, że im cieńsza warstwa agaru, tym szybciej będzie wysychać.</li>
	<li>Schłodzić płytkę na bloku aluminiowym w komorze wilgotnościowej, aby zapewnić równomierne chłodzenie. Przechowywać płytki przez noc w temperaturze 4 °C do wykorzystania następnego dnia rano.</li>
</ol>
3. Określanie stadium rozwoju kwiatów dawców przegrody, dawców zniesienia i dawców pyłku
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig01.jpg" /> 
Rysunek 1:&#160;Etapy rozwoju kwiatów dawców przegrody, dawców znaku oraz dawców pyłku. (A)&#160;Etapy rozwoju kwiatów Arabidopsis (Ler-0)&#160;w kwiatostanie. Pąki w stadium 12B, które posiadają płatki tuż przed otwarciem i żółte, niepękające pylniki, należy wykastrować poprzez usunięcie wszystkich działek kielicha, płatków i pręcików. Słupki (zawierające marker gametofitu żeńskiego) można następnie wykorzystać jako dawców przegrody po 24 h. (B)&#160;Etapy rozwoju kwiatów Arabidopsis (Col-0) w kwiatostanie. Pąki w stadium 12B, które posiadają żółte, niepękające pylniki i znaki ledwie wyłaniające się z płatków, należy wykastrować poprzez usunięcie wszystkich działek kielicha, płatków i pręcików. Słupki można następnie wykorzystać jako dawców znaku po 24 h, kiedy powinny zostać zapylone przez kwiaty (zawierające marker gametofitu męskiego), które są otwarte i uwalniają pyłek. Zapylone znaki należy wypreparować w ciągu 1 h od zapylenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Rano, przed obrazowaniem, wybierz rośliny Arabidopsis, które będą służyć jako donory przegród oraz donory zniesienia; upewnij się, że są zdrowe i niedawno zaczęły wytwarzaćtorebki. 
	UWAGA: Landsberg erecta (Ler-0) jest odpowiednim ekotypem do roli donora przegród, ponieważ jego przegrody są wytrzymałe, a między zalążkami znajdują się krótkie międzywęźla. Columbia (Col-0) jest dobrym ekotypem do roli donora zniesienia, ponieważ wydaje się sprzyjać wzrostowi rurek pyłkowych.</li>
	<li>Wykonaj emaskulację co najmniej trzech kwiatów donora przegród w stadium 12B oraz 12 kwiatów donora zniesienia w stadium 12B poprzez usunięcie pręcików, działek i płatków (Rysunek 1A, B). Usuń również starsze kwiaty z tego samego kwiatostanu, które mogłyby potencjalnie zapylić emaskulowany kwiat.</li>
	<li>Rano, 24 h później, zapyl donory zniesienia kwiatami donora pyłku (np. posiadającymi markery rurek pyłkowych lub komórek plemników), które obficie uwalniają pyłek. Zapylenie jest zakończone, gdy zniesienia są niemal całkowicie pokryte pyłkiem (Rysunek 1B).</li>
</ol>
4. Disekcja przegrody
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Krótki przewodnik po sekcji przegrody i znaku. (A)&#160;Etapy sekcji przegrody. Przypiąć słupik do dwustronnej taśmy za pomocą igły strzykawki insulinowej i wykonać nacięcia w miejscu połączenia szyjki z zalążnią oraz zalążni z szypułką, a następnie wykonać płytkie nacięcie wzdłuż przegrody dowolnej liścienicy (Krok 1). Odchylić ścianki liścienicy i przykleić je do taśmy (Krok 2). Przeciąć replum pod górną przegrodą (Krok 3). Przeciąć przegrodę na wysokości szyjki i usunąć ją pęsetą przy szypułce (Krok 4). Umieścić przegrodę na podłożu agarowym i delikatnie wcisnąć pęsetą. (B)&#160;Etapy sekcji znaku. Przypiąć słupik (zapylony &#60;1 h wcześniej) do dwustronnej taśmy i odciąć w miejscu połączenia szyjki z zalążnią za pomocą żyletki (Krok 6). Umieścić znak na podłożu agarowym przy pomocy igły insulinowej obok przegrody i ustawić odległość na około 250 µm (Kroki 7-8). Upewnić się, że wokół mikropyli i podstawy szyjek tworzy się półpłynna kałuża (Krok 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Trzydzieści minut po zapyleniu zebrać zdrowe i dojrzałe słupki będące dawcami przegrody, odcinając je na poziomie szypułki, a następnie umieścić je na świeżej dwustronnej taśmie klejącej zamocowanej na szkiełku przedmiotowym, tak aby znamię wystawało tuż poza krawędź taśmy. 
	UWAGA: Należy ograniczyć czas preparowania słupków na taśmie klejącej do niezbędnego minimum. Preparowanie powinno odbywać się przy wysokiej wilgotności, którą można uzyskać, ustawiając nawilżacz obok szkiełka.</li>
	<li>Mocno przytwierdzić słupek do taśmy, delikatnie dociskając szypułkę i ścianki zalążni tylną częścią nowej igły strzykawki insulinowej, a następnie usunąć pozostałości działek, płatków i pręcików pozostałe po kastracji.</li>
	<li>Pod stereomikroskopem, używając igły strzykawki insulinowej, wykonać dwa nacięcia na każdy słupek w miejscu połączenia szyjki z zalążnią oraz zalążni z szypułką, a następnie wykonać płytkie nacięcia wzdłuż przegrody każdego słupka (Rysunek 2, krok 1). 
	UWAGA: Zbyt głębokie nacięcie wzdłuż przegrody spowoduje odcięcie zalążków w miejscu funikulusu.</li>
	<li>Ostrożnie odchylić ścianki zalążni na taśmę (Rysunek 2, krok 2), a następnie delikatnie wsunąć igłę między dwie przegrody, aby przeciąć replum na całej długości słupka, nie naruszając zalążków (Rysunek 2, krok 3). 
	UWAGA: Replum należy przeciąć w kierunku od szyjki do szypułki, aby w jak najmniejszym stopniu naruszyć zalążki znajdujące się na górnej przegrodzie.</li>
	<li>Delikatnie przeciąć górną przegrodę zarówno w miejscu połączenia z szyjką, jak i z szypułką, a następnie usunąć przegrodę pęsetą, zaczynając od strony szypułki (Rysunek 2, krok 4). 
	UWAGA: Nacięcie powinno być proste i delikatne, aby przegroda pozostała płaska i nie wygięła się.</li>
	<li>Umieścić przegrodę jak najpłaskiej na podłożu w taki sposób, aby mikropyle zalążków były skierowane do góry i znajdowały się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Delikatnie docisnąć przegrodę do podłoża, aż zalążki zostaną w nim lekko zatopione (Rysunek 2, krok 5). 
	UWAGA: Kluczowe jest rozmieszczenie przegrody w taki sposób, aby mikropyle zalążków były dostępne dla rurek pyłkowych (ewentualnie niedostępne zalążki można delikatnie przesunąć igłą). Po zatopieniu wokół przegrody powinna utworzyć się niewielka kałuża cieczy.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.1-4.6 dla maksymalnie dwóch kolejnych słupków, układając przegrody jedna za drugą.</li>
</ol>
5. Disekcja znamięn
<ol>
	<li>Umieść zapylone słupki dawcze na świeżej dwustronnej taśmie klejącej zamocowanej na szkiełku przedmiotowym w taki sposób, aby miejsce połączenia zalążni z szyjką znajdowało się poza krawędzią taśmy (Rycina 2, krok 6).</li>
	<li>Używając nowej żyletki, przetnij szyjkę pionowo w dół i podnieś ją, aby pozostawić znamię przyczepione do ostrza (Rycina 2, krok 6). 
	UWAGA: Aby uzyskać najczystsze cięcie, tnij na krawędzi taśmy.</li>
	<li>Usuń znamię z ostrza za pomocą igły strzykawki insulinowej i ułóż je płasko w odległości około 250-300 µm od zalążków (Rycina 2, kroki 7-8). 
	UWAGA: Szyjka powinna być zorientowana poziomo na boku; w przeciwnym razie większość lulek pyłkowych będzie rosła w dół pod przegrodą. Po 1 min lying on the medium powinna pojawić się mała kropla cieczy u wejścia do szyjki; jest to dobry znak, ponieważ lulek pyłkowych będą miały łatwe wyjście z szyjki.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.1-5.3 dla maksymalnie 12 znamion, umieszczając po dwa po każdej stronie każdej przegrody. Szukaj małej kropli cieczy tworzącej się wokół mikropyle zalążków; ułatwia to dostęp i kierowanie lulek pyłkowych do worków zarodkowych (Rycina 2, krok 9). 
	&#8203;UWAGA: Ogranicz czas, przez który szalka pozostaje otwarta, aby zapobiec wysychaniu podłoża i zalążków.</li>
</ol>
6. Obrazowanie
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig04.jpg" /> 
Rycina 3: Schemat obrazowania SIV cum septum. (A)&#160;Pełna konfiguracja SIV cum septum z 12 zapylonymi zniesieniami i 3 przegrodami, widziana przez stereomikroskop. (B)&#160;Połączone obrazy pełnej konfiguracji SIV cum septum przedstawionej w A, wykonane 5 h po inkubacji przy użyciu obiektywu 10x, z zaznaczonymi pięcioma obszarami przeglądu (~1 mm każdy) do wieloetapowej akwizycji. Zielone ramki wskazują zalążki, do których dotarły rurki pyłkowe ulegające gwałtownemu pęknięciu w synergidach. (C)&#160;Zbliżenie obszaru przeglądu 2 w różnych punktach czasowych. Około 3 h po inkubacji w komorze wilgotnościowej na mikroskopie rurki pyłkowe powinny dotrzeć w okolice mikropyli, a do 6 h obrazowania większość zalążków powinna prawidłowo przyjąć rurki pyłkowe (zielone kwadraty); zalążki te następnie ulegają gwałtownemu pęknięciu rurki pyłkowej (gwiazdka). Paski skali = (A) 5 mm, (B,C) 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Po zakończeniu sekcji i przygotowaniu szalki do obrazowania, należy inkubować ją w komorze wilgotnościowej na mikroskopie, utrzymując względną wilgotność na poziomie 92% i temperaturę 21 °C. 
	UWAGA: Jeśli mikroskop nie posiada komory wilgotnościowej, wyłożenie zewnętrznych krawędzi pokrywki i szalki niewielką ilością wody pomoże utrzymać wysoką wilgotność wewnątrz szalki.</li>
	<li>Ustawić ostrość próbek w świetle jasnego pola przy niskim natężeniu światła, a następnie przełączyć na światło fluorescencyjne i zaznaczyć na obrazie przekrojowym preparatu obszary przeznaczone do obrazowania. 
	UWAGA: Przy powiększeniu 10x można zaznaczyć około pięciu obszarów dla łącznie trzech przegród (Rycina 3). Należy ograniczyć czas zaznaczania obszarów przekrojowych, aby zminimalizować fototoksyczność lub nagrzewanie próbki przez światło fluorescencyjne.</li>
	<li>Rozpocząć obrazowanie, stosując wieloetapowy schemat akwizycji z funkcją autofocusu na początku każdego obszaru przekrojowego. Ponieważ rurki pyłkowe wyłaniają się ze słupka ok. 1 h po inkubacji próbki, akwizycję należy opóźnić o 2 h lub do momentu, aż rurki pyłkowe dotrą do mikropyle. Należy upewnić się, że autofocus jest ustawiony w zakresie 100 µm (kroki grube 7 µm i kroki precyzyjne 1 µm), aby utrzymać zawiązki w ostrości, gdy przegrody będą się z czasem lekko przesuwać i zapadać.</li>
	<li>Przerwać akwizycję obrazów ok. 9 h po rozpoczęciu inkubacji próbki, ponieważ do tego czasu większość zawiązków powinna przyciągnąć i przyjąć rurkę pyłkową. 
	UWAGA: Jeśli niewielka liczba zawiązków przyciąga rurki pyłkowe, pomocna może być uważna obserwacja szalki pod stereoskopem w celu ustalenia, jak można poprawić orientację zawiązków lub słupka w kolejnych próbach.</li>
</ol>

<ol><li>Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+mutant+feronia+disrupts+the+female+gametophytic+control+of+pollen+tube+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception.</a> Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).</li>
<li>Rotman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+control+of+male+gamete+delivery+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).</li>
<li>Palanivelu, R., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+short-range+ovule+signals+attract+or+repel+Arabidopsis+thaliana+pollen+tubes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro.</a> BMC Plant Biology. 6, 7(2006).</li>
<li>Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+F-actin+dynamics+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+changes+dynamically+during+the+interaction+of+the+pollen+tube+with+synergid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells.</a> Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).</li>
<li>Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium+dialog+mediated+by+the+FERONIA+signal+transduction+pathway+controls+plant+sperm+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery.</a> Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).</li>
<li>Denninger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-female+communication+triggers+calcium+signatures+during+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis.</a> Nature Communications. 5, 4645(2014).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+calcium+spikes+during+double+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis.</a> Nature Communications. 5, 4722(2014).</li>
<li>Ponvert, N., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergid+calcium+ion+oscillations+define+a+new+feature+of+pollen+tube+reception+critical+for+blocking+interspecific+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Manuskrypt ten wprowadza skuteczny protokół obrazowania odbioru łagiewki pyłkowej i podwójnego zapłodnienia u Arabidopsis. Ulepszona metoda, SIV cum septum, znacznie zwiększa odsetek i całkowitą liczbę udanych przyjęć łagiewek pyłkowych, które można zaobserwować podczas jednej sesji obrazowania. Reprezentatywne wyniki pokazane tutaj pokazują sesję obrazowania z 41 udanymi zdarzeniami odbioru łagiewki pyłkowej i 10 zalążkami wykazującymi defekty odbioru (wydajność ~80%). Jest to ponad dwukrotnie więcej n...

Generacja genetycznie unikalnego potomstwa w organizmach rozmnażających się płciowo zależy od udanej fuzji gamet męskich i żeńskich. U roślin kwitnących interakcja dwóch męskich gamet (plemników) z dwiema żeńskimi gametami (komórką jajową i komórką centralną) podczas podwójnego zapłodnienia zależy od uwalniania plemników z łagiewki pyłkowej (gametofitu męskiego). Proces ten, zwany odbiorem łagiewki pyłkowej, jest w dużej mierze kontrolowany przez synergiczne komórki, które znajdują się w woreczku zarodkowym (żeński gametofit)1,2. Ponieważ odbiór łagiewki pyłkowej odbywa się głęboko wewnątrz kwiatu, ustalono metodę pozwalającą na obrazowanie tego procesu żywymi komórkami, zwaną odbiorem łagiewki pyłkowej semi-in vitro (SIV)3. Dzięki tej metodzie wycięte zalążki Arabidopsis umieszcza się na półpłynnej pożywce do kiełkowania pyłku i celuje w łagiewki pyłkowe, które rosną przez znamię i styl słupka przeciętego na skrzyżowaniu szlaku przenoszącego styl3,4. Od czasu opracowania tej techniki, szczegółowe obserwacje doprowadziły do kilku odkryć dotyczących prowadzenia, przyjmowania i nawożenia łagiewki pyłkowej. Odkrycia te obejmują między innymi nabycie kompetencji łagiewki pyłkowej do celowania poprzez wzrost poprzez stigma3, początek wewnątrzkomórkowych oscylacji wapnia w synergidach po przybyciu łagiewki pyłkowej5,6,7,8,9, oraz dynamika uwalniania i zapłodnienia plemników po pęknięciu łagiewki pyłkowej10. Niemniej jednak, ponieważ ta technika opiera się na wycinaniu zalążków, obserwacje zapłodnienia są ograniczone w liczbie, a odbiór łagiewki pyłkowej jest często nieprawidłowy, co skutkuje niepowodzeniem pęknięcia łagiewki pyłkowej (Wideo 1 i Plik Uzupełniający 1). W związku z tym istnieje potrzeba bardziej wydajnego podejścia pozwalającego na wysokoprzepustowe analizy odbioru i nawożenia łagiewki pyłkowej.
Podczas opracowywania tego protokołu, przetestowano kilka nowych podejść do analizy odbioru łagiewki pyłkowej, od metod najbardziej "in vitro" do najbardziej "in vivo", i zdecydowano się na efektywną technikę opartą na wycięciu całej przegrody, która pozwala na do 40 obserwacji zapłodnienia dziennie. W tym miejscu nakreślone są niuanse i krytyczne punkty techniki, w tym etap kwitnienia, preparacja, przygotowanie podłoża i ustawienia obrazowania. Postępując zgodnie z tym protokołem, należy ułatwić badania koncentrujące się na prowadzeniu łagiewki pyłkowej, odbiorze łagiewki pyłkowej i podwójnym zapłodnieniu. Oczekuje się, że wyższe wielkości próbek, na które pozwala ta metoda, wzmocnią naukową poprawność wniosków wyciągniętych z eksperymentów obrazowania na żywo. Potencjalne zastosowania tej techniki obejmują między innymi prowadzenie obserwacji zmian molekularnych i fizjologicznych w stężeniach wapnia w cytozolach ([Ca2 + ]cyt), pH lubH2O2 podczas interakcji gametofitów za pomocą genetycznie kodowanych bioczujników. Co więcej, zmiany cytologiczne, takie jak zwyrodnienie receptywnego synergydu, migracja plemników lub kariogamia, można łatwiej zaobserwować przy użyciu tej ulepszonej metody. Wreszcie, czas różnych etapów zapłodnienia może być monitorowany pod mikroskopią szerokokątną, a następnie można przeprowadzić bardziej szczegółowe analizy za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) lub mikroskopii wzbudzenia dwufotonowego (2PEM) w celu uzyskania wyższej rozdzielczości i rekonstrukcji 3D.

<table><tbody><tr><td>Szkiełko 1 mm&nbsp;</td><td>Epredia&nbsp;</td><td></td><td></td>16211551</tr><tr><td>35 mm szklane naczynie dolne (studnia 14 mm)</td><td>Mattek&nbsp;</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia&nbsp;</td><td>Roth&nbsp;</td><td>CN93.1</td><td></td></tr><tr><td>Columbia (Col-0)&nbsp;</td><td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td><td></td>zakres preparacyjny <td>dawcy stygmatów</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td>SZX2-ILLT</td><td></td></tr><tr><td>Igła do insuliny (0,3 G)</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Landsberg erecta (Ler-0)&nbsp;</td><td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td><td></td><td>dawca przegrody</td></tr> ustnej <tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Merck</td><td>5886</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Beldura</td><td>7026797</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna szkocka&nbsp;</td><td>Scotch</td><td>768720</td><td>Mniej gęsty i dobry do rozwarstwiania znamion</td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Odczynniki ITW</td><td>A2211,1000</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna Tesa&nbsp;</td><td>Tesa</td><td>05681-00018</td><td>Bardzo lepka i dobra do rozwarstwiania przegrody</td></tr><tr><td>nosowej Agaroza o bardzo niskiej temperaturze żelowania</td><td>FMC SeaPrep</td><td>50302</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo odbioru łagiewki pyłkowej rzodkiewnika i podwójnego zapłodnienia metodą semi-in vitro cum septum

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

U roślin kwitnących, wzrost i prowadzenie łagiewki pyłkowej (męskiego gametofitu) w słupku oraz odbiór łagiewki pyłkowej przez żeński gametofit są niezbędne do podwójnego zapłodnienia i późniejszego rozwoju nasion. Interakcje między męskimi i żeńskimi gametofitami podczas odbioru łagiewki pyłkowej kończą się pęknięciem łagiewki pyłkowej i uwolnieniem dwóch plemników w celu podwójnego zapłodnienia. Ponieważ wzrost łagiewki pyłkowej i podwójne zapłodnienie są głęboko ukryte w tkankach kwiatu, proces ten jest trudny do zaobserwowania in vivo.
Metoda semi-in vitro (SIV) do obrazowania zapłodnienia na żywych komórkach w modelowej roślinie Arabidopsis thaliana została opracowana i wdrożona w kilku badaniach. Badania te pomogły wyjaśnić podstawowe cechy procesu zapłodnienia u roślin kwitnących oraz jakie zmiany komórkowe i molekularne zachodzą podczas interakcji gametofitów męskich i żeńskich. Ponieważ jednak te eksperymenty z obrazowaniem żywych komórek obejmują wycinanie pojedynczych zalążków, są one ograniczone do niewielkiej liczby obserwacji na sesję obrazowania, co sprawia, że podejście to jest żmudne i bardzo czasochłonne. Wśród innych trudności technicznych często zgłasza się niepowodzenie łagiewek pyłkowych w zapłodnieniu zalążków in vitro, co poważnie komplikuje takie analizy.
Tutaj dostępny jest szczegółowy protokół wideo do obrazowania odbioru i zapłodnienia łagiewki pyłkowej w sposób zautomatyzowany i wysokoprzepustowy, co pozwala na maksymalnie 40 obserwacji odbioru i pęknięcia łagiewki pyłkowej na sesję obrazowania. W połączeniu z wykorzystaniem genetycznie kodowanych bioczujników i linii markerowych, metoda ta umożliwia generowanie dużych rozmiarów próbek przy zmniejszonym nakładzie czasu. Niuanse i punkty krytyczne techniki, w tym etap kwitnienia, rozwarstwienie, przygotowanie podłoża i obrazowanie, są wyraźnie szczegółowo opisane w formacie wideo, aby ułatwić przyszłe badania nad dynamiką prowadzenia, przyjmowania i podwójnego nawożenia łagiewki pyłkowej.

Aby ocenić czas degeneracji jądrowej w receptywnym synergydzie w odniesieniu do pęknięcia łagiewki pyłkowej u Arabidopsis, a także zaobserwować, czy lewy czy prawy synergid jest predestynowany do stania się receptywnym synergidem, zastosowano opisaną tutaj metodę SIV cum septum przy użyciu żeńskiego markera jądrowego gametofitu połączonego z synergicznym markerem cytozolowym (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) jako dawca przegrody i męski marker gametofitu (pLAT52:R-GECO) jako d...

Tutaj opisujemy ulepszenie metody semi-in vitro (SIV) do obserwacji naprowadzania i odbioru łagiewki pyłkowej u Arabidopsis thaliana, co zwiększa podatność zalążków. Wysokoprzepustowa metoda SIV cum septum może być połączona z liniami markerowymi gametofitów i genetycznie kodowanymi biosensorami w celu monitorowania dynamicznego procesu zapłodnienia.

Obrazowanie na żywo odbioru łagiewki pyłkowej rzodkiewnika i podwójnego zapłodnienia metodą semi-in vitro cum septum

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...

Metoda ta ułatwi badania nad rozmnażaniem płciowym u rzodkiewnika, umożliwiając obserwację interakcji gametofitów z wysoką wydajnością i dużą liczbą próbek na sesję obrazowania. Główną zaletą tej techniki jest utrzymanie zalążków na przegrodzie, dzięki czemu ilość i chłonność zalążków jest znacznie zwiększona w porównaniu z poprzednimi metodami. Technika preparacji może być początkowo trudna i wymaga pewnej ręki.Dlatego zaleca się kilka razy poćwiczyć na wykastrowanych słupkach przed rozpoczęciem eksperymentu. Zacznij od przygotowania pożywki do kiełkowania pyłku, jak wyjaśniono w tekście. Po całkowitym stopieniu agaru odpipetować 130 mikrolitrów pożywki do 14-milimetrowego dołka naczynia ze szklanym dnem o grubości 35 milimetrów.Obracaj naczynie, aż podłoże przykryje studzienkę. Odessać 40 mikrolitrów pożywki ze środka naczynia za pomocą pipety, pozostawiając 90 mikrolitrów pożywki. Aby zapewnić równomierne schłodzenie podłoża, schłodzić naczynie na aluminiowym bloku w komorze wilgotnościowej przed przechowywaniem talerzy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Rano przed obrazowaniem wybierz zdrowe rośliny Arabidopsis, które niedawno zaczęły produkować jako dawcy przeg

live-imaging-arabidopsis-pollen-tube-reception-double-fertilization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Imprinting jest zjawiskiem występującym w reprodukcji roślin i ssaków. Metylacja DNA odgrywa istotną rolę w mechanizmach imprintingu. Izolacja endospermy oraz określenie stanu metylacji genów podlegających imprintingowi u Arabidopsis mogą być trudne. W niniejszym protokole opisujemy, jak izolować endospermę i określać poziom metylacji za pomocą sekwencjonowania z bisulfitem.

Wyznaczanie metylacji DNA genów imprintowanych w endospermie Arabidopsis

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

Pokazujemy metodę określania udanego lub nieudanego zapłodnienia na podstawie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

Ten protokół opisuje przygotowanie nienaruszonych próbek warstwy komórek bielma w nasionach Arabidopsis thaliana. Metoda wymaga jedynie powszechnego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak igła do wstrzykiwań i precyzyjne kleszcze, i umożliwia obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek bielma w wysokiej rozdzielczości zarówno w rozwijających się, jak i dojrzałych nasionach.

Przygotowanie nienaruszonej tkanki do analizy mikroskopowej warstwy komórek bielma w rozwijających się i dojrzałych nasionach Arabidopsis

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Jest to protokół wysokoprzepustowej krio konserwacji plemników rybek zebrafish. Plemniki krio konserwowane zgodnie z tym protokołem wykazują średnią płodność na poziomie 25% podczas późniejszego zapłodnienia in vitro i pozostają stabilne przez wiele lat.

Wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

Poznaj ulepszoną metodę semi-in vitro cum septum do badania odbioru łagiewki pyłkowej i podwójnego zapłodnienia u Arabidopsis thaliana. Technika zwiększa odbiorczość zalążków i umożliwia obserwację interakcji gametofitów z wysoką wydajnością.

Obrazowanie na żywo odbioru łagiewki pyłkowej rzodkiewnika i podwójnego zapłodnienia metodą semi-in vitro cum septum

Przeglądaj więcej filmów