Name: Implantacja minipompy osmotycznej w celu zwiększenia stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Poznaj technikę implantacji minipompy osmotycznej w mózgu myszy w celu zwiększenia stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym bez wpływu na glikemię. Metoda umożliwia badanie wpływu glukozy na funkcje poznawcze i neurodegenerację.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Narodowe Instytuty Zdrowia przyznają DK124619 KHC.
Fundusze na rozpoczęcie działalności i nagroda za badania pilotażowe, Wydział Medyczny, University of Rochester, NY, dla KHC.
Nagroda Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, University of Rochester, dla KHC.
University Research Award, Biuro Wiceprezesa ds. Badań, University of Rochester, NY, dla KHC.
MUR zaprojektował i wykonał metodę, przeanalizował wyniki, przygotował wykresy i rysunki oraz napisał i zredagował manuskrypt. KHC wymyślił i nadzorował badanie, przeanalizował wyniki oraz napisał i zredagował manuskrypt. Gwarantem tej pracy jest KHC. Ostateczna wersja manuskryptu została zaakceptowana przez wszystkich autorów.

Wszystkie procedury na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie w Rochester i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych dotyczącymi humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt doświadczalnych. Sześciotygodniowe samce myszy C57BL/6J wykorzystane w tym badaniu zostały uzyskane komercyjnie. Wszystkie zwierzęta umieszczono w grupie (5 myszy w klatce) w pomieszczeniu z 12-godzinnym cyklem dnia i nocy, a także zapewniono im dostęp do pożywienia i wody ad libitum. Po tym, jak myszom wszczepiono kaniulę do wlewania glukozy do komory bocznej, umieszczono je w pojedynczym pomieszczeniu, aby zapobiec uszkodzeniom implantów przez inne myszy.
1. Montaż minipomp osmotycznych
<ol>
	<li>Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) zgodnie z następującym protokołem. Rozpuścić NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g), CaCl2,2H 2O (0,206 g) i MgCl2,6H 2O (0,163 g) w 500 ml sterylnej wody, aby przygotować roztwór A. Rozpuść Na2HPO4,7H 2O (0,214 g) i NaH2PO4. H2O (0,027 g) w 500 ml sterylnej wody w celu przygotowania roztworu B. Następnie wymieszaj roztwór A i B w stosunku 1:1, aby przygotować aCSF. 
	UWAGA: Ten preparat aCSF nie zawiera glukozy.</li>
	<li>Aby przygotować 50% roztwór glukozy, dodaj 50 g glukozy do 50 ml aCSF w zlewce. Umieścić zlewkę na płycie grzejnej i doprowadzić temperaturę zawiesiny do 60 °C. Wymieszać zawiesinę z mieszadłem magnetycznym aż do całkowitego rozpuszczenia glukozy.</li>
	<li>Dodaj płyn CSF do zlewki, aby ostateczna objętość wynosiła 100 ml. Przepuść roztwór przez filtr porowy 0,22 μm, aby go wysterylizować.</li>
	<li>Przygotować 0,9% roztwór soli fizjologicznej (NaCl) i przepuścić roztwór przez filtr 0,22 μm.</li>
	<li>Umieść wszystkie elementy minipompy i zestawu infuzyjnego na sterylnej tacy, a następnie przyciąć rurkę z zestawu do infuzji mózgu do 1 cala za pomocą sterylnych nożyczek. Przytrzymaj rurkę sterylnym hemostatem i wciśnij ją na wierzch jednego końca kaniuli. Podłącz drugi koniec rurki do górnej części modulatora przepływu. Przykryj oba końce rurki niewielką ilością kleju, aby uzyskać mocniejsze połączenie.</li>
	<li>Podłączyć igłę o sile 27 g do strzykawki o pojemności 1 ml i napełnić ją płynem mózgowo-rdzeniowym lub roztworem glukozy. Włożyć igłę 27 G do małego kawałka rurki. Następnie podłącz rurkę do otwartego końca modulatora przepływu i napełnij ją odpowiednim roztworem, aż krople roztworu zaczną wypływać z kaniuli. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w przewodach.</li>
	<li>Aby napełnić minipompkę, należy trzymać pompę pionowo i włożyć igłę strzykawki do pompy. Napełnij go odpowiednim roztworem, aż kropla roztworu zacznie tworzyć się przy otworze minipompy.</li>
	<li>Powoli włóż modulator przepływu do pompy, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza do zespołu.</li>
	<li>Po zmontowaniu minipomp osmotycznych przenieś je do stożkowej rurki o pojemności 50 ml. Napełnij probówkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej, tak aby pompy były całkowicie zanurzone, upewniając się, że kaniula nie znajduje się w roztworze soli fizjologicznej. Cztery tak zmontowane pompy można umieścić w jednej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Luźno umieścić nakrętkę na każdej probówce i inkubować pompy w temperaturze 37 °C, aby zalać je przez co najmniej 48 godzin.</li>
</ol>
2. Chirurgia wszczepienia pomp osmotycznych
<ol>
	<li>Postępowanie przedoperacyjne
	<ol>
		<li>Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie i pozwól im ostygnąć przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Warunki panujące w autoklawie obejmują sterylizację parą wodną w temperaturze 121 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Zdezynfekuj obszar operacji 70% etanolem. Wytrzyj gałki, nauszniki i powierzchnię ramy stereotaktycznej. 
		UWAGA: Zabieg chirurgiczny powinien być wykonywany w aseptycznym środowisku, pamiętając o unikaniu dotykania niesterylnych powierzchni podczas wykonywania zabiegu. Wymień rękawice, jeśli istnieje podejrzenie zanieczyszczenia.</li>
		<li>Umieść mysz w komorze anestezjologicznej, aby znieczulić ją 3% izofluranem zmieszanym z powietrzem przez 3-5 minut. Następnie wyjmij mysz z komory i połóż ją na sterylnej zasłonie. Utrzymuj znieczulenie przez stożek nosowy na poziomie 1,5%-2%.</li>
		<li>Uszczypnij tylną łapę myszy, aby zaobserwować wszelkie odruchy i sprawdzić głębokość znieczulenia.</li>
		<li>Wstrzyknąć 5 mg/kg karprofenu podskórnie w celu znieczulenia.</li>
		<li>Użyj czystych maszynek do strzyżenia, aby przypiąć obszar operacyjny na głowie myszy. Nacierać skórę głowy najpierw roztworem jodu powidonu, a następnie dokładnie wacikami nasączonymi alkoholem przez co najmniej 2 minuty. Powtórz ten proces co najmniej trzy razy.</li>
		<li>Zastosuj lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>chirurgia
	<ol>
		<li>Umieść mysz na ramie stereotaktycznej i dopasuj głowę do siekacza. Zakryj nos stożkiem nosowym. Zastosuj sterylne obłożenia, aby zabezpieczyć obszar operacyjny.</li>
		<li>Przesunąć przepływ izofluranu do stożka nosowego. Kontynuuj utrzymywanie znieczulenia na poziomie 1,5%-2% izofluranu.</li>
		<li>Umieść poduszkę grzewczą pod myszką, aby utrzymać temperaturę ciała.</li>
		<li>Załóż nowe sterylne rękawiczki i skalpelem wykonaj nacięcie w linii środkowej (o długości ~10-15 mm) na skórze głowy. Odsłoń powierzchnię czaszki szpatułką, używając bawełnianych końcówek, aby wytrzeć krwawienie. 
		UWAGA: Użyj kauteryzatora, jeśli obfite krwawienie, co zdarza się rzadko.</li>
		<li>Przetrzyj bawełnianą końcówką zamoczoną w 3% nadtlenku wodoru, aby odsłonić szwy czaszkowe.</li>
		<li>Zanotuj bregmę i lambdę, aby poruszać się po współrzędnych czaszki. Ustaw wszystkie współrzędne na zero w bregma. 
		UWAGA: Te współrzędne zostały uzyskane z atlasu mózgu myszy atlas14. Referencyjna odległość bregma-lambda w atlasie wynosi 4,21 mm. Aby skorygować różnice w wielkości czaszki w zależności od wieku i płci, zmierzono odległość bregma-lambda dla każdej myszy, a następnie podzielono ją przez 4,21 mm, aby uzyskać współczynnik mnożenia. Na przykład, jeśli odległość między bregmą a lambdą wynosiła 4,65 mm, dzielenie przez 4,21 mm dawało współczynnik mnożenia 1,10. Wszystkie współrzędne uzyskane z atlasu zostały następnie pomnożone przez ten współczynnik, aby zmierzyć rzeczywiste współrzędne, które zostały użyte do wywiercenia otworu. W powyższym przykładzie wynikowe współrzędne przednio-tylne (AP) i przyśrodkowo-boczne (ML) wynosiłyby odpowiednio 0,55 i 1,1 mm (tj. 1,1 x 0,5 lub 1 mm).</li>
		<li>Użyj wiertarki elektrycznej, aby zrobić otwór na tych współrzędnych: 0,5 mm za bregmą i 1 mm od linii bocznej do środkowej w prawo. 
		UWAGA: Podczas wiercenia otworu w czaszce należy uważać, aby nie rozerwać opony twardej. Upewnij się, że wiertło jest sterylne. Można go umieścić wraz z innymi narzędziami w tej samej torbie autoklawu w celu sterylizacji.</li>
		<li>Wprowadzić hemostat pod naciętą skórę i wepchnąć go do miejsca, w którym zostanie wszczepiona minipompa osmotyczna. Delikatnie otwórz i zamknij hemostat, aby zrobić kieszeń na minipompkę.</li>
		<li>Użyj sterylnego hemostatu, aby wybrać zalaną minipompę osmotyczną z końcówki modulatora przepływu. Przepchnąć pompkę przez naciętą skórę do kieszeni. 
		UWAGA: Uważaj, aby laktator i kaniula nie dotykały żadnej niesterylnej powierzchni.</li>
		<li>Nałóż trochę kleju na spód kaniuli i zamocuj go w uchwycie kaniuli. Powoli opuść kaniulę przez wywiercony otwór 2 mm brzusznie do powierzchni czaszki. Pozostaw go tam na co najmniej 5 minut, aby klej stwardniał.</li>
		<li>Przed włożeniem kaniuli do mózgu upewnij się, że kaniula nie jest zatkana i że roztwór przepływa prawidłowo. 
		UWAGA: Czasami glukoza może osadzać się na końcówce kaniuli z powodu bardzo niskiego natężenia przepływu, blokując przepływ.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek przypnij górną część kaniuli, upewniając się, że nie odrywa się od powierzchni czaszki.</li>
		<li>Przykryj kaniulę warstwą cementu dentystycznego, aby uzyskać dodatkowe wsparcie.</li>
		<li>Użyj nylonowych szwów (rozmiar 5-0 i 30 cali długości), aby zamknąć ranę i nałożyć miejscowy antybiotyk na ranę, aby zapobiec infekcji.</li>
		<li>Wyłącz izofluran i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu. Następnie przenieś zwierzę do nowej, czystej klatki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opieka pooperacyjna
	<ol>
		<li>Po zabiegu monitoruj mysz przez co najmniej 1 tydzień.</li>
		<li>Podawać 5 mg/kg karprofenu podskórnie, raz na 24 godziny przez trzy dni po zabiegu.</li>
		<li>Pozwól ranie całkowicie się zagoić przed usunięciem szwów 7-10 dni po zabiegu. 
		UWAGA: Zaobserwowano, że myszy z wysokim poziomem glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym goiły się dłużej. Przycinanie pazurów na tylnych łapach myszy minimalizuje ryzyko zranienia miejsca nacięcia z powodu drapania myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wymiana minipomp
UWAGA: Ponieważ minipompy użyte w tym badaniu działają tylko przez 4 tygodnie, przetestowano również wymianę minipomp w celu przedłużenia czasu trwania infuzji glukozy, co może być wymagane w przypadku badań długoterminowych. Wiązało się to z następującymi krokami.
<ol>
	<li>Przygotuj myszy do operacji, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Wykonaj małe pionowe nacięcie o długości 1 cm w skórze nieco powyżej pompy.</li>
	<li>Włożyć hemostat pod naciętą skórę i wyciągnąć pompę.</li>
	<li>Wyjmij pompę z przewodu i podłącz nową zalaną pompę do przewodu.</li>
	<li>Włóż pompkę z powrotem do środka i zszyj skórę.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z tymi samymi instrukcjami pielęgnacji pooperacyjnej, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
4. Procedura zbierania płynu mózgowo-rdzeniowego
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Pociągnij szklane kapilary o średnicy 1 mm za pomocą ściągacza do mikropipet, aby uzyskać końcówki o średnicy 0,5 mm. Ustawienia to: ciepło = 800, ciąg = 15, prędkość = 5 i czas = 200 jednostek. Umieść wyciągnięte naczynia włosowate w sterylnym pudełku do czasu użycia.</li>
		<li>Podłączyć igłę 27 G do strzykawki o pojemności 1 ml. Umieść naciągniętą kapilarnę na igle i użyj małej taśmy klejącej, aby zabezpieczyć połączenie.</li>
		<li>Mocno zamocować strzykawkę w uchwycie kapilarnym mikromanipulatora.</li>
		<li>Następnie przygotuj mysz do zabiegu, zgodnie z opisem w powyższej procedurze przedoperacyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabiegu chirurgicznego
	<ol>
		<li>Umieść mysz na ramce stereotaktycznej. Po zamocowaniu głowy na ramie, jak opisano wcześniej, obróć pokrętła, aby przechylić głowę tak, aby nos był skierowany w dół. Zastosuj sterylne obłożenia, aby zabezpieczyć obszar operacyjny.</li>
		<li>Wykonaj małe nacięcie na powierzchni grzbietowej, zaczynając od płaszczyzny wewnątrzusznej do strony ogonowej. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić rurki podczas wykonywania nacięcia.</li>
		<li>Zdejmij podpórkę z korpusu myszy i pozwól myszy spoczywać pionowo, tak aby szyja była całkowicie wyciągnięta grzbietowo.</li>
		<li>Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie przetnij tylne mięśnie szyi od linii środkowej, aby stworzyć małe okno. Następnie użyj aplikatora z mokrą bawełnianą końcówką, aby delikatnie przesunąć mięśnie szyi od linii środkowej do obwodu.</li>
		<li>Obserwuj, czy odsłonięta jest cisterna magna, która wygląda jak trójkątne okno z przezroczystą membraną opony twardej.</li>
		<li>Umieść zespół mikromanipulatora na ramie stereotaktycznej obok myszy, upewniając się, że końcówka kapilary nie dotyka żadnej powierzchni.</li>
		<li>Delikatnie rozbij końcówkę kapilarną, nie zakłócając konfiguracji.</li>
		<li>Patrząc w lupę (powiększenie 2,25x), obracaj odpowiednimi pokrętłami na mikromanipulatorze, aby powoli wyrównać i przesunąć końcówkę kapilary w kierunku cysterny wielkiej.</li>
		<li>Pewien opór jest odczuwalny, gdy końcówka kapilary dotknie membrany cisterna magna. Bardzo powoli dociśnij końcówkę do membrany za pomocą pokręteł. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić żadnych naczyń krwionośnych w błonie. Ten krok jest bardzo ważny, aby uniknąć zanieczyszczenia krwi w płynie mózgowo-rdzeniowym.</li>
		<li>Bardzo delikatnie przebij membranę. Płyn mózgowo-rdzeniowy zacznie natychmiast wpływać do kapilary z powodu podciśnienia w kapilarze.</li>
		<li>Pozostaw ustawienie na kilka minut, aż w kapilarze zbierze się ~10 μl płynu mózgowo-rdzeniowego.</li>
		<li>Następnie powoli wyciągnij kapilarnę z cisterna magna i delikatnie dociśnij sterylny bawełniany aplikator końcówką do otworu cisterna magna, aby zatrzymać wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego.</li>
		<li>Ostrożnie wyjąć kapilarę ze strzykawki i przymocować ją do dozownika z mikronasadką. Naciśnij bańkę, aby przenieść płyn mózgowo-rdzeniowy do sterylnej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Umieść podpórkę pod myszą i obróć pokrętła stereotaktyczne, aby wypoziomować głowę.</li>
		<li>Zamknij ranę nylonowymi szwami.</li>
		<li>Wstrzyknąć podskórnie 300 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej przed wyjęciem myszy z aparatu.</li>
		<li>Zapewnij zwierzętom opiekę pooperacyjną zgodnie z powyższym opisem, aż nadejdzie czas na usunięcie szwów - ~ 7-10 dni po zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Test glukozy
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w zestawie do testów kolorymetrycznych glukozy.</li>
	<li>Rozcieńczyć podstawowy roztwór buforowy fosforanu sodu dostarczony w zestawie do stężenia 50 mM w ultraczystej wodzie.</li>
	<li>Przygotować wzorce glukozy w zakresach 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 i 50 mg/dl z roztworu podstawowego 1 000 mg/dl dostarczonego w zestawie w rozcieńczonym roztworze buforowym.</li>
	<li>Przygotować 7-krotne rozcieńczenie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego w buforze. Na przykład, jeśli całkowita zebrana objętość płynu mózgowo-rdzeniowego wynosi 10 μl, to siedmiokrotnie rozcieńczona objętość wyniesie 70 μl.</li>
	<li>Odpipetować 15 μl wzorców glukozy i rozcieńczyć płyn mózgowo-rdzeniowy w dwóch egzemplarzach na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Odpipetować 85 μl rozcieńczonego buforu do każdej z studzienek z wzorcami i płynem mózgowo-rdzeniowym.</li>
	<li>Dodać 6 ml rozcieńczonego buforu do fiolki z mieszaniną enzymów kalorymetrycznych glukozy i wirować przez kilka sekund, aby dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Dodać 100 μl preparatu mieszaniny enzymów do każdego dołka, aby rozpocząć reakcję.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę arkuszem pokrywy i delikatnie postukaj w płytkę, aby wymieszać odczynniki.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut. Fiolki z wysokim poziomem glukozy natychmiast zaczynają zmieniać kolor na fioletowy.</li>
	<li>Po 10 minutach zdjąć pokrywę i zmierzyć absorbancję przy 500-520 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
	<li>Obliczyć stężenie glukozy w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego, interpolując ich wartości z krzywej wzorcowej.</li>
</ol>
6. Oznaczanie stężenia glukozy we krwi
<ol>
	<li>Wykonaj małe boczne nacięcie na ogonie myszy za pomocą żyletki i użyj kropli krwi, aby zmierzyć poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru, zgodnie z instrukcjami instrukcji.</li>
</ol>

<ol><li>Moheet, A., Mangia, S., Seaquist, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+diabetes+on+cognitive+function+and+brain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Impact of diabetes on cognitive function and brain structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1353, 60-71 (2015).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-accelerated+memory+dysfunction+via+cerebrovascular+inflammation+and+Abeta+deposition+in+an+Alzheimer+mouse+model+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Diabetes-accelerated memory dysfunction via cerebrovascular inflammation and Abeta deposition in an Alzheimer mouse model with diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (15), 7036-7041 (2010).</li>
<li>Arvanitakis, Z., Wilson, R. S., Bienias, J. L., Evans, D. A., Bennett, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+risk+of+Alzheimer+disease+and+decline+in+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and risk of Alzheimer disease and decline in cognitive function.</a> Archives of Neurology. 61 (5), 661-666 (2004).</li>
<li>Zilliox, L. A., Chadrasekaran, K., Kwan, J. Y., Russell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+and+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Diabetes and cognitive impairment.</a> Current Diabetes Reports. 16 (9), 87(2016).</li>
<li>Reno, C. M., Litvin, M., Clark, A. L., Fisher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+counterregulation+and+hypoglycemia+unawareness+in+diabetes%3A+mechanisms+and+emerging+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Defective counterregulation and hypoglycemia unawareness in diabetes: mechanisms and emerging treatments.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 42 (1), 15-38 (2013).</li>
<li>Cryer, P. E., Davis, S. N., Shamoon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoglycemia+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Hypoglycemia in diabetes.</a> Diabetes Care. 26 (6), 1902-1912 (2003).</li>
<li>Hwang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoglycemia+unawareness+in+type+1+diabetes+suppresses+brain+responses+to+hypoglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hypoglycemia unawareness in type 1 diabetes suppresses brain responses to hypoglycemia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1485-1495 (2018).</li>
<li>Cryer, P. E., Gerich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+counterregulation%2C+hypoglycemia%2C+and+intensive+insulin+therapy+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glucose counterregulation, hypoglycemia, and intensive insulin therapy in diabetes mellitus.</a> The New England Journal of Medicine. 313 (4), 232-241 (1985).</li>
<li>Tigchelaar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cerebrospinal+fluid+glucose+levels+and+diabetes+mellitus+are+associated+with+activation+of+the+neurotoxic+polyol+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Elevated cerebrospinal fluid glucose levels and diabetes mellitus are associated with activation of the neurotoxic polyol pathway.</a> Diabetologia. 65 (7), 1098-1107 (2022).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+in+type+2+diabetic+db%2Fdb+mice+may+be+associated+with+brain+region-specific+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline in type 2 diabetic db/db mice may be associated with brain region-specific metabolic disorders.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (1), 266-273 (2017).</li>
<li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+db%2Fdb+mice+exhibit+central+nervous+system+and+peripheral+molecular+alterations+as+seen+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Diabetic db/db mice exhibit central nervous system and peripheral molecular alterations as seen in neurological disorders.</a> Translational Psychiatry. 3 (5), 263(2013).</li>
<li>Wang, Y., Yang, Y., Liu, Y., Guo, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+impairments+in+type+1+diabetes+mellitus+model+mice+are+associated+with+synaptic+protein+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Cognitive impairments in type 1 diabetes mellitus model mice are associated with synaptic protein disorders.</a> Neuroscience Letters. 777, 136587(2022).</li>
<li>Jolivalt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+exaggerates+features+of+Alzheimer%27s+disease+in+APP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes exaggerates features of Alzheimer's disease in APP transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 223 (2), 422-431 (2010).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Paxinos+and+Franklin%27s+The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Vinik, A. I., Maser, R. E., Mitchell, B. D., Freeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+autonomic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Diabetic autonomic neuropathy.</a> Diabetes Care. 26 (5), 1553-1579 (2003).</li>
<li>Furman, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptozotocin-induced+diabetic+models+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats.</a> Current Protocols. 1 (4), 78(2021).</li>
<li>Grieb, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+streptozotocin+injections+as+a+model+of+Alzheimer%27s+disease%3A+in+search+of+a+relevant+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular streptozotocin injections as a model of Alzheimer's disease: in search of a relevant mechanism.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1741-1752 (2016).</li>
<li>Kealy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+alters+brain+energy+metabolism+in+mice+and+humans%3A+role+in+suppressed+spontaneous+activity%2C+impaired+cognition%2C+and+delirium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation alters brain energy metabolism in mice and humans: role in suppressed spontaneous activity, impaired cognition, and delirium.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (29), 5681-5696 (2020).</li>
<li>Dougherty, J. M., Roth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+spinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Emergency+Medicine+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cerebral spinal fluid.</a> Emergency Medicine Clinics of North America. 4 (2), 281-297 (1986).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

W artykule przedstawiono szczegółowy protokół zwiększania stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym u myszy za pomocą minipomp osmotycznych połączonych z kaniulą wszczepioną w komorę boczną. Przewlekły wlew glukozy w mózg myszy za pomocą tej procedury będzie przydatny w określeniu wpływu długotrwałej hiperglikoryzji na funkcje poznawcze, ogólnoustrojowy metabolizm glukozy i równowagę energetyczną oraz w lepszym zrozumieniu patogenezy powikłań cukrzycy.
Przewlekła cukrzyca powoduje uszkodzen...

Zarówno cukrzyca typu 1, jak i typu 2 upośledzają funkcjonowanie mózgu1,2,3. Na przykład cukrzyca zwiększa ryzyko pogorszenia funkcji poznawczych i zaburzeń neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera3,4. Co więcej, osoby z cukrzycą mają wadliwe wykrywanie glukozy w mózgu5,6. Ta wada przyczynia się do patogenezy nieświadomości związanej z hipoglikemią i niewystarczającej odpowiedzi przeciwregulacyjnej na hipoglikemię7,8, która może być śmiertelna, jeśli nie zostanie natychmiast leczona.
Biorąc pod uwagę, że cukrzyca zwiększa poziom glukozy we krwi, jak również w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF)9, ważne jest ustalenie, czy jeden czy oba te czynniki przyczyniają się do upośledzenia funkcji mózgu. To, czy cukrzyca powoduje uszkodzenie mózgu przez wysoki poziom glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym, samodzielnie, czy w połączeniu z innymi czynnikami, takimi jak niedobór insuliny lub insulinooporność, jest również kwestią otwartą. Modele zwierzęce cukrzycy typu 1 i typu 2 wykazują pogorszenie funkcji poznawczych i neurodegenerację, a także zaburzony bilans energetyczny i obwodowy metabolizm glukozy10,11,12,13. Jednak na podstawie tych modeli nie jest możliwe oddzielenie selektywnego wpływu wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym w porównaniu z poziomem glukozy we krwi w pośredniczeniu w powikłaniach cukrzycy na funkcjonowanie mózgu.
Ten protokół opisuje metody rozwoju mysiego modelu hiperglikory w celu przetestowania wpływu chronicznie wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowym na funkcjonowanie mózgu, bilans energetyczny i homeostazę glukozy. Model mysi opracowany za pomocą tej techniki stanowi narzędzie do badań badających etiologiczną rolę rozregulowanej homeostazy glukozy na funkcje neuronalne i behawioralne.
Dlatego proponowane podejście będzie przydatne w zrozumieniu bezpośrednich skutków podwyższonego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym w różnych stanach patofizjologicznych.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Roztwory membranowe</td><td>SFPES030022S</td><td></td></tr><tr><td>1 ml sterylna strzykawka (końcówka Luer-lok)</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1 ml strzykawka TB</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Szklana zlewka</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolu (Koptec)</td><td>DLI</td><td>UN170</td><td>Użyj 70% rozcieńczenia do oczyszczenia obszaru operacyjnego</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Wskaźnik zapłonu</td><td>KOPF</td><td>1905</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do infuzji mózgu Alzet</td><td>DURECT</td><td>Zestaw # 3; 0008851</td><td>Przyciąć rurki w zestawie do 1 cala długości</td></tr><tr><td>Pompa osmotyczna Alzet</td><td>DURECT</td><td>2004</td><td>Natężenie przepływu 0,25 &mikro; L/h</td></tr><tr><td>System anestezjologiczny</td><td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Betadine solution</td><td>Avrio Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 . 2H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt kaniuli</td><td>KOPF</td><td>1966</td><td></td></tr><tr><td>Zakres centrowania</td><td>KOPF</td><td>1915</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do cementu</td><td>dentystycznego Lang Dental</td><td>REF1404</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny w proszku</td><td>Lang Dental</td><td>REF1220-C</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka elektryczna</td><td>KOPF</td><td>1911</td><td>Podczas wiercenia otworu unikaj pęknięcia opony twardej</td></tr><tr><td>Smar do oczu (Optixcare)</td><td>CLC Medica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator z kulkami szklanymi (Germinator 500)</td><td>VWR</td><td>101326-488</td><td>Umieść narzędzia w sterylnej wodzie, aby ostygły przed operacją</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania glukozy</td><td>Cayman chemiczny 10009582</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009-500ml</td><td>Nałóż 3% H2O2 na powierzchnię czaszki, aby szwy czaszkowe były widoczne.</td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów</td><td>WAHL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>poduszka grzewcza</td><td>Heatpax</td><td>19520483</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Fluriso)</td><td>Zoetis</td><td>NDC1385-046-60</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>0395-500g</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>WPI</td><td>M1</td><td></td></tr><tr><td>Powiększająca lampa biurkowa</td><td>Brightech</td><td>LightView Pro Flex 2</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa szpatułka</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 . 6H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator (praworęczny)</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator z wyświetlaczem cyfrowym</td><td>KOPF</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 . 7H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5Kg</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 . H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Johnson & Johnson</td><td>N/A</td><td>Stosować miejscowo maść zapobiegającą infekcji</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>DM-999</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (karprofen) 50 mg/ml</td><td>Zoetis</td><td>N/A</td><td>5 mg/kg, podskórnie, do analgezji</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny system allignacyjny</td><td>KOPF</td><td>1900</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna igła BD o rozmiarze 27 305109</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne aplikatory z końcówką bawełnianą (Solon)</td><td>AMD Medicom</td><td>56200</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne nici nylonowe (5.0)</td><td>Oasis</td><td>MV-661</td><td>Do zamykania rany należy stosować niechłonny szew</td></tr><tr><td>Sterylne ostre nożyczki&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/D</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne ostrza chirurgiczne</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne (nitryl)</td><td>Ammex</td><td>N/A</td><td>Zmień rękawice w przypadku podejrzenia zanieczyszczenia</td></tr><tr><td>Podajnik</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY</td><td></td></tr></tbody></table> DOTYCZY

implantacja minipompy osmotycznej w celu zwiększenia stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym myszy

Osmotic Minipump Implantation for Increasing Glucose Concentration in Mouse Cerebrospinal Fluid

Cukrzyca zwiększa ryzyko pogorszenia funkcji poznawczych i upośledza funkcjonowanie mózgu. To, czy ten związek między wysokim poziomem glukozy a deficytami poznawczymi jest przyczynowy, pozostaje nieuchwytne. Co więcej, nie jest również jasne, czy deficyty te są spowodowane wzrostem poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) i/lub krwi. Istnieje bardzo niewiele badań oceniających bezpośredni wpływ wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym na funkcję ośrodkowego układu nerwowego (OUN), zwłaszcza na uczenie się i pamięć, ponieważ obecne modele cukrzycy nie są wystarczająco rozwinięte, aby odpowiedzieć na takie pytania badawcze. W tym artykule opisano metodę przewlekłego zwiększania poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym przez 4 tygodnie poprzez ciągłe wlewanie glukozy do komory bocznej za pomocą minipomp osmotycznych u myszy. Protokół został zweryfikowany poprzez pomiar poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym. Protokół ten zwiększył poziom glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym do ~ 328 mg / dl po infuzji 50% roztworu glukozy przy szybkości przepływu 0,25 μl / h, w porównaniu ze stężeniem glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym wynoszącym ~ 56 mg / dl u myszy, które otrzymały sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF). Co więcej, protokół ten nie wpłynął na poziom glukozy we krwi. Dlatego metoda ta może być stosowana do określenia bezpośredniego wpływu wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym na funkcjonowanie mózgu lub określoną ścieżkę neuronalną niezależnie od zmian poziomu glukozy we krwi. Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj podejście ułatwi opracowanie modeli zwierzęcych do testowania roli wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym w pośredniczeniu w cechach choroby Alzheimera i/lub innych zaburzeń neurodegeneracyjnych związanych z cukrzycą.

Samcom myszom wszczepiono kaniulę połączoną z minipompą osmotyczną (Rysunek 1) w celu przewlekłego infuzyjnego podawania aCSF lub 50% roztworu glukozy do komór bocznych mózgu (Rysunek 2). Płyn mózgowo-rdzeniowy pobrano 10 dni po zabiegu (Rysunek 3) w celu potwierdzenia skuteczności tej procedury. Wyniki wykazały wzrost poziomu glukozy w CSF (średnia: 327,7 mg/dL) u myszy, którym podawano 50% glukozę, w porównaniu do poziomu (średnia...

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół zwiększania stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) myszy. Takie podejście może być przydatne do badania wpływu wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym na neurodegenerację, funkcje poznawcze i obwodowy metabolizm glukozy u myszy.

Implantacja minipompy osmotycznej w celu zwiększenia stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym myszy

Diabetes increases the risk of cognitive decline and impairs brain function. Whether or not this relationship between high glucose and cognitive deficits ...

Ta technika zwiększa poziom glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym lub płynie mózgowo-rdzeniowym u myszy bez wpływu na stężenie glukozy we krwi. Pomaga to w zbadaniu bezpośredniego wpływu wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym na funkcjonowanie mózgu zwierzęcia. Technika ta może stworzyć modele zwierzęce w celu zbadania teologicznej roli wyższego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym w dysfunkcji poznawczych.Doprowadziło to do odkrycia nowych celów molekularnych w celu poprawy funkcji poznawczych. Metoda pomoże również określić, czy wysoki poziom glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym jest wystarczający do pośredniczenia w fenotypach zaburzeń neurodegeneracyjnych u myszy. Należy zwrócić uwagę na prawidłowy montaż i przygotowanie kaniuli oraz wprowadzenie kaniuli do mózgu we właściwych współrzędnych.Aby rozpocząć operację implantacji minipompy osmotycznej, umieść znieczuloną mysz na ramie stereotaktycznej. Dopasuj głowę zwierzęcia do siekacza. Zakryj nos stożkiem nosowym, aby utrzymać znieczulenie i podłącz przepływ izofluoranu do stożka nosowego z szybkością 1,5 do 2%Umieść poduszkę grzewczą pod myszą, aby utrzymać temperaturę ciała.Po zdezynfekowaniu pola operacyjnego i wykonaniu nacięcia odsłoń powierzchnię czaszki szpatułką i przetrzyj ewentualną krew bawełnianymi końcówkami. Użyj kauteryzatora, jeśli obfite krwawienie. Przetrzyj bawełnianą końcówką zanurzoną w 3% nadtlenku wodoru, aby odsłonić szwy czaszki.Pracując pod mikroskopem, zwróć uwagę na bregmę i lambdę, aby nawigować po współrzędnych czaszki. Ustaw wszystkie współrzędne na zero w bregmie. Używając wiertarki elektrycznej ostrożnie i bez pękania opony twardej, wykonaj otwór we współrzędnych 0,5 milimetra za bregmą i 1 milimetr od linii bocznej do środkowej w prawo.Włóż hemostat i delikatnie otwórz i zamknij go, aby zrobić kieszeń na mini pompkę. Trzymając pompę od końcówki modulatora przepływu, przepchnij ją przez naciętą skórę do utworzonej kieszeni. Nałóż trochę kleju na spód kaniuli i zamocuj go w uchwycie kaniuli.Upewnij się, że kaniula nie jest zatkana, a roztwór przepływa prawidłowo. Następnie powoli opuść kaniulę przez wywiercony otwór, dwa milimetry brzusznie do powierzchni czaszki. Pozostaw go tam na co najmniej pięć minut, aby klej stwardniał.Za pomocą nożyczek przypnij górną część kaniuli, upewniając się, że nie odrywa się od powierzchni czaszki. Przykryj kaniulę warstwą cementu dentystycznego, aby uzyskać dodatkowe wsparcie. W celu pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego lub płynu mózgowo-rdzeniowego umieść odpowiednio znieczuloną mysz na ramie stereotaktycznej.Po zamocowaniu głowy na ramie, jak pokazano wcześniej, obróć pokrętła, aby przechylić głowę tak, aby nos był skierowany w dół. Po zdezynfekowaniu obszaru operacyjnego i wykonaniu nacięcia usuń podporę z ciała myszy i pozwól myszy odpocząć pionowo, tak aby szyja była całkowicie wyprostowana grzbietowo. Używając zakrzywionych, kleszczy, delikatnie przetnij tylne mięśnie szyi od linii środkowej, aby stworzyć małe okno.Następnie użyj aplikatora z mokrą bawełnianą końcówką, aby delikatnie przemieścić mięśnie szyi od linii środkowej do obrzeży. Obserwuj, czy cisterna magna jest odsłonięta jako trójkątne okno z przezroczystą membraną opony twardej. Umieść zespół mikromanipulatora na ramie stereotaktycznej obok myszy, upewniając się, że końcówka kapilary nie dotyka żadnej powierzchni.Delikatnie rozbij końcówkę kapilarną, nie zakłócając konfiguracji. Obróć odpowiednie pokrętła na mikromanipulatorze, aby powoli się wyrównać i przesuń końcówkę kapilary w kierunku cisterna magna. Pewien opór jest odczuwalny, gdy końcówka kapilary dotknie membrany cisterna magna.Bardzo powoli dociśnij końcówkę do membrany za pomocą pokręteł, uważając, aby nie uszkodzić żadnych naczyń krwionośnych w błonie. Gdy membrana jest przebijana, płyn mózgowo-rdzeniowy natychmiast wpływa do kapilary z powodu ujemnego ciśnienia kapilarnego. Pozostaw ustawienie na kilka minut, aż w kapilarze zbierze się około 10 mikrolitrów płynu mózgowo-rdzeniowego.Ostrożnie wyjąć kapilarę ze strzykawki i przymocować ją do dozownika z mikronasadką. Naciśnij bańkę, aby przenieść płyn mózgowo-rdzeniowy do sterylnej probówki z mikrowirówką. Umieść podpórkę pod myszą i obróć pokrętła stereotaktyczne, aby wypoziomować głowę.Zamknij ranę nylonowymi szwami. Wstrzyknąć podskórnie 300 mikrolitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej przed wyjęciem myszy z aparatu. Zapewnij zwierzętom opiekę pooperacyjną do czasu usunięcia szwów, około 7 do 10 dni po zabiegu.Płyn mózgowo-rdzeniowy pobrany 10 dni po operacji wykazał około sześciokrotny wzrost poziomu glukozy u myszy, którym podawano 50% glukozy w porównaniu z myszami, którym podawano płyn mózgowo-rdzeniowy. Jednak poziom glukozy we krwi nie różnił się między grupami. Opuszczając kaniulę w mózgu, cofnij ją do tyłu i sprawdź, czy płyn mózgowo-rdzeniowy wydostaje się z otworu.Istotne jest również prawidłowe rozpoznanie cisterna magna i zapobieganie zanieczyszczeniu płynu mózgowo-rdzeniowego krwią. Technika ta może być również stosowana do dostarczania dowolnego leku, który nie jest w stanie przekroczyć bariery krew-mózg, w celu przetestowania jego wpływu na funkcjonowanie mózgu. Istnieje bardzo ograniczona liczba zwierzęcych modeli cukrzycy, które zaburzają homeostazę glukozy w środowisku obwodowym.Model ten pomaga jednak badać specyficzne dla mózgu zmiany w regulacji glikemii na funkcje neuronalne.

osmotic-minipump-implantation-for-increasing-glucose-concentration

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wraz z ewolucją i wzrostem zaawansowania badań w dziedzinie neuronauki, analiza struktur i obwodów mózgowych wymaga coraz większej dokładności i wyższej rozdzielczości. Opracowaliśmy metodę przygotowania i implantacji przewlekłego systemu infuzyjnego w mózgu, wykorzystującą borokrzemianową mikrokanulę o średnicy końcówki wynoszącej 50 mikronów.

Konstrukcja i implantacja systemu mikroinfuzyjnego do przedłużonego podawania czynników neuroaktywnych.

Opracowano mikrofluidyczne urządzenie do perifuzji wysepek trzustkowych w celu oceny dynamicznego wydzielania insuliny przez wiele wysepek oraz jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego napływu jonów wapnia i zmian potencjału mitochondrialnego.

Wieloparametryczny system perfuzji wysepek w mikroprzepływowym urządzeniu perfuzyjnym

W tym filmie demonstrujemy montaż systemu infuzji mózgu za pomocą mikropompy osmotycznej, a następnie jego chirurgiczną implantację w czaszce myszy. System ten umożliwia ciągłe dostarczanie potencjalnych leków i ułatwia badanie ich wpływu na mózg i tkankę mózgową.

System ciągłego wlewu leków w modelu mysim: zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu systemu infuzyjnego pompy mikroosmotycznej w mózg myszy w celu ciągłego dostarczania leków

Ten film pokazuje wpływ ciągłego wlewu leku do mózgu myszy na poziom glukozy we krwi. Metabolizm glukozy ocenia się poprzez pobranie krwi z ogona myszy na czczo i pomiar poziomu glukozy przed i po doustnym podaniu glukozy. Tolerancję insuliny ocenia się poprzez wstrzyknięcie insuliny myszy, przy czym poziom glukozy jest rejestrowany w określonych odstępach czasu.

Ocena wpływu ciągłego wlewu leku do mózgu myszy na obwodowy poziom glukozy

Źródło: Wang, X. et. al., Dostarczanie leków oparte na pompie osmotycznej w badaniach remielinizacji in vivo na ośrodkowym układzie nerwowym. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia metodę dostarczania leków neuroterapeutycznych za pomocą pompy osmotycznej w zdemielinizowanym modelu myszy. Kontrolowane uwalnianie leku sprzyja remielinizacji poprzez aktywację komórek wytwarzających mielinę w ciele modzelowatym.

 Podawanie leków neuroterapeutycznych opartych na pompie osmotycznej w zdemielinizowanym modelu myszy

Aktywność pojedynczych neuronów u myszy w wieku dorosłym może być badana poprzez dysocjację neuronów z określonych regionów mózgu i użycie obrazowania barwnika potencjału błony fluorescencyjnej. Testując reakcje na zmiany poziomu glukozy, technika ta może być wykorzystana do badania wrażliwości na glukozę dorosłych brzuszno-przyśrodkowych neuronów podwzgórza.

Obrazowanie potencjału błonowego barwnika brzuszno-przyśrodkowego neuronów podwzgórza od dorosłych myszy w celu zbadania wykrywania glukozy

Aby zbadać reorganizację mózgu w warunkach patologicznych, użyliśmy pomp miniosmotycznych do bezpośredniego dostarczania białka do mózgu, omijając barierę krew-mózg. Następnie wstrzykuje się znaczniki dróg oddechowych w celu zbadania zmian w połączeniach mózgowych pod wpływem białka.

Implantacja pomp miniosmotycznych i dostarczanie znaczników dróg oddechowych w celu zbadania reorganizacji mózgu w stanach patofizjologicznych

Ten protokół bada rolę ligandu 5 (CCL5) chemokiny (motyw C-C) w podwzgórzu, dostarczając antagonistę, MetCCL5, do mózgu myszy za pomocą systemu infuzji mózgu za pomocą mikro-pompy osmotycznej. To przejściowe zahamowanie aktywności CCL5 przerwało sygnalizację insuliny w podwzgórzu, prowadząc do nietolerancji glukozy i obwodowej ogólnoustrojowej wrażliwości na insulinę.

Badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy

Przewlekłe podawanie izoproterenolu za pomocą wszczepionej pompy osmotycznej było szeroko stosowane do naśladowania zaawansowanej niewydolności serca u myszy. W tym miejscu opisano szczegółowe metody implantacji minipompy chirurgicznej do ciągłego podawania izoproterenolu przez 3 tygodnie, a także ocenę echokardiograficzną dla pomyślnego stworzenia modelu.

Implantacja minipompy izoproterenolu w celu wywołania niewydolności serca u myszy

Udostępniamy protokół do generowania farmakologicznego modelu myszy dystonii DYT/PARK-ATP1A3 poprzez wszczepienie kaniul do zwojów podstawy i móżdżku podłączonych do pomp osmotycznych. Opisujemy indukcję ruchów podobnych do dystonii poprzez zastosowanie wyzwania motorycznego i charakterystykę fenotypu za pomocą behawioralnych systemów punktacji.

Implantacja pomp osmotycznych i indukcja stresu w celu ustalenia objawowego, farmakologicznego modelu myszy dla dystonii DYT/PARK-ATP1A3

Demielinizacja ma miejsce w wielu chorobach ośrodkowego układu nerwowego. Niezawodna technika dostarczania leków in vivo jest niezbędna do remielinizacji testów leków. Protokół ten opisuje metodę opartą na pompie osmotycznej, która umożliwia długotrwałe dostarczanie leku bezpośrednio do miąższu mózgu i poprawia biodostępność leku, z szerokim zastosowaniem w badaniach nad remielinizacją.

Dostarczanie leków na bazie pompy osmotycznej do badań remielinizacji in vivo nad ośrodkowym układem nerwowym

Poznaj technikę implantacji minipompy osmotycznej w mózgu myszy w celu zwiększenia stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym bez wpływu na glikemię. Metoda umożliwia badanie wpływu glukozy na funkcje poznawcze i neurodegenerację.

Implantacja minipompy osmotycznej w celu zwiększenia stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym myszy

Przeglądaj więcej filmów