Ukierunkowana mikroiniekcja i elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych w celu modyfikacji genetycznej

Naszą dziedziną badań jest rozwój i ewolucja mózgu naczelnych. Staramy się zrozumieć czynniki leżące u podstaw ekspansji kory nowej u naczelnych. Aby odpowiedzieć na to pytanie w praktyczny i etycznie uzasadniony sposób, używamy organoidów mózgowych jako naszego modelu badawczego.

Ostatnio pojawiły się różnice w rozwoju mózgu między współczesnymi ludźmi, nami i neandertalczykami. Różnice te wynikają z niewielkiej liczby zmian aminokwasów w białkach odgrywających kluczową rolę w rozwoju mózgu. Organoidy mózgowe były kluczowym systemem modelowym w tych badaniach.

Badanie rozwoju naczelnych z ewolucyjnego punktu widzenia jest ważne, prowadzenie badań nad zyskiem i utratą funkcji. Jednak małpy człekokształtne, w tym ludzie, w sposób naturalny, nie mogą być wykorzystywane do takich eksperymentów, więc genetyczna modyfikacja organoidów odgrywa istotną rolę w tej dziedzinie. Pracując jako postdoc w moim laboratorium, Michael Heide wykazał, że ARHGAP11B genu specyficznego dla człowieka odgrywał kluczową rolę w zwiększaniu rozmiaru mózgu podczas ewolucji człowieka.

Jako lider grupy w Niemieckim Centrum Naczelnych, Michael wniósł kluczowe informacje, porównując organoidy mózgowe ludzi i szympansów. Nasz protokół oferuje ukierunkowane podejście do modyfikacji genetycznych poprzez specyficzne mikroiniekcyjne struktury przypominające komory zamiast komercyjnych kuwet do elektroporacji. Podejście to wykorzystuje ekonomiczną konfigurację, w tym elektroporator o fali prostokątnej i komorę elektrody na płytkę Petriego, zamiast drogich rozwiązań efektorów jądrowych.

Chociaż badanie funkcji i rozwoju mózgu u naczelnych za pomocą modyfikacji genetycznej jest technicznie możliwe, jest metodologicznie wymagające, kosztowne i niedozwolone w przypadku małp człekokształtnych. Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych zapewnia szybkie i ekonomiczne podejście do wprowadzania modyfikacji genetycznych w modelu zbliżonym do rozwoju mózgu naczelnych. W przyszłości chcielibyśmy skupić się na charakterystyce genów o zróżnicowanej ekspresji w korze mózgowej różnych gatunków naczelnych.

Będziemy badać te geny za pomocą elektroporacji organoidów mózgowych naczelnych i analizować ich potencjalny wpływ na komórki progenitorowe kory mózgowej. Na początek umyj wyhodowane iPSC preparatem Dulbecco PBS lub DPBS i dodaj jeden mililitr mieszaniny proteolitycznej i kolagenolitycznej. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby oderwać komórki.

Następnie dodaj 1,5 mililitra podgrzanej pożywki hodowlanej iPSC, aby zatrzymać reakcję. Oddziel komórki od naczynia do hodowli komórkowej, pipetując w górę iw dół od siedmiu do 10 razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.

Osadzać komórki w masie 200 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Zawiesić osad w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej iPSC uzupełnionej 50 mikromolowym Y27632. Teraz użyj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek, aby policzyć komórki za pomocą komory Neubauera.

Dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej do 9 000 komórek na 150 mikrolitrów za pomocą pożywki hodowlanej iPSC uzupełnionej 50 mikromolami Y27632. Aby wytworzyć ciała zarodkowe lub EB, potrząśnij rurką z zawiesiną komórki, aby zapobiec sedymentacji komórek przed wysianiem 150 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu. Hoduj EB w wilgotnej atmosferze przez 48 godzin.

Pod koniec inkubacji usuń 100 mikrolitrów pożywki z dołka i dodaj 150 mikrolitrów podgrzanej świeżej pożywki bez Y27632. Utwórz siatkę wgłębień 4 x 4 na parafilmie, umieszczając siatkę parafilmu na stojaku na probówki o pojemności 0,2 mililitra stroną pokrytą papierem skierowaną do góry i delikatnie dociśnij palec w rękawiczce do każdego otworu stojaka, aby osadzić EB w matrycy membrany podstawnej. Następnie usuń papier i wytnij siatkę wgłębień z kwadratu parafilmu za pomocą nożyczek, aby dostosować jej rozmiar tak, aby zmieściła się w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych.

Umieść wgłębienie do parafilmu z powrotem na stojaku na probówki o pojemności 0,2 mililitra, aby zapewnić podstawę do generowania kropelek macierzy membrany podstawnej. Ostrożnie przenieś EB jeden po drugim z dołka naczynia hodowlanego do wgłębień parafilmu za pomocą pipety z naciętą końcówką pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Po przeniesieniu 16 EB na siatkę, weź nową końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów i usuń pozostałą pożywkę z wgłębień.

Teraz odpipetuj jedną kroplę matrycy błony podstawnej na każde wgłębienie zawierające jeden EB. Weź końcówkę do pipety o pojemności 10 mikrolitrów i szybko przenieś EB do środka każdej kropli, nie naruszając granic kropli. Umieść wgłębiony parafilm z kroplami macierzy błony podstawnej w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowej i inkubuj przez 15 do 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić polimeryzację matrycy. Ponadto, aby odłączyć EB osadzone w matrycy od parafilmu, dodaj pięć mililitrów pożywki różnicującej bez witaminy A do naczynia i obróć parafilm do góry nogami za pomocą kleszczy tak, aby strona z EB była skierowana w stronę dna naczynia.

Ostrożnie potrząśnij naczyniem, aby odłączyć krople matrycy błony podstawnej zawierające EB z parafilmu. Jeśli niektóre z nich są nadal przymocowane, weź krawędź kwadratu parafilmu za pomocą kleszczy i szybko zwiń go kilka razy w kierunku środka naczynia. Następnie hoduj organoidy mózgowe na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 55 obr./min w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla i 95% powietrzem w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Utrzymuj organoidy w DM bez witaminy A z pożywką co drugi dzień. Pokazano jasny obraz ludzkiego organoida mózgowego po 32 dniach od wysiewu ze strukturami podobnymi do komór na obrzeżach i zwartą, zdrową morfologią. Zacznij od przygotowania wystarczającej ilości mieszanki do elektroporacji dla kontroli i genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Podłączyć komorę elektrody szalki Petriego do elektroporatora. Następnie, za pomocą końcówek do mikroładowarek, napełnij igły do mikroiniekcji ośmioma mikrolitrami każdej mieszanki elektroporacyjnej. Przed użyciem odetnij końcówki igieł, aby uzyskać stabilny przepływ za pomocą cienkich nożyczek.

Upewnij się, że usuwasz tylko niewielką część końcówki, ponieważ i szeroka końcówka może poważnie uszkodzić organoidy. Pod mikroskopem wybierz pięć organoidów mózgowych z gładkimi obwódkami i widocznymi strukturami przypominającymi komory. Następnie przenieś je do 35-milimetrowego naczynia do hodowli komórkowej zawierającego wstępnie podgrzany DMEM/F12 za pomocą wyciętej końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów.

Teraz ostrożnie wbij igłę przez ścianę struktury przypominającej komorę i napełnij ją mieszanką do elektroporacji, aż do widocznego napełnienia. Nie wywieraj nadmiernego nacisku na struktury przypominające komory, aby uniknąć pęknięcia. Przenieść jeden organoid mózgowy z mikrowstrzyknięciem do komory elektrody na szalkę Petriego z niewielką ilością DMEM/F12.

Ułóż organoid tak, aby powierzchnie mikroiniekcyjkowanych struktur przypominających komory były skierowane w stronę elektrody podłączonej do bieguna dodatniego elektroporatora. Teraz należy elektroporować organoidy mózgowe jeden po drugim za pomocą pięciu impulsów o napięciu 80 woltów przez 50 milisekund każdy, w odstępie jednej sekundy. Jeśli mikroiniekcja i elektroporacja zostały przeprowadzone w warunkach niesterylnych, należy przenieść elektroporowane organoidy pod kapturem z przepływem laminarnym do nowego 35-milimetrowego naczynia do hodowli komórek wypełnionego wstępnie podgrzanym DMEM/F12.

Następnie hoduj elektroporowane organoidy w DM z witaminą A na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 55 obr./min w wilgotnej atmosferze składającej się z 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia, po elektroporacji, sprawdź organoidy mózgowe pod kątem udanej elektroporacji pod konwencjonalnym odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Przenieś elektroporowane organoidy do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów za pomocą naciętej końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i usuń nadmiar pożywki.

Dodać odpowiednią ilość 4% paraformaldehydu do DPBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji odessać paraformaldehyd. Następnie dodaj pięć mililitrów DPBS, delikatnie wstrząśnij i odessaj DPBS.

Przechowywać organoidy w DPBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Dwa dni po elektroporacji komórki GFP-dodatnie są prawie wyłącznie zlokalizowane w strefie komorowej i są dodatnie dla PAX6, co wskazuje, że komórki te są epickimi przodkami lub podstawowymi przodkami noworodków. Po 10 dniach komórki GFP-dodatnie są zlokalizowane w obszarach podstawnych.

Komórki te są również dodatnie dla PAX6 lub NeuN, co wskazuje na podstawowe komórki progenitorowe lub neurony, respectively. 3D pokazano rekonstrukcję elektroporowanych organoidów mózgowych w celu uzyskania wrażenia rozkładu 3D komórek GFP-dodatnich.