Charakterystyka behawioralna mysiego modelu zespołu Angelmana
20 października 2023
Ten manuskrypt przedstawia zestaw wysoce powtarzalnych testów behawioralnych do walidacji mysiego modelu zespołu Angelmana.
Naszym celem jest wyjaśnienie fizjologicznych ról genów na przykładzie myszy jako modelu eksperymentalnego. Koncentrujemy się również na opracowywaniu mysich modeli konkretnych chorób, które naukowcy mogą wykorzystać do zbadania przyczyn chorób i opracowania skutecznych metod leczenia. Przykładem takiej aktywności jest mysi model zespołu Angelmana.
Prawdopodobnie najbardziej obiecującą nową technologią z potencjałem jest integracja sztucznej inteligencji opartej na technikach głębokiego uczenia się w badaniach na zwierzętach. Takie podejście można zastosować do bezpośredniego monitorowania zachowania zwierząt w klatce domowej, bez konieczności przeszkadzania zwierzętom przez eksperymentatora. Największym wyzwaniem w badaniach behawioralnych jest obecnie odtwarzalność.
Dlatego wprowadzamy zestaw testów, które weryfikują mysi model zespołu Angelmana w sposób, który nie zależy od wieku ani gatunku modela. Używamy sprawdzonych testów behawioralnych do walidacji naszego modelu AS, jednak z nowatorskim podejściem do rozwoju modelu bardzo przypominającym kondycję ludzką z dużą delecją. Korzystając z technologii CRISPR, usunęliśmy cały gen UBE3A z genomu myszy, w przeciwieństwie do innych modeli, w których delecja jest ograniczona do 3 KB.
Pracujemy nad opracowaniem terapii genetycznej, która mogłaby przywrócić wszelkie objawy w modelu mysim. Aby rozpocząć, umieść labirynt w kształcie plusa na platformie testowej tuż pod kamerą. Za pomocą potencjometru umieszczonego na ścianie wyreguluj natężenie światła do 70 luksów w jego środku za pomocą luksometru z czujnikiem umieszczonym na środku labiryntu podczas regulacji.
Otwórz oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania przeglądarki i załaduj konfigurację do testowania labiryntu z podwyższonym poziomem plus lub EPM, klikając ikonę w lewym górnym rogu karty konfiguracji. Wprowadź informacje o zwierzęciu w odpowiednich polach karty eksperymentu, w tym identyfikator zwierzęcia, genotyp, płeć i informacje o eksperymencie. Sprawdź, czy położenie strefy, otwarte ramiona i zamknięte ramiona są poprawnie skonfigurowane.
Za pomocą kontroli wizualnej i myszy komputerowej upewnij się, że wirtualne strefy konspektu są zgodne z odpowiednimi strefami EPM. Umieść kursor myszy na ikonie strzałki w lewym górnym rogu karty pozyskiwania. Wyjmij zwierzę z domowej klatki i delikatnie umieść je na środku EPM.
Rozpocznij eksperyment, klikając lewym przyciskiem myszy komputera. Po pięciu minutach zapisz zarejestrowane dane, klikając OK.Name plik i kliknij przycisk Zapisz. Eksportuj wyniki do pliku CSV w celu analizy offline, klikając ikonę w lewym panelu pionowym zakładki analizy danych.
W teście EPM żaden z parametrów związanych z zachowaniem podobnym do lęku nie uległ zmianie u matczynych heterozygotycznych mutantów UBE3A. Umieść cztery otwarte pola testowe lub pudełka testowe OF na platformie testowej pod kamerą. Za pomocą potencjometru na ścianie dostosuj natężenie światła do 200 luksów w środku każdego testu OF za pomocą luksomierza, z czujnikiem umieszczonym na środku każdego pudełka podczas regulacji.
Otwórz oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania przeglądarki i załaduj konfigurację do testowania OF, klikając ikonę w lewym górnym rogu karty konfiguracji. Wprowadź informacje o zwierzętach w odpowiednich polach zakładki eksperymentu. Sprawdź, czy położenie strefy jest zgodne z polami testowymi OF i dostosuj je w razie potrzeby.
Korzystając ze sterowania wizualnego i myszki komputerowej, upewnij się, że wirtualny konspekt środkowy i strefy peryferyjne są zgodne z odpowiednimi strefami testowymi OF. Umieść kursor myszy na ikonie strzałki w lewym górnym rogu karty pozyskiwania. Wyjmij cztery zwierzęta z klatki domowej i umieść je w rogu każdego pudełka testowego.
Rozpocznij eksperyment, klikając lewym przyciskiem myszy komputera. W teście OF heterozygotyczne zmutowane zwierzęta UBE3A były znacznie hipoaktywne, co znalazło odzwierciedlenie w krótszym pokonywanym dystansie, niższej średniej prędkości i dłuższym czasie odpoczynku. Jednak żaden z parametrów związanych z zachowaniem podobnym do lęku nie został zmieniony w mutantach UBE3A.
Podłącz klatkę zawieszenia ogonowego do komputera za pomocą USB. Podłącz klucz USB do komputera i uruchom oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania BIO TST. Na karcie ustawień w obszarze Globalne upewnij się, że czas trwania pobierania jest ustawiony na 360 sekund.
W zakładce Eksperyment wybierz nową listę badanych i utwórz nowy plik eksperymentu oraz nową listę badanych, postępując zgodnie z instrukcjami w otwartej zakładce. Przygotuj zwierzęta do testu, owijając jednostronną taśmą klejącą 3/4 ogona zwierzęcia, zaczynając od podstawy. Uruchom bieg, klikając przycisk Rozpocznij uruchamianie.
Następnie kontynuuj w zakładce akwizycja. Zaraz po zawieszeniu zwierzęcia na haku kliknij ikonę start pod wizualizowaną pozycją, aby pozyskać dane. Po przetestowaniu wszystkich zwierząt, w zakładce analiza wybierz ostatnie cztery minuty pozyskania do analizy.
Zaznacz wszystkie prawidłowe przebiegi w okresie analizy i kliknij przycisk Analizuj wybrane tematy. Wybierz żądany format danych i kliknij przycisk Eksportuj wybrane dane, aby wyeksportować zebrane dane. W teście zawieszenia ogona zmutowane zwierzęta UBE3A były unieruchomione znacznie dłużej niż ich rodzeństwo z miotu kontrolnego, co wskazuje na ich zachowanie podobne do depresji.
Włącz bieżnię i ręcznie ustaw prędkość taśmy na 20 centymetrów na sekundę na panelu sprzętu przed włączeniem suwaka aparatu. Uruchom oprogramowanie DigiGait Imager i ustaw czas otwarcia migawki na 100 dla myszy albinosów lub 130 dla czarnych lub ciemnych myszy w terenie dla czasu otwarcia migawki. Umieść mysz na pasie bieżni i potwierdź, że mysz może wykonać test, ustawiając ją na niską prędkość chodzenia na około trzy sekundy, a następnie zatrzymując ją, obserwując mysz w sposób ciągły.
Uruchom pasek, naciskając przycisk start i nagrywaj przez 10 sekund. Upewnij się, że można zaobserwować czystą i płynną lokomocję składającą się z co najmniej 10 do 15 kroków. Zatrzymaj pasek, naciskając przycisk stop i umieść mysz z powrotem w tymczasowej klatce do trzymania.
Zekranizuj nagranie pod kątem sekwencji obrazów z płynnymi krokami, klikając przycisk odtwarzania i przeglądając nagranie za pomocą kontrolki wizualnej w trybie edycji. Wybierz od 10 do 15 płynnych ruchów, ręcznie wpisując ich początkowe i końcowe numery klatek w odpowiednich polach. Wprowadź informacje o zwierzęciu, w tym identyfikator zwierzęcia, datę urodzenia, płeć, wagę, prędkość pasa i kąt nachylenia pasa.
Zapisz plik, klikając przycisk ZAPISZ. Następnie otwórz oprogramowanie DigiGait Analysis i przeprowadź analizę chodu w oparciu o w pełni zautomatyzowaną analizę nagrań wideo śladów zwierząt. Wskaźniki chodu zwierząt z mutacją UBE3A zostały zmienione.
Zmutowane zwierzęta UBE3A miały dłuższy zamach i postawę, co skutkowało wydłużeniem czasu trwania i długości kroku. Zwiększony został również napęd, czas trwania i spowolnienie tylnych kończyn myszy. Odkrycia te ujawniły również większy obszar łapy w pozycji szczytowej.
Włącz sprzęt rotarod i uruchom oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania pręta. Utwórz nowy plik w zakładce plik i zapisz go pod odpowiednią nazwą. W oknie konfiguracji wypełnij szczegóły eksperymentu, takie jak data, nazwa użytkownika i ewentualne komentarze.
Ustaw profil prędkości na 300 sekund, prędkość początkową na cztery prędkości na minutę, a prędkość końcową na 40 obr./min. Otwórz panel pomiarowy, klikając przycisk Zmierz. Rozpocznij początkowy obrót pręta przy czterech obrotach na minutę, klikając Start i umieść pierwsze pięć zwierząt w przypisanych im pozycjach.
Rozpocznij protokół testowy, klikając Start Profile, a pręt będzie stopniowo przyspieszał do 40 obr./min w ciągu pięciu minut. Gdy wszystkie zwierzęta spadną z pręta, zamknij okno pomiaru, klikając przycisk Zamknij, a następnie kliknij przycisk Pokaż, aby wyświetlić zebrane dane. Wyeksportuj pozyskane dane w formacie CSV, klikając Eksportuj CSV.
Wydajność Rotarod wykazała zmniejszone opóźnienie spadku u zwierząt z mutacją UBE3A. Weź bawełniane gniazdo za pomocą kleszczy i ręcznie zarejestruj jego wagę za pomocą wagi. Umieść gniazdo losowo w klatce, ale po przeciwnej stronie dopływu wody.
Waż każde gniazdo przez następne cztery dni ręcznie za pomocą wagi. Upewnij się, że gniazdo jest suche po zważeniu. Jeśli nie, wysuszyć na poduszce grzewczej.
Jeśli gniazdo jest rozdarte na kilka części, zważ największą część. Zapisz wagi na papierze lub w gotowym arkuszu kalkulacyjnym. Zmutowane zwierzęta UBE3A zużywały znacznie mniej materiału do budowy swoich gniazd, a różnica ta była szczególnie widoczna między transgenicznymi samicami a ich odpowiednikami kontrolnymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt przedstawia zestaw wysoko powtarzalnych testów behawioralnych służących do walidacji modelu mysiego zespołu Angelmana. Badanie podkreśla znaczenie powtarzalności w badaniach behawioralnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania behawioralne
- Zaburzenia genetyczne
Wstęp
- Zespół Angelmana jest zaburzeniem neurogenetycznym.
- Modele mysie są niezbędne do badania chorób genetycznych.
- Reprodukowalność stanowi główne wyzwanie w badaniach behawioralnych.
- Sztuczna inteligencja i głębokie uczenie mogą usprawnić monitorowanie behawioralne.
Cel badania
- W celu walidacji modelu mysiego dla zespołu Angelmana.
- W celu opracowania powtarzalnych testów behawioralnych.
- W celu ułatwienia badań nad przyczynami choroby i jej leczeniem.
Zastosowane metody
- Testy behawioralne zaprojektowane dla modeli mysich.
- Integracja AI w celu monitorowania zachowania zwierząt.
- Wykorzystanie obserwacji w klatkach domowych.
- Koncentracja na minimalizacji stresu i zakłócania spokoju zwierząt.
Główne wyniki
- Opracowanie powtarzalnych testów behawioralnych.
- Walidacja mysiego modelu zespołu Angelmana.
- Wykazanie użyteczności AI w badaniach behawioralnych.
- Wnioski dotyczące fizjologicznych ról genów.
Wnioski
- Badanie to stanowi podstawę dla przyszłych badań nad zespołem Angelmana.
- Powtarzalność w badaniach behawioralnych może zostać znacząco poprawiona.
- Technologie AI dają nadzieję na rozwój badań na zwierzętach.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rzetelne fenotypowanie behawioralne w genetycznie zmodyfikowanych modelach mysich jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka związanych z hipotezami dotyczącymi celów terapeutycznych oraz walidacji mechanizmów chorobowych w zaburzeniach neurogenetycznych, takich jak zespół Angelmana. Ta zwalidowana bateria testów behawioralnych umożliwia ilościową i powtarzalną ocenę fenotypów motorycznych, emocjonalnych i afektywnych, wspierając ciągłość translacyjną od wczesnej fazy odkryć po badania przedkliniczne. Ustandaryzowane wyniki tych testów służą do selekcji projektów w portfolio oraz budowania pewności co do mechanizmów działania w programach terapeutycznych ukierunkowanych na szlaki rozwoju neurologicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę zależności między genami a chorobami przy użyciu modeli o wysokiej trafności konstrukcyjnej.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez kwantyfikację deficytów behawioralnych istotnych dla danej choroby.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki powtarzalnemu wykrywaniu fenotypów w niezależnych liniach.
- Dostarcza obiektywnych danych służących do priorytetyzacji celów w ramach procesów opracowywania leków na zaburzenia neurorozwojowe.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia znormalizowane punkty końcowe zachowania dla późniejszego przesiewu związków.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki odpowiednie do porównań między badaniami.
- Umożliwia skalowalność testu i ponowne wykorzystanie platformy w wielu różnych tła genetycznych.
- Wspiera wiarygodną ocenę potencjalnych terapeutyków w zwalidowanych modelach chorób.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje przedkliniczne punkty końcowe zachowania z fenotypami chorób u ludzi w celu zapewnienia istotności translacyjnej.
- Zapewnia ciągłość od walidacji modelu genetycznego do przedklinicznych badań skuteczności.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez potwierdzenie walidacji konstrukcyjnej i walidacji pozornej modeli.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów dzięki ilościowym odczytom behawioralnym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy zestaw testów behawioralnych integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, zapewniając standaryzowane fenotypowanie niezbędne do walidacji celów terapeutycznych, identyfikacji wiodących związków oraz badań translacyjnych w programach dotyczących chorób neurogenetycznych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe testy behawioralne wyjaśniają hipotezy dotyczące funkcji genów i mechanizmów chorobowych.
- Przesiewy: Standaryzowane wyniki umożliwiają powtarzalną ocenę interwencji terapeutycznych.
- Analityka: Eksportowalne formaty danych wspierają rygorystyczną analizę statystyczną i porównywanie wyników między badaniami.
- Badania translacyjne: Punkty końcowe istotne dla choroby łączą wyniki przedkliniczne z symptomatologią kliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w instytucji: Zwalidowany schemat postępowania można dostosować do wielu linii myszy i konstruktów genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neurogenetycznych.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, powtarzalności i skalowalności w procesach fenotypowania behawioralnego.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych nad zaburzeniami neurorozwojowymi.
Kwestie dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu neuronauki behawioralnej oraz doświadczenie w pracy z modelami genetycznymi.
- Niezbędny jest dostęp do specjalistycznej aparatury oraz zwalidowanego oprogramowania do akwizycji i analizy danych.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów i formatów danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w różnych liniach myszy o konstrukcyjnej i zewnętrznej trafności dla zespołu Angelmana.
- Interpretacja wyników testu otwartego pola musi uwzględniać współistniejące deficyty motoryczne w modelach chorobowych.
Najczęściej zadawane pytania dot. Biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:37
Elevated Plus Maze Test in an Angelman Syndrome Mouse Model
3:24
Open Field Test in an Angelman Syndrome Mouse Model
5:04
Tail Suspension Test in an Angelman Syndrome Mouse Model
6:42
Gait Analysis in an Angelman Syndrome Mouse Model
8:47
Rotarod Test in an Angelman Syndrome Mouse Model
10:10
Nestlet Shredding: Nest Building Test in an Angelman Syndrome Mouse Model
