Charakterystyka transporterów u ssaków za pomocą testu transportu in vitro
2 czerwca 2023
Transport okazał się trudny do zmierzenia ze względu na słabe związki przyczynowo-skutkowe z funkcją białka i niską rozdzielczość czasową. Protokół ten opisuje metodę monitorowania, z wysoką rozdzielczością czasową, ekstruzji Zn2 + z żywych komórek przy użyciu wrażliwego barwnika fluorescencyjnego Zn2 +, zapewniając w ten sposób bezpośredni pomiar wypływu Zn2 +.
Moje badania koncentrują się na ustrukturyzowanej zależności funkcjonalnej transporterów u ssaków ze szczególnym uwzględnieniem mechanizmu regulacji. Ze względu na znaczenie jonów dla funkcjonowania komórek, uzyskanie dokładnego pomiaru komórkowej dynamiki jest trudne. Nasz protokół rozwiązuje problem niskiego stosunku sygnału do szumu i niskiej rozdzielczości czasowej dynamiki.
Metoda ta pozwala na badanie napływu przez błonę komórkową z wysoką rozdzielczością czasową i znacznie mniejszym szumem tła i interakcjami krzyżowymi przez inne kationy dwuwartościowe. Odkryliśmy, że nieustrukturyzowane rozszerzenie transportera ssaków ZnT-1, domena końcowa C nie jest zaangażowana w funkcję transportu. Dzięki temu naukowcy mogą skupić się na innych domenach białka ZnT-1 w celu regulacji transportu.
Rozpocznij od analizy transfekowanych komórek HEK293T za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Po skupieniu komórek, za pomocą światła jasnego pola przełącz się na fluorescencyjną falę wzbudzenia mCherry o długości fali 587 nanometrów i długości fali emisyjnej o długości 610 nanometrów. Po wyłączeniu światła jasnego pola sprawdź fluorescencję komórek, aby potwierdzić ekspresję ZnT-1 mCherry.
Aby przygotować roztwór do ładowania barwnika, weź cztery mikrolitry roztworu barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla. Następnie dodaj cztery mikrolitry 10% kwasu pluronowego. Wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieś go do probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Do przygotowanego roztworu dodać 750 mikrolitrów roztworu myjącego i energicznie wymieszać rurkę. Ponownie dodaj 750 mikrolitrów roztworu myjącego. Po zawirowaniu dodaj 750 mikrolitrów tego roztworu do dwóch dołków nowej sześciodołkowej płytki hodowlanej i przykryj ją folią aluminiową.
Za pomocą pęsety przenieś 13-milimetrowe szkiełko nakrywkowe z wcześniej hodowanej płytki HEK293T komórkowej na płytkę sześciodołkową. Po przykryciu płytki folią delikatnie potrząsaj nią przez 15 do 20 minut i zastąp roztwór nasycający barwnikiem przygotowanym roztworem myjącym. Po przykryciu talerza potrząsaj nim ponownie przez 20 minut.
Aby rozpocząć, włącz mikroskop, źródło światła, kamerę i system ssący. Do przemywania systemu perfuzyjnego należy użyć roztworu Ringera w pierwszej komorze i roztworu Ringera uzupełnionego pirytionianem w drugiej komorze. Po zamknięciu kranu napełnij komory tymi samymi roztworami.
Aby rozpocząć przygotowanie próbki, umieść komorę perfuzyjną wąską stroną rowka skierowaną do góry i nałóż silikon sufitowy wokół rowka. Następnie za pomocą cienkiej pęsety przenieś 13-milimetrowy szkiełko nakrywkowe z roztworu myjącego na wierzch rowka komórkami skierowanymi w dół. Umieść 22-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na 13-milimetrowym szkiełku nakrywkowym i dokręć je pęsetą, uważając, aby nie pęknąć szkiełek nakrywkowych.
Odwróć komorę i naciśnij ją, aby uwolnić płyny. Następnie wypełnij rowek 100 mikrolitrami roztworu myjącego Ringera. I naciśnij ponownie, upewniając się, że nie ma wycieków.
Zamontuj i zabezpiecz komorę perfuzyjną na platformie. Następnie przymocuj rurki perfuzyjne i ssące do perfuzji nad komórkami w rowku. Zmień szybkość perfuzji na około dwa mililitry na minutę i włącz perfuzję roztworu Ringera.
Aby wykonać pomiary, otwórz oprogramowanie do obrazowania. Ustaw powiększenie mikroskopu na 10X za pomocą lewego przycisku bocznego mikroskopu. Po wybraniu podglądu na żywo użyj joysticka, aby przesunąć platformę i skup się na komórkach w rowku.
Wybierz odpowiednią długość fali dla mCherry. Po zogniskowaniu komórek przesuń platformę, aby wybrać odpowiednie łaty komórek. Wybierz menu rozwijane Draw ROIs (Rysuj ROI).
Wybierz opcję Narysuj okrągłe ROI i narysuj ROI na klastrach komórek. z komórkami wyrażającymi mCherry. Utwórz nowe ROI poza pierwszym, przytrzymując przycisk Shift, a następnie naciskając i przeciągając istniejące ROI.
Wybierz opcję Rysuj zwrot z inwestycji w kwadratowe tło z menu rozwijanego i dostosuj lokalizację i rozmiar zwrotu z inwestycji w tle, w którym nie ma komórek. Po upewnieniu się, że w tle nie ma komórek ROI, przejdź do zakładki ND Acquisition. Wybierz kartę podrzędną Długość fali i zaznacz jej pole wyboru.
Upewnij się, że pole wyboru długości fali GFP jest również zaznaczone. Kliknij zakładkę podrzędną Czas i określ interwał pomiaru co pięć sekund i czas trwania jako 30 minut. Na panelu mikroskopu naciśnij przycisk Włącz, aby włączyć idealny system ustawiania ostrości lub PFS.
W obszarze ND Acquisition upewnij się, że zaznaczona jest opcja PFS On. Dostosuj fokus i kliknij przycisk Uruchom teraz. Rozpocznij pomiar okresu bazowego przez 90 sekund przy użyciu perfuzji roztworu Ringera.
Po 90 sekundach przełącz się z perfuzji roztworu Ringera na perfuzję roztworu Ringera. I kliknij czerwoną flagę w prawym dolnym rogu głównego panelu interfejsu. Gdy wzrost fluorescencji zacznie się nasycać, zmień z powrotem na perfuzję roztworem Ringera, aż upłynie czas eksperymentu.
Aby wyeksportować dane z odejmowaniem linii bazowej, naciśnij przycisk Korekcja tła i wyświetl zmiany w oknie Akwizycja ND. Kliknij przycisk Eksportuj, aby zapisać dane w żądanej lokalizacji. Wzrost fluorescencji wynikał ze zwiększonego wewnątrzkomórkowego stężenia, natomiast spadek wskazywał na aktywność ZnT-1 transportującego przez błonę komórkową.
Dziki typ ZnT-1 miał gładszą krzywą fluorescencji niż mutant odnoszący się do zmienności odpowiedzi komórkowych na obciążenie. Wykres pudełkowy porównujący aktywność typu dzikiego i Delta-USCTD wykazał podobne średnie wskaźniki transportu, co wskazuje na brak różnicy między typem dzikim a mutantem. Jednak różnica w rozpiętości może wskazywać na różnicę funkcjonalną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Badanie analizuje dynamikę transportu cynku w komórkach ssaków, koncentrując się na mechanizmach regulacji transporterów cynku. Dzięki zastosowaniu podejścia o wysokiej rozdzielczości czasowej metoda ta umożliwia bezpośredni pomiar odpływu Zn2+ z żywych komórek, co pozwala na poznanie funkcjonalności transportera ZnT-1.
Kluczowe komponenty badania
Obszar badawczy
- Transport cynku w komórkach ssaków
- Komórkowa dynamika cynku
- Funkcjonalność i regulacja białek
Wprowadzenie
- Jony cynku są kluczowe dla funkcji komórkowych, lecz ich dokładny pomiar jest trudny.
- Poprzednie metody nie zapewniały wymaganej rozdzielczości czasowej i przejrzystości sygnału.
- Niniejsze badanie rozwiązuje te problemy poprzez wprowadzenie nowego protokołu.
Zastosowane metody
- Mikroskopia fluorescencyjna do analizy transfekowanych komórek HEK293T
- Wykorzystanie specyficznego dla cynku barwnika fluorescencyjnego
- Zastosowanie różnych roztworów do ładowania barwnika i perfuzji
Główne wyniki
- Wykazano skuteczną metodę pomiaru zwiększonego stężenia cynku wewnątrzkomórkowego poprzez zmiany fluorescencji.
- Wykazano brak różnic funkcjonalnych w transporcie cynku pomiędzy typem dzikim a mutantem ZnT-1.
- Zidentyfikowano specyficzną dynamikę odpływu cynku oraz regulacji jego transportu.
Wnioski
- Badanie dostarcza cennych metod monitorowania transportu cynku w czasie rzeczywistym.
- Wyniki zwiększają zrozumienie regulacji poziomu cynku w biologii ssaków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednia kwantyfikacja aktywności transporterów cynku w komórkach ssaków wypełnia istotną lukę w fazie wczesnych odkryć, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka oraz funkcjonalną walidację celów w zakresie homeostazy jonów metali. Wysokorozdzielcze, ilościowe odczyty odpływu cynku pośredniczonego przez ZnT1 zwiększają pewność prognostyczną w odniesieniu do biologii transporterów i ułatwiają podejmowanie decyzji dotyczących portfela projektów kanałów jonowych i transporterów w oparciu o ocenę ryzyka. Możliwość ta wzmacnia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania po przedkliniczną ocenę funkcji transporterów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji transporterów cynku w żywych komórkach ssaków.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez izolację udziału poszczególnych domen transportera w jego aktywności.
- Zapewnia ilościowe dane kinetyczne niezbędne do funkcjonalnej walidacji celu.
- Ułatwia selekcję celów wśród transporterów na podstawie profili aktywności w czasie rzeczywistym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowany, ilościowy test efektu wypływu cynku z wysoką rozdzielczością czasową.
- Redukuje szum tła i reaktywność krzyżową z innymi kationami dwudodatkowymi.
- Wspiera powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w badaniach przesiewowych transporterów.
- Umożliwia selekcję populacji komórek wykazujących ekspresję znakowanych transporterów w celu standaryzacji testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia pomiary aktywności transporterów z dynamiką cynku w komórkach istotną dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od mechanizmu molekularnego do walidacji w modelu przedklinicznym.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój programów celowanych w transportery.
- Umożliwia opracowanie funkcjonalnych biomarkerów dla szlaków homeostazy cynku.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten test transportu cynku integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając wczesne testowanie hipotez, identyfikację związków wiodących oraz walidację mechanistyczną celów transportowych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe odczyty fluorescencji wyjaśniają funkcję transportera oraz wkład poszczególnych domen.
- Przesiewanie: Wysokorozdzielcze, powtarzalne wyniki testów umożliwiają rzetelną ocenę związków.
- Analityka: Pomiary fluorescencji rozdzielone w czasie dostarczają parametrów kinetycznych do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Dane funkcjonalne wspierają dopasowanie do modeli chorób i strategii biomarkerowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma testowa jest dostosowalna do szerszych portfeli badań nad transporterami i kanałami jonowymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w biologii transporterów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza standaryzowane, skalowalne i powtarzalne testy transporterów.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuowaniu lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową w programach we wczesnej fazie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w postaci transporterów i kanałów jonowych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek oraz biologii transporterów.
- Niezbędny jest dostęp do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego oraz oprogramowania do ilościowej analizy obrazu.
- Wymagana jest standaryzacja konfiguracji testów i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja metody do innych rodzin transporterów może wymagać optymalizacji sond i protokołów.
- Czułość i swoistość testu zależą od wybranego modelu komórkowego oraz rodzaju sondy.
