Name: Charakterystyka transporterów u ssaków za pomocą testu transportu in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę pomiaru transportu jonów cynku w komórkach ssaczych z wysoką rozdzielczością czasową. Technika fluorescencyjna umożliwia badanie dynamiki transportera ZnT-1 w żywych komórkach HEK293T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Raz Zarivach jest wspierany przez Izraelską Fundację Naukową (grant nr 163/22). Tomer Eli, Ben Yosef i Arie Moran są wspierani przez Izraelską Fundację Naukową (grant nr 2047/20). Chcielibyśmy podziękować Danielowi Gitlerowi i jego grupie z Uniwersytetu Ben-Guriona za współpracę, wsparcie i wiedzę.

1. Transfekcja komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla HEK293T komórek w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminą i 1x penicyliną/streptomycyną (patrz tabela materiałów) w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO2 aż do zbiegu na 10 cm płytce (8,8 x 10 6 komórek ogółem).</li>
	<li>Umieścić po jednym szkiełku nakrywkowym o średnicy 13 mm w każdym z dołków płytki 12-dołkowej. Rozcieńczyć 0,44 x 106 trypsynizowanych komórek z kroku 1.1 w 12 ml kompletnego DMEM. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół trzy do pięciu razy. Napełnij każdą studzienkę 1 ml zmieszanego roztworu. Uprawiać w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Zastąp cały DMEM w każdej studzience 1 ml DMEM bez surowicy (patrz Tabela materiałów) w każdym dołku. Umieścić 12-dołkową płytkę z powrotem w nawilżanym inkubatorze, jak w kroku 1.1.</li>
	<li>Dla każdej studzienki transfekcyjnej rozcieńczyć 1 μg plazmidu pAAV2 zawierającego interesujące białko oznaczone białkiem fluorescencyjnym mCherry (plik uzupełniający 1) w 100 μl DMEM bez surowicy w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 3 μg polietylenoiminy (PEI, patrz tabela materiałów) do 100 μl DMEM bez surowicy na transfekcję, przy czym każda transfekcja znajduje się w innej probówce o pojemności 1,5 ml. Stosunek plazmidu do PEI powinien wynosić 1:3 (μg:μg).</li>
	<li>Wirować obie probówki z kroku 1.4 i kroku 1.5 przez 10 s i pozostawić w temperaturze pokojowej na co najmniej 5 minut.</li>
	<li>Zmieszać jedną część (100 μl na studzienkę) roztworu DNA z kroku 1.4 z jedną częścią (100 μl na basenik) roztworu PEI z kroku 1.5. Wiruj końcowy roztwór przez 10 s i pozostaw go do odpoczynku w temperaturze pokojowej na co najmniej 20 minut i do 6 godzin.</li>
	<li>Wyjąć 12-dołkową płytkę z inkubatora. Zmieszać końcowy roztwór z kroku 1.7 i dodać 200 μl do każdego z dołków w płytce 12-dołkowej z kroku 1.3. Umieścić 12-dołkową płytkę z powrotem w nawilżanym inkubatorze (krok 1.1).</li>
	<li>Po 3 godzinach zastąpić pożywkę w każdym dołku 1 ml kompletnego DMEM. Umieścić 12-dołkową płytkę z powrotem w nawilżanym inkubatorze, jak w kroku 1.1.</li>
	<li>Po 2 dniach pobrać transfekowaną hodowlę komórkową z inkubatora o temperaturze 37 °C/5% CO2 i umieścić ją w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym przy 10-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Korzystając z pokrętła ostrości mikroskopu, ustaw ostrość na komórkach, korzystając ze światła jasnego pola.</li>
	<li>Przełącz się na fluorescencyjne długości fal wzbudzenia mCherry (587 nm) i emisji (610 nm) i wyłącz światło jasnego pola. Sprawdź fluorescencję komórek, aby potwierdzić ekspresję ZnT1 mCherry.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do ładowania barwnika.
	<ol>
		<li>Pobrać podwielokrotność 4 μl barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla (patrz tabela materiałów) w postaci estru acetoksymetylowego (AM), rozpuszczonego w DMSO (1 μg/μl), z zabezpieczonego przed światłem materiału podstawowego przechowywanego w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Ta forma pozwala barwnikowi dostać się do komórki przez błonę plazmatyczną poprzez prostą dyfuzję.</li>
		<li>Dodać 4 μl 10% kwasu pluronowego (lub 2 μl 20% kwasu pluronowego, patrz tabela materiałów) do podwielokrotności z kroku 1.13.1. Dobrze wymieszaj roztwór, pipetując trzy razy w górę i w dół, a następnie dodaj wszystkie 8 μl do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 750 μl roztworu Ringera (przygotowanego we własnym zakresie, patrz Tabela materiałów dla składu) uzupełnionego 1 mg/ml (~0,1%) albuminy surowicy bydlęcej do probówki z kroku 1.13.2 i energicznie wirować. Dodaj kolejne 750 μl tego samego roztworu i ponownie zwiruj, aby zapewnić maksymalne wymieszanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 750 μl końcowego roztworu z kroku 1.13.3 do dwóch dołków w nowej 6-dołkowej płytce hodowlanej. Przykryj folią aluminiową. 
	UWAGA: Aby uniknąć wybielania, na tym etapie płytka 6-dołkowa jest zawsze przykrywana folią aluminiową.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej pęsety pobrać do czterech powtórzonych szkiełek nakrywkowych z transfekowanej płytki do hodowli komórkowych i umieścić je w pierwszym wypełnionym dołku (do czterech szkiełek na studzienkę) nowej płytki 6-dołkowej z kroku 1.14. Powtórz ten proces dla drugiego napełnionego dołka. 
	UWAGA: Wszystkie szkiełka nakrywkowe w tej samej wypełnionej studzience muszą być w tym samym stanie. Jednak każda studnia może zawierać inne warunki.</li>
	<li>Przykryj folią aluminiową i delikatnie potrząsaj przez 15-20 min.</li>
	<li>Usuń roztwór nasycający barwnik i zastąp go nowym roztworem do płukania albuminy Ringera plus, jak użyto w kroku 1.13.3. Przykryj folią aluminiową. Pozostaw do ponownego wstrząsnięcia na 20 minut. Pozwala to na rozszczepienie estru AM przez esterazy wewnątrzkomórkowe.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikroskopu
<ol>
	<li>Ułóż niezbędne narzędzia (patrz tabela materiałów), jak wspomniano: odwrócony mikroskop fluorescencyjny zdolny do wykrywania fluoroforów GFP i mCherry, system perfuzyjny, który umożliwia przełączanie między co najmniej dwoma roztworami, system ssący i komorę perfuzyjną.</li>
	<li>Włącz mikroskop, jego źródło światła i kamerę. Włącz układ ssący.</li>
	<li>Umyj system perfuzyjny. Przemyć pierwszą komorę roztworem Ringera, a drugą komorę roztworem Ringera zawierającym 7 μM roztworu uzupełnionego 7 μM pirytionianem (jonofor, patrz tabela materiałów). Aby uniknąć pęcherzyków powietrza lub szczelin, pozostaw trochę płynu w każdej komorze. 
	UWAGA: Ponieważ oba pojemniki są podłączone do tej samej rurki podłączonej do komory perfuzyjnej, zawsze upewnij się, że wspólny segment jest umyty roztworem Ringera.</li>
	<li>Zamknij krany i napełnij odpowiednie komory roztworem Ringera i roztworem Ringera, jak w kroku 2.3.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Weź komorę perfuzyjną i umieść ją wąską stroną rowka skierowaną do góry. 
	UWAGA: Rowek to otwór w środku komory perfuzyjnej. Umożliwia dostęp płynu perfuzyjnego do komórek. Jedna strona rowka jest wąska, a druga strona szeroka.</li>
	<li>Nałożyć silikon uszczelniający (patrz Tabela materiałów) wokół rowka. Wyczyść silikon uszczelniający z rowka za pomocą końcówki do pipety. 
	UWAGA: Upewnij się, że wokół rowka jest wystarczająca ilość silikonowej uszczelki, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej pęsety wyjmij szkiełko nakrywkowe z roztworu myjącego i umieść je na wierzchu rowka komórkami skierowanymi w dół. W ten sposób komórki zostaną wystawione na działanie roztworu przenikającego rowek podczas eksperymentu.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe 22 mm na szkiełku nakrywkowym 13 mm i dokręć je za pomocą pęsety. Uważaj, aby nie popękać szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Odwróć komorę i naciśnij ją, aby uwolnić wszystkie obecne płyny. Wypełnij rowek 100 μl roztworu myjącego Ringera i ponownie dociśnij, aby upewnić się, że nie ma wycieków. 
	UWAGA: W przypadku wykrycia nieszczelności nałóż środek uszczelniający w miejscu wycieku i przetestuj ponownie.</li>
	<li>Zamontuj komorę perfuzyjną na platformie i zabezpiecz ją. Umieść rurki perfuzyjne i ssące, aby umożliwić perfuzję nad komórkami w rowku.</li>
	<li>Zmień szybkość perfuzji na około 2 ml/min i włącz perfuzję roztworu Ringera. Upewnij się, że system perfuzyjny działa bez wycieków lub rozlania.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do pomiaru
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Spis materiałów), klikając dwukrotnie ikonę. Zaloguj się przy użyciu odpowiednich danych uwierzytelniających. Wybierz dołączoną kamerę i naciśnij przycisk OK.</li>
	<li>Ustaw powiększenie mikroskopu na 10x za pomocą przycisku po lewej stronie mikroskopu.</li>
	<li>Wybierając podgląd na żywo i używając joysticka, przesuń platformę, aby ustawić ostrość na komórkach w rowku.</li>
	<li>Gdy perfuzja jest włączona, wyłącz światła i zmień długość fali na mCherry, naciskając dedykowany przycisk w interfejsie. Wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu.</li>
	<li>Gdy mikroskop skupi się na komórkach, przesuń platformę za pomocą joysticka, aby umożliwić wybór odpowiednich łatek komórek. 
	UWAGA: Za odpowiedni obszar uważa się obszar z co najmniej 10 komórkami dla zwrotu z inwestycji i pustym obszarem jako tłem.</li>
	<li>Wybierz menu rozwijane Włącz/wyłącz ROI, a następnie wybierz opcję Rysuj kołowe ROI.</li>
	<li>Narysuj ROI klastrów komórkowych z komórkami eksprymującymi mCherry (wskazuje ekspresję ZnT1).</li>
	<li>Na tym samym pasku narzędzi, co w kroku 4.6, kliknij przycisk Włącz/wyłącz ROI w tle, a następnie dostosuj lokalizację i rozmiar ROI tła do obszaru, w którym w ogóle nie ma komórek.
	<ol>
		<li>Sprawdź za pomocą długości fal mCherry i EGFP, aby upewnić się, że żadne komórki nie znajdują się w wybranym tle ROI. 
		UWAGA: Długości fal zostały dostosowane tak, aby mCherry używał długości fali wzbudzenia 520 nm i długości fali emisji 610 nm, a EGFP używał długości fali wzbudzenia 470 nm i długości fali emisji 520 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz zakładkę podrzędną Długość fali (λ). Zaznacz jego pole wyboru i upewnij się, że długość fali GFP jest obecna, a jej pole wyboru zaznaczone. Jeśli nie, dodaj i oznacz go.</li>
	<li>Wybierz kartę podrzędną Czas trwania. Zdefiniuj interwał pomiaru co 5 s i zmień liczbę interwałów, aby dopasować go do czasu trwania eksperymentu.</li>
	<li>W sekcji Ostrość na panelu mikroskopu pod okularem kliknij przycisk Włącz, aby włączyć idealny system ustawiania ostrości (PFS).</li>
	<li>Za pomocą pokrętła ostrości PFS wyreguluj ostrość. W interfejsie oprogramowania, w obszarze Pozyskiwanie ND, upewnij się, że PFS jest zaznaczony . </li>
	<li>Kliknij Uruchom teraz.</li>
</ol>
5. Procedura eksperymentalna
<ol>
	<li>Zacznij od 90-sekundowego pomiaru okresu bazowego za pomocą perfuzji roztworu Ringera.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu bazowego wyłącz perfuzję roztworu Ringera, a następnie włącz perfuzję roztworu Ringera. Zaznacz przełączanie rozwiązania, klikając czerwoną flagę w prawym dolnym rogu głównego panelu interfejsu. Oczekuje się, że pojawi się wzrost fluorescencji.</li>
	<li>Gdy wzrost fluorescencji zacznie się nasycać, zmień z powrotem na perfuzję roztworem Ringera. Wyłącz perfuzję roztworu Ringera, a następnie włącz perfuzję roztworu Ringera.</li>
	<li>Poczekaj, aż upłynie czas eksperymentu. Oczekuje się zauważalnego, ale stałego spadku fluorescencji, jeśli ZnT1 działa prawidłowo.</li>
</ol>
6. Eksport danych
<ol>
	<li>Aby wyeksportować dane z odejmowaniem linii bazowej, naciśnij przycisk Odejmij linię bazową i wyświetl zmiany w oknie "Akwizycja ND".</li>
	<li>Kliknij przycisk Eksportuj w interfejsie oprogramowania w oknie "Akwizycja ND". Otworzy się arkusz danych programu Excel. Zapisz w żądanej lokalizacji.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Dla każdego zwrotu z inwestycji utwórz średnią fluorescencję bazową z pierwszych 90-100 s.</li>
	<li>Wyraź fluorescencję obliczoną dla każdego zwrotu z inwestycji jako procent tła dla tego zwrotu z inwestycji.</li>
	<li>Utwórz średnią wierszy wszystkich zwrotów z inwestycji i wykreśl wynik jako wykres liniowy. W ten sposób powstaje średnia wszystkich zwrotów z inwestycji w funkcji czasu.</li>
	<li>Korzystając z funkcji dopasowania liniowego, wybierz początkową szybkość spadku fluorescencji po praniu roztworem Ringera. Wartość nachylenia równania jest skorelowana ze współczynnikiem transportu.</li>
</ol>

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

<ol><li>Lindskog, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+carbonic+anhydrase%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of carbonic anhydrase.</a> Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).</li>
<li>Rutherford, J. C., Bird, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-responsive+transcription+factors+that+regulate+iron%2C+zinc%2C+and+copper+homeostasis+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells.</a> Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).</li>
<li>Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+Biochemistry%3A+From+a+single+zinc+enzyme+to+a+key+element+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life.</a> Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).</li>
<li>Kimura, T., Kambe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+metallothionein+and+ZIP+and+ZnT+transporters%3A+An+overview+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336(2016).</li>
<li>Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+ZIP+and+ZnT+zinc+transporters+in+human+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).</li>
<li>Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological%2C+biochemical%2C+and+molecular+roles+of+zinc+transporters+in+zinc+homeostasis+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism.</a> Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).</li>
<li>Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+transporters+as+potential+therapeutic+targets%3A+An+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).</li>
<li>Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+transporters+and+their+functional+integration+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100320(2021).</li>
<li>Huang, L., Tepaamorndech, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SLC30+family+of+zinc+transporters+-+A+review+of+current+understanding+of+their+biological+and+pathophysiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).</li>
<li>Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+zinc+transporter+protein-1+%28ZnT-1%29+in+the+brain+of+subjects+with+mild+cognitive+impairment%2C+early%2C+and+late-stage+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease.</a> Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).</li>
<li>Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+zinc+transporter+proteins+ZnT-1%2C+ZnT-4+and+ZnT-6+in+preclinical+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain.</a> Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).</li>
<li>Tsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+zinc+transporter+gene%2C+ZnT-1%2C+is+induced+after+transient+forebrain+ischemia+in+the+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).</li>
<li>Palmiter, R. d, Findley, S. d <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+characterization+of+a+mammalian+zinc+transporter+that+confers+resistance+to+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc.</a> The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).</li>
<li>Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+overview+of+the+zinc+transporters+in+the+cation+diffusion+facilitator+family%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).</li>
<li>Shapiro, S. S., Wilk, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+variance+test+for+normality+%28complete+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrika%22%5BJournal%5D)">An analysis of variance test for normality (complete samples).</a> Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).</li>
<li>Mann, H. B., Whitney, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+a+test+of+whether+one+of+two+random+variables+is+stochastically+larger+than+the+other%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Mathematical+Statistics%22%5BJournal%5D)">On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other.</a> The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).</li>
<li>Darling, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kolmogorov-Smirnov%2C+Cramer-von+Mises+tests%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Mathematical+Statistics%22%5BJournal%5D)">The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests.</a> The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).</li>
<li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li>
<li>Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+zinc+in+living+cells.%3A+A+new+generation+of+sensitive+and+selective+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes.</a> Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).</li>
<li>Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mitochondrial+fluorescent+zinc+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new mitochondrial fluorescent zinc sensor.</a> Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).</li>
<li>Hessels, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eZinCh-2%3A+A+versatile%2C+genetically+encoded+FRET+sensor+for+cytosolic+and+intraorganelle+Zn2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging.</a> ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).</li>
<li>Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsphere-based+real-time+calcium+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microsphere-based real-time calcium sensing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).</li>
<li>Namdarghanbari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+of+the+zinc+sensor+FluoZin-3+with+Zn7-metallothionein%3A+Inquiry+into+the+existence+of+a+proposed+weak+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).</li>
<li>Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+intracellular+free+calcium+and+zinc+using+fura-2FF+and+FluoZin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3.</a> Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisana powyżej metoda pozwala na bezpośredni pomiar wewnątrzkomórkowego stężenia z wysoką rozdzielczością czasową. W porównaniu z innymi metodami, ta metoda polegająca na monitorowaniu zmian w wewnątrzkomórkowym Zn2+ może znacznie zmniejszyć szum tła. Ponadto selektywność barwnika w stosunku do eliminuje potencjalne interakcje krzyżowe z innymi kationami metali 18,19. Wreszcie, brak natychmiastowej cytotoksyczności umożliwia badanie żywych procesów ko...

jest niezbędnym pierwiastkiem śladowym w środowisku komórkowym. Zawiera jedną trzecią wszystkich białek i bierze udział w różnych procesach komórkowych, takich jak kataliza1, transkrypcja2 i motywy strukturalne3. Jednak pomimo tego, że jest obojętny na redoks, wysokie stężenia są toksyczne dla komórki, dlatego żaden organizm ssaków nie przetrwał bez obecności mechanizmów regulujących homeostazę. U ssaków za ten proces odpowiedzialne są trzy mechanizmy: (1) metalotioneiny, które są cytozolowymi białkami bogatymi w cysteinę, które wiążą z wysokim powinowactwem, zapobiegając w ten sposób nadmiarowi wolnego cytozolowego4; (2) Białka podobne do Zrt/Irt (ZIP), które są transporterami odpowiedzialnymi za napływ do cytozolu przez błonę plazmatyczną lub z organelli wewnątrzkomórkowych4,5,6,7,8; oraz (3) ZnT, które są ssaczym podzbiorem rodziny wszechobecnych ułatwień dyfuzji kationów (CDF) i są transporterami, ponieważ wytłaczają z cytozolu przez błonę plazmatyczną lub do organelli wewnątrzkomórkowych4,5,6,7,8,9. Ze względu na znaczenie dla metabolizmu komórkowego, ważne jest, aby zrozumieć komórkową dynamikę.
Poprzednie metody oceny dynamiki polegały na ocenie poziomów ekspresji mRNA w różnych warunkach poprzez korelację ich z komórkowymi pomiarami w stałych tkankach lub komórkach10,11,12. Metody te obejmują detekcję chemiczną i barwienie immunohistochemiczne. Jednak metody te dają tylko pośrednie pomiary, a zatem określają jedynie korelację offline między wewnątrzkomórkowym stężeniem a ekspresją transporterów. W związku z tym metody te nie mogą wywnioskować żadnych parametrów wymagających wysokiej rozdzielczości czasowej.
Bardziej bezpośredni pomiar transportu Zn2+ wykorzystuje radioaktywne izotopy13. Metoda ta opiera się na pomiarze znakowanego radioaktywnieZn 2+ w celu monitorowania transportu i jego kinetyki. Jednak ze względu na znaczenie dla homeostazy komórkowej, wiele procesów komórkowych reguluje wewnątrzkomórkowe stężenie. Wśród nich są wiązania zewnątrzkomórkowe i kilka systemów transportowych, które współpracują ze sobą, aby utrzymać ścisłą kontrolę wewnątrzkomórkowych poziomów Zn2 +. Połączenie tych procesów powoduje powstawanie znacznego szumu tła, co utrudnia testowanie poszczególnych funkcji transportowych związanych z.
Ten artykuł demonstruje metodę bezpośredniego monitorowania szybkości transportu poprzez pomiar wewnątrzkomórkowego stężenia wolnego za pomocą specyficznego dla barwnika fluorescencyjnego, FluoZin-3. Barwnik ma wysoką specyficzność dla Zn2+ i niewielką interferencję z innymi kationami dwuwartościowymi, takimi jak wapń. Ponadto w postaci estrowej dostaje się do komórek przez dyfuzję niejonową, a następnie jest wychwytywany w wyniku aktywności wewnątrzkomórkowej di-esterazy. Tym samym jego fluorescencja jest skorelowana przede wszystkim ze stężeniem wolnego cytozolowego. Eksperymenty te przeprowadzono w celu zbadania zależności struktura-funkcja transportera 1 (ZnT1), członka rodziny ZnT.

<table><tbody><tr><td>Płytka 10 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Bio-ONE</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 13 mm</td><td>Superior Marienfeld</td><td>111530</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe 22 mm</td><td>Superior Marienfeld</td><td>101050</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>hodowlana Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca albumina</td><td>bioWorld</td><td>22070008</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia bezwodny, granulowany</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>Stężenie w roztworze Ringera: 1 mM</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Glentham Life Science</td><td>GC6947</td><td>Stężenie w roztworze Ringera: 10 mM</td></tr><tr><td>Dubelco' s Zmodyfikowane media Eagle (DMEM)&nbsp;</td>Mikroskop odwrócony <td>Sartorius</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td>TI-DH</td><td>Wycofany z produkcji. Zastąpione przez Eclipse Ti2</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Drobna pęseta</td><td>Dumont</td><td>0203-55-PS</td><td></td></tr><tr><td>Fluozin-3AM</td><td>Invitrogen</td><td>F24195</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicylina-Streptomycyna 100x roztwór</td><td>Cytiva</td><td>SV30010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>System oświetlenia LED</td><td>CoolLED</td><td>pE-4000</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Merck</td><td>1.05833</td><td>Stężenie w roztworze Ringera: 0,8 mM</td></tr><tr><td>Kwas N[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[2-etanosulfonowy] (HEPES)</td><td>Formedium</td><td>HEPES10</td><td>Stężenie w roztworze Ringera: 10 mM</td></tr><tr><td>Kamera Neo 5.5 sCMOS</td><td>ANDOR</td><td>DC-152Q-FI</td><td></td></tr><tr><td>OPROGRAMOWANIE DO OBRAZOWANIA NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td>AR</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pluronowy F-127</td><td>Millipore</td><td>540025</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Bio-Lab</td><td>163823</td><td>Stężenie w roztworze Ringera: 5,4 mM</td></tr><tr><td>Pirytionian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3261</td><td>Stężenie w roztworze Ringera: 7 &mu; </td></tr><tr><td>M Zestaw smarów silikonowych</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-0378</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Bio-Lab</td><td>190305</td><td>Stężenie w roztworze Ringera: 120</td></tr><tr><td>mM Siarczan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31665</td><td>Stężenie w roztworze Ringera: 7 &mu; M</td></tr></tbody></table>

charakterystyka transporterów u ssaków za pomocą testu transportu in vitro

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Metale przejściowe, takie jak jony Zn2+, muszą być ściśle regulowane ze względu na ich toksyczność komórkową. Wcześniej aktywność transporterów Zn2+ mierzono pośrednio, określając poziom ekspresji transportera przy różnych stężeniachZn 2+. Dokonano tego poprzez wykorzystanie immunohistochemii, pomiar mRNA w tkance lub określenie komórkowych poziomów Zn2+. Wraz z rozwojem wewnątrzkomórkowych czujników Zn2+, aktywność transporterów jest obecnie determinowana przede wszystkim przez korelację zmian w wewnątrzkomórkowych Zn2+, wykrywanych za pomocą sond fluorescencyjnych, z ekspresją transporterów Zn2+. Jednak nawet dzisiaj tylko kilka laboratoriów monitoruje dynamiczne zmiany wewnątrzkomórkowego Zn2+ i wykorzystuje go do bezpośredniego pomiaru aktywności transporterów. Częścią problemu jest to, że spośród 10 transporterów z rodziny ZnT, z wyjątkiem ZnT10 (transportuje mangan), tylko transporter 1 (ZnT1) jest zlokalizowany w błonie plazmatycznej. Dlatego powiązanie aktywności transportowej ze zmianami wewnątrzkomórkowego stężeniaZn 2+ jest trudne. W tym artykule opisano bezpośredni sposób określania kinetyki transportu za pomocą testu opartego na specyficznym dla barwniku fluorescencyjnym, FluoZin-3. Barwnik ten jest ładowany do komórek ssaków w postaci estrów, a następnie uwięziony w cytozolu z powodu aktywności komórkowej di-esterazy. Komórki są ładowane Zn2+ poprzez wykorzystanie jonoforu Zn2+ pirytionianu. Aktywność ZnT1 ocenia się na podstawie liniowej części redukcji fluorescencji po wypłukaniu komórek. Fluorescencja mierzona przy wzbudzeniu 470 nm i emisji 520 nm jest proporcjonalna do wolnego wewnątrzkomórkowegoZn 2+. Selekcja komórek wykazujących ekspresję ZnT1 znakowanych fluoroforem mCherry pozwala na monitorowanie tylko komórek wykazujących ekspresję transportera. Test ten służy do badania udziału różnych domen białka ZnT1 w mechanizmie transportu ludzkiego ZnT1, eukariotycznego białka transbłonowego, które wytłacza nadmiar z komórki.

ZnT1 jest ssaczym transporterem cynku zlokalizowanym w błonie plazmatycznej komórki13. Należy on do rodziny białek z grupy facylitatorów dyfuzji kationów (CDF), które usuwają cynk z cytosolu do środowiska zewnętrznego14. ZnT1 posiada dwudomenową architekturę: domenę transbłonową, która transportuje jony przez błonę, oraz domenę C-końcową14. W przeciwieństwie do innych znanych białek CDF, ZnT1 posiada rozbudowaną, nieustrukturyzowaną domenę C-końcową ...

Transport okazał się trudny do zmierzenia ze względu na słabe związki przyczynowo-skutkowe z funkcją białka i niską rozdzielczość czasową. Protokół ten opisuje metodę monitorowania, z wysoką rozdzielczością czasową, ekstruzji Zn2 + z żywych komórek przy użyciu wrażliwego barwnika fluorescencyjnego Zn2 +, zapewniając w ten sposób bezpośredni pomiar wypływu Zn2 +.

Charakterystyka transporterów u ssaków za pomocą testu transportu in vitro

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...

Moje badania koncentrują się na ustrukturyzowanej zależności funkcjonalnej transporterów u ssaków ze szczególnym uwzględnieniem mechanizmu regulacji. Ze względu na znaczenie jonów dla funkcjonowania komórek, uzyskanie dokładnego pomiaru komórkowej dynamiki jest trudne. Nasz protokół rozwiązuje problem niskiego stosunku sygnału do szumu i niskiej rozdzielczości czasowej dynamiki.Metoda ta pozwala na badanie napływu przez błonę komórkową z wysoką rozdzielczością czasową i znacznie mniejszym szumem tła i interakcjami krzyżowymi przez inne kationy dwuwartościowe. Odkryliśmy, że nieustrukturyzowane rozszerzenie transportera ssaków ZnT-1, domena końcowa C nie jest zaangażowana w funkcję transportu. Dzięki temu naukowcy mogą skupić się na innych domenach białka ZnT-1 w celu regulacji transportu.Rozpocznij od analizy transfekowanych komórek HEK293T za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Po skupieniu komórek, za pomocą światła jasnego pola przełącz się na fluorescencyjną falę wzbudzenia mCherry o długości fali 587 nanometrów i długości fali emisyjnej o długości 610 nanometrów. Po wyłączeniu światła jasnego pola sprawdź fluorescencję komórek, aby potwierdzić ekspresję ZnT-1 mCherry.Aby przygotować roztwór do ładowania barwnika, weź cztery mikrolitry roztworu barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla. Następnie dodaj cztery mikrolitry 10% kwasu pluronowego. Wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieś go do probówki o pojemności 1,5 mililitra.Do przygotowanego roztworu dodać 750 mikrolitrów roztworu myjącego i energicznie wymieszać rurkę. Ponownie dodaj 750 mikrolitrów roztworu myjącego. Po zawirowaniu dodaj 750 mikrolitrów tego roztworu do dwóch dołków nowej sześciodołkowej płytki hodowlanej i przykryj ją folią aluminiową.Za pomocą pęsety przenieś 13-milimetrowe szkiełko nakrywkowe z wcześniej hodowanej płytki HEK293T komórkowej na płytkę sześciodołkową. Po przykryciu płytki folią delikatnie potrząsaj nią przez 15 do 20 minut i zastąp roztwór nasycający barwnikiem przygotowanym roztworem myjącym. Po przykryciu talerza potrząsaj nim ponownie przez 20 minut.Aby rozpocząć, włącz mikroskop, źródło światła, kamerę i system ssący. Do przemywania systemu perfuzyjnego należy użyć roztworu Ringera w pierwszej komorze i roztworu Ringera uzupełnionego pirytionianem w drugiej komorze. Po zamknięciu kranu napełnij komory tymi samymi roztworami.Aby rozpocząć przygotowanie próbki, umieść komorę perfuzyjną wąską stroną rowka skierowaną do góry i nałóż silikon sufitowy wokół rowka. Następnie za pomocą cienkiej pęsety przenieś 13-milimetrowy szkiełko nakrywkowe z roztworu myjącego na wierzch rowka komórkami skierowanymi w dół. Umieść 22-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na 13-milimetrowym szkiełku nakrywkowym i dokręć je pęsetą, uważając, aby nie pęknąć szkiełek nakrywkowych.Odwróć komorę i naciśnij ją, aby uwolnić płyny. Następnie wypełnij rowek 100 mikrolitrami roztworu myjącego Ringera. I naciśnij ponownie, upewniając się, że nie ma wycieków.Zamontuj i zabezpiecz komorę perfuzyjną na platformie. Następnie przymocuj rurki perfuzyjne i ssące do perfuzji nad komórkami w rowku. Zmień szybkość perfuzji na około dwa mililitry na minutę i włącz perfuzję roztworu Ringera.Aby wykonać pomiary, otwórz oprogramowanie do obrazowania. Ustaw powiększenie mikroskopu na 10X za pomocą lewego przycisku bocznego mikroskopu. Po wybraniu podglądu na żywo użyj joysticka, aby przesunąć platformę i skup się na komórkach w rowku.Wybierz odpowiednią długość fali dla mCherry. Po zogniskowaniu komórek przesuń platformę, aby wybrać odpowiednie łaty komórek. Wybierz menu rozwijane Draw ROIs (Rysuj ROI).Wybierz opcję Narysuj okrągłe ROI i narysuj ROI na klastrach komórek. z komórkami wyrażającymi mCherry. Utwórz nowe ROI poza pierwszym, przytrzymując przycisk Shift, a następnie naciskając i przeciągając istniejące ROI.Wybierz opcję Rysuj zwrot z inwestycji w kwadratowe tło z menu rozwijanego i dostosuj lokalizację i rozmiar zwrotu z inwestycji w tle, w którym nie ma komórek. Po upewnieniu się, że w tle nie ma komórek ROI, przejdź do zakładki ND Acquisition. Wybierz kartę podrzędną Długość fali i zaznacz jej pole wyboru.Upewnij się, że pole wyboru długości fali GFP jest również zaznaczone. Kliknij zakładkę podrzędną Czas i określ interwał pomiaru co pięć sekund i czas trwania jako 30 minut. Na panelu mikroskopu naciśnij przycisk Włącz, aby włączyć idealny system ustawiania ostrości lub PFS.W obszarze ND Acquisition upewnij się, że zaznaczona jest opcja PFS On. Dostosuj fokus i kliknij przycisk Uruchom teraz. Rozpocznij pomiar okresu bazowego przez 90 sekund przy użyciu perfuzji roztworu Ringera.Po 90 sekundach przełącz się z perfuzji roztworu Ringera na perfuzję roztworu Ringera. I kliknij czerwoną flagę w prawym dolnym rogu głównego panelu interfejsu. Gdy wzrost fluorescencji zacznie się nasycać, zmień z powrotem na perfuzję roztworem Ringera, aż upłynie czas eksperymentu.Aby wyeksportować dane z odejmowaniem linii bazowej, naciśnij przycisk Korekcja tła i wyświetl zmiany w oknie Akwizycja ND. Kliknij przycisk Eksportuj, aby zapisać dane w żądanej lokalizacji. Wzrost fluorescencji wynikał ze zwiększonego wewnątrzkomórkowego stężenia, natomiast spadek wskazywał na aktywność ZnT-1 transportującego przez błonę komórkową.Dziki typ ZnT-1 miał gładszą krzywą fluorescencji niż mutant odnoszący się do zmienności odpowiedzi komórkowych na obciążenie. Wykres pudełkowy porównujący aktywność typu dzikiego i Delta-USCTD wykazał podobne średnie wskaźniki transportu, co wskazuje na brak różnicy między typem dzikim a mutantem. Jednak różnica w rozpiętości może wskazywać na różnicę funkcjonalną.

characterizing-mammalian-zinc-transporters-using-an-vitro-zinc

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano wydajną procedurę oceny tendencji do oligomeryzacji pojedynczych domen transbłonowych (TMD). Białka chimeryczne, składające się z TMD połączonej z ToxR, są eksprymowane w szczepie reporterowym E. coli. Indukowana przez TMD oligomeryzacja powoduje dimeryzację ToxR, aktywację transkrypcji i produkcję białka reporterowego, -galaktozydazy.

Wyznaczanie skłonności do oligomeryzacji domeny transbłonowej za pomocą testu ToxR

Źródło: Maurakis, S., et al. Ograniczony metalem wzrost Neisseria gonorrhoeae w celu scharakteryzowania genów reagujących na metale i pozyskiwania metali z ligandów gospodarza. J. Vis. Exp. (2020).Ten film przedstawia test wzrostu bakterii z ograniczoną ilością metalu w celu zbadania roli genów reagujących na metale. Dzikie i zmutowane bakterie hodowane w pożywce zubożonej w metale są inkubowane z metalem-ligandem, a ich wzrost jest monitorowany za pomocą czytnika płytek. W warunkach zubożenia...

Test wzrostu bakterii z ograniczoną ilością metali w celu zbadania roli genów reagujących na metale

Przedstawiamy protokół do badania in vitro pomp wypływowych z Pseudomonas aeruginosa. Protokół ten pozwala na generowanie solidnego, odwracalnego i przestrajalnego gradientu protonów w błonie liposomowej, a zatem powinien być przystosowany do dowolnego białka błonowego zasilanego siłą protomotoryczną.

Metody in vitro Badanie pompy wypływowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

Domeny palców cynkowych są z natury przepuszczalne dla komórek i zdolne do pośredniczenia w dostarczaniu białek do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku wdrażania technologii palca cynkowego do wewnątrzkomórkowego dostarczania białka.

Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych

Przedstawiono protokół ekstrakcji białka opiekuńczego z peryplazmatycznego metalu przejściowego w kontekście jego natywnych partnerów wiążących, oraz biofizyczną charakterystykę zawartości jego substratu za pomocą fluorescencji rentgenowskiej i wychwytu radiometalu.

Niezbędny wychwyt metali przez bakterie Gram-ujemne: fluorescencja rentgenowska, radioizotopy i frakcjonowanie komórek

Celem tego protokołu jest spektrofotometryczne monitorowanie transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów i analiza oddziaływań enzymatycznych, które mogą wystąpić z tymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów.

Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12

Hodowlane pierwotne lub ustalone linie komórkowe są powszechnie używane do rozwiązywania podstawowych problemów biologicznych i mechanistycznych jako wstępne podejście przed użyciem modeli zwierzęcych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przygotować ekstrakty z całych komórek i frakcje subkomórkowe do badań (Zn) i innych pierwiastków śladowych za pomocą atomowej spektroskopii absorbancji.

Spektroskopia absorpcji atomowej do pomiaru wewnątrzkomórkowych rezerwuarów w komórkach ssaków

Ten artykuł szczegółowo wyjaśnia systematyczne podejście do oceny dostępności mikrominerałów w łososiu atlantyckim. Metodologia obejmuje narzędzia i modele o rosnącej złożoności biologicznej: (1) analizę specjacji chemicznej, (2) rozpuszczalność in vitro, (3) badania absorpcji w liniach komórkowych oraz (4) badania in vivo na rybach.

Ocena dostępności minerałów w paszach dla ryb przy użyciu metod uzupełniających zademonstrowanych na przykładzie w łososiu atlantyckim

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie pożywek o ograniczonym poziomie Zn2++, naczyń wzrostowych i kultur nasion do produkcji rybosomów z ograniczoną ilością Zn2+ w prątkach. Ślady Zn2+ prowadzą do wzrostu ograniczającego wzrost Zn2+ i opisujemy cechy morfogenne wykorzystywane jako bioindykatory do weryfikacji ograniczenia Zn2+ in vitro w modelowej bakterii Mycobacterium smegmatis i ludzkim patogenie M. tuberculosis.

Wykorzystanie Mycobacterium smegmatis jako biowskaźnika warunków wzrostu prątków ograniczonych oznaczeniem

Poznaj metodę pomiaru transportu jonów cynku w komórkach ssaczych z wysoką rozdzielczością czasową. Technika fluorescencyjna umożliwia badanie dynamiki transportera ZnT-1 w żywych komórkach HEK293T.

Charakterystyka transporterów u ssaków za pomocą testu transportu in vitro

Przeglądaj więcej filmów