In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej
28 kwietnia 2023
Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.
Opracowujemy optyczne układy odpornościowe i algorytmy obliczeniowe do rejestrowania i analizowania neuroaktywności całego mózgu z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Larwy danio pręgowanego są idealnym zwierzęciem modelowym do badań dzięki swojej przejrzystości optycznej i dostępności różnorodnych narzędzi genetycznych. Jakość obrazu optycznego może ulec pogorszeniu z powodu aberracji wprowadzanej przez żel agarozowy używany do mocowania próbki, a ryby mogą poruszać się podczas nagrywania, powodując artefakty ruchu na obrazach lub utrudniając dokładne wydobycie sygnału z obrazów.
Publicznie dostępne protokoły zawierają jedynie krótki przegląd procedury eksperymentalnej, pozostawiając istotną część szczegółów, takich jak krzepnięcie agarozy, precyzyjne techniki montażu i proste pozycjonowanie. Dlatego potrzebny jest skuteczny i powtarzalny protokół, aby uzyskać wysokiej jakości dane obrazowe przy minimalnym szumie i ruchu. Nasz protokół zapewnia zoptymalizowaną i powtarzalną procedurę eksperymentalną.
Protokół ten umożliwia obrazowanie in vivo całego mózgu przez dłuższy czas i wizualizację uzyskanych danych obrazowych. Przebieg prac koncentrował się na obrazowaniu całego mózgu, ale można je łatwo zastosować do obrazowania innych narządów larw danio pręgowanego. Naszym celem jest rozwikłanie podstawowych zasad obliczeń neuronowych.
W tym celu będziemy kontynuować prace nad planem, który obejmuje wielkoskalowe obrazowanie neuroaktywności i struktury oraz analizę obliczeniową w celu systematycznego mapowania mózgu. Aby rozpocząć, przygotuj eksperyment i materiał potrzebny do montażu i pozycjonowania danio pręgowanego. Pod mikroskopem stereoskopowym obserwuj sparaliżowane larwy danio pręgowanego, aby sprawdzić, czy ich ruch się zatrzymał.
Oceń wizualnie stan zdrowia larwy, sprawdzając bicie jej serca. Następnie za pomocą pipety transferowej umieść pojedynczą larwę danio pręgowanego w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej żel agarozowy. Wlej żel agarozowy na szalkę Petriego, aby uzyskać 1 do 2 milimetrową warstwę.
Przenieś larwy z probówki mikrowirówki na szalkę Petriego za pomocą pipety transferowej, upewnij się, że larwy zostały umieszczone na środku naczynia. Za pomocą kleszczy ustaw larwy w żądanej orientacji, tak aby głowa i ogon były płaskie. Następnie za pomocą kleszczy obróć larwy, aby wyrównać oba oczy.
Po zakończeniu wyrównywania poczekaj, aż żel agarozowy zestali się, zanim napełnisz szalkę Petriego wodą jajeczną. Umieść naczynie z osadzonymi larwami na stoliku mikroskopu w celu uzyskania obrazu. Włącz mikroskop i zlokalizuj larwy w środku pola widzenia.
Korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, ustaw parametry obrazowania. Jeśli obraz jest nasycony, zmniejsz moc lasera. Następnie znajdź mózg larw, przesuwając stolik i określ jego grubość za pomocą trybu podglądu na żywo w oprogramowaniu, ręcznie zmieniając płaszczyzny ogniskowych w górę iw dół.
Ustaw dolną i górną granicę głośności. Następnie przystąp do akwizycji obrazu dla ustawionego pola view. W przypadku wolumetrycznego obrazowania strukturalnego uzyskaj obraz 3D całego mózgu, uzyskując sekwencyjne obrazy 2D każdej płaszczyzny z.
Aby obrazować funkcjonalny pojedynczą płaszczyznę z, uzyskaj obrazy szeregów czasowych aktywności neuronalnej mózgu na określonej głębokości. Po zainstalowaniu napari i napari-animation utwórz nowy plik notesu Jupyter. Aby wizualizować obrazy i tworzyć filmy z renderowanym mózgiem danio pręgowanego, załaduj obraz 3D i otwórz okno napari, a następnie podłącz wtyczkę napari-animation.
Następnie ustaw parametry, takie jak rozmiar woksela, mapa kolorów i limity kontrastu w kontrolkach warstwy. Dostosuj ustawienia przeglądarki w obszarze roboczym. Następnie, aby przechwycić renderowany obraz, naciśnij przycisk Przechwyć w kreatorze animacji.
Aby wygenerować filmy z renderowanej objętości, zmodyfikuj ustawienia przeglądarki i dodaj klatki kluczowe. Po dodaniu klatek kluczowych ustaw liczbę klatek między klatkami kluczowymi w kreatorze animacji. Na koniec zapisz wyrenderowaną animację.
Wolumetryczne pole widzenia mózgu larwy danio pręgowanego wykazującego ekspresję panneuronalną GCaMP7a obejmowało obszary mózgu przodomózgowia, śródmózgowia i tyłomózgowia. Ciała komórek neuronalnych rdzenia przedłużonego, płytki móżdżku, tectum wzrokowego, habenuli i kresomózgowia grzbietowego były wyraźnie widoczne w całym mózgu larwy danio pręgowanego. W obrazowaniu funkcjonalnym 2D ciała komórek nerwowych były wyraźnie widoczne zarówno w tle, jak i w nałożonej aktywności neuronalnej.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół obrazowania całego mózgu in vivo u larw zebrafish z wykorzystaniem trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Model zebrafish jest preferowany ze względu na jego przezroczystość optyczną oraz dostępność genetyczną, co pozwala na badanie obliczeń i aktywności neuronalnej. Protokół odnosi się do powszechnych problemów, takich jak artefakty ruchowe i aberracje żelu agarozowego, zapewniając pozyskanie wysokiej jakości danych obrazowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Larwy danio przeziernego stanowią kluczowy model w badaniach nad aktywnością neuronalną ze względu na ich przezroczystość.
- Istotne wyzwania obejmują aberracje wywołane przez żel agarozowy oraz artefakty ruchowe podczas obrazowania.
- Obecne protokoły nie zawierają szczegółowych kroków dotyczących skutecznego montażu i pozycjonowania próbek.
- Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości jest niezbędne do zrozumienia obliczeń neuronalnych.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnego protokołu wysokiej jakości obrazowania aktywności mózgu rybek zebrafish.
- Zminimalizowanie szumów i artefaktów ruchowych podczas sesji obrazowania.
- Ułatwienie badania obliczeń neuronalnych w długich przedziałach czasowych.
Zastosowane metody
- Główną wykorzystaną platformą jest trójwymiarowa mikroskopia fluorescencyjna.
- Model biologiczny obejmuje larwy zebrafish, przygotowane i unieruchomione do obrazowania.
- Wprowadzono zoptymalizowany schemat doświadczalny, aby zapewnić minimalną liczbę artefaktów.
- Kluczowe etapy obejmują precyzyjne pozycjonowanie zebrafish oraz prawidłową regulację parametrów obrazowania.
- Wizualizację pozyskanych danych uzyskano przy użyciu narzędzi programistycznych, takich jak napari.
Główne wyniki
- Protokół obrazowania umożliwia kompleksową wizualizację obszarów mózgu, w tym struktur neuronalnych w przedmózgowiu, śródmózgowiu i tyłomózgowiu.
- Aktywność neuronalną można zarejestrować za pomocą obrazowania szeregów czasowych, co pozwala uzyskać istotne informacje na temat funkcji neuronów.
- Wyraźna widoczność wszystkich regionów mózgu świadczy o skuteczności protokołu.
Wnioski
- Niniejsze badanie demonstruje nowatorskie podejście do obrazowania, które zwiększa zrozumienie aktywności neuronalnej u rybek danio pręgowanych.
- Protokół ten nie tylko wyznacza standardy obrazowania rybek danio pręgowanych, ale ma również znaczenie dla szerszych badań nad układem nerwowym.
- Przewiduje się, że dalszy rozwój potoków przetwarzania obrazów usprawni mapowanie mózgu oraz badania nad obliczeniami neuronalnymi.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Trójwymiarowe obrazowanie fluorescencyjne mózgów larw zebrafish umożliwia wysokorozdzielcze mapowanie struktury i aktywności neuronalnej in vivo, wspierając odkrycia w neurobiologii na wczesnym etapie. Niniejszy protokół koncentruje się na powtarzalności oraz redukcji artefaktów, zapewniając solidne podstawy do ograniczania ryzyka mechanistycznego i walidacji celów w badaniach neurobiologicznych. Jego adaptacyjność oraz ilościowe wyniki sprawiają, że może on służyć jako wielokrotnego użytku narzędzie w korporacyjnych procesach B+R skoncentrowanych na analizie obwodów neuronalnych i przesiewaniu funkcjonalnym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę szlaków neuronalnych i aktywności komórkowej w modelu kręgowca.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez minimalizację artefaktów ruchu oraz aberracji obrazowania.
- Ułatwia uzyskanie wiarygodnych wyników prognostycznych w identyfikacji celów neuronalnych dzięki ilościowym danym z całego mózgu.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane, unieruchomione próbki Danio pręgowanego dla powtarzalnych procesów obrazowania.
- Standaryzuje parametry obrazowania i pozycjonowanie próbek w celu zapewnienia spójności analizy.
- Generuje ilościowe dane wolumetryczne oraz szeregi czasowe odpowiednie do dalszych analiz i przesiewów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia istotny w kontekście chorobowym system kręgowców do funkcjonalnego mapowania obwodów neuronalnych.
- Umożliwia przejście od obrazowania w fazie odkryć do rozwoju modeli przedklinicznych dla związków neuroaktywnych.
- Wspiera minimalizację ryzyka w procesie rozwoju dzięki dostarczaniu wysokich treści i powtarzalnych wyników obrazowania.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Niniejszy protokół obrazowania wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez, mapowanie szlaków sygnałowych oraz analizę ilościową w modelach neuronauki kręgowców.
- Biologia odkrywcza: Wspiera mapowanie aktywności i struktury neuronalnej oparte na hipotezach z rozdzielczością komórkową.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania dla badań nad perturbacjami genetycznymi lub chemicznymi.
- Analityka: Zapewnia wolumetryczne zbiory danych oraz serie czasowe do analizy komputerowej i porównywania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Wspiera rozwój modeli przedklinicznych, umożliwiając obrazowanie funkcjonalne w systemie kręgowców.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Protokół można dostosować do obrazowania innych organów lub układów u larw zebrafish, co wspiera skalowalność platformy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację w eksperymentach obrazowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową w portfelach neurobiologicznych.
- Wpływ na portfel: Umożliwia priorytetyzację celów neuronalnych i testów funkcjonalnych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z danio przebrzuchym, jego unieruchamianiu oraz w mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do platform obrazowania konfokalnego lub specjalistycznych systemów obrazowania fluorescencyjnego oraz narzędzi do analizy komputerowej.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania próbek i parametrów obrazowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w przypadku innych organów larw danio przebrzuchego, lecz może wymagać optymalizacji protokołu dla różnych tkanek.
- Potencjalne ograniczenia obejmują artefakty obrazowania wynikające z obecności agarozy oraz ruchy próbki w przypadku niepełnego unieruchomienia.
