Test żywotności Trichoderma stromaticum Conidia w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu interakcji między grzybami Trichoderma a układem odpornościowym ssaków. W jaki sposób niektóre gatunki Trichoderma powodują choroby? W jaki sposób mogą modulować układ odpornościowy i jak ta modulacja może wpływać na rozwój choroby?

Aby odpowiedzieć na to pytanie, używamy randomizowanych modeli in vitro. Pokazujemy, że gatunek Trichoderma moduluje makrofagi i neutrofile poprzez celowanie w receptory zaangażowane w proces fagocytozy. Receptory te obejmują receptory toll-podobne i receptory interleukiny.

Kiedy następuje spadek pojemności fagocytów komórek odpornościowych, zwiększa się podatność na patogeny, zwłaszcza patogeny wewnątrzkomórkowe. Grzyby mają wiele mechanizmów inwazji, aby przetrwać w żywicielu. Należą do nich unikanie fagocytozy i przetrwanie w makrofagach.

Gatunki patogenów wykorzystują makrofagi jako konie trojańskie, aby przetrwać inseminację gospodarza. Tutaj proponujemy dowiedzieć się, czy Trichoderma może przetrwać w makrofagach i jak długo przeżywają. Na początek umieść 10 mikrolitrów zawiesiny wyjściowej Trichoderma stromaticum na płytce PDA.

Inkubuj kulturę w temperaturze 28 stopni Celsjusza w ciemności przez 7 do 10 dni, aż konidia zostaną zaobserwowane, a kultura zmieni kolor na zielony, aby uzyskać świeże pokolenie F1. Umyj kulturę, dodając trzy do pięciu mililitrów PBS do płytki, a następnie zbierz i ponownie dozuj PBS na kulturę, aby stopniowo usunąć konidia. Powtarzaj ten proces, aż zawiesina zmieni kolor na ciemnozielony.

Odzyskaną zawiesinę z płytki przenieść do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować zawiesinę o stężeniu 1,160 G przez pięć minut w temperaturze 12 stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS. Zawieś ostatnią osadkę w dwóch do trzech mililitrach PBS i policz konidia w komorze Neubauera.

Przenieś krew pobraną od dawcy do 50-mililitrowej probówki i dodaj PBS, aby uzyskać końcową objętość 35 mililitrów. Powoli przenosić krew wzdłuż ścianki probówki zawierającej roztwór polisacharozy, aby utworzyć dwufazową zawiesinę. Natychmiast odwirować zawiesinę o stężeniu 1 600 G przez 30 minut w temperaturze 24 stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu obserwuj tworzenie się białego pierścienia zawierającego PBMC i zbierz go, delikatnie zasysając do 15-mililitrowej probówki. Następnie dodaj PBS do probówki zawierającej PBMC, aby uzyskać końcową objętość 10 mililitrów. Homogenizować zawiesinę i odwirowywać w stężeniu 1,600 G przez 30 minut w temperaturze 24 stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu przemyć komórki trzykrotnie w temperaturze 1 600 G przez pięć minut 10 mililitrami PBS przed ponownym zawieszeniem osadu w dwóch mililitrach pożywki R10. Aby potraktować makrofagi pochodzenia ludzkiego Trichoderma stromaticum conidia, za pomocą sterylnej pęsety dodaj okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe do każdego dołka 24-dołkowej płytki. Policz zawiesinę PBMC wyizolowaną z ludzkiej krwi i dostosuj objętość do płytki 8 razy od 10 do 5 komórek na studzienkę do końcowej objętości jednego mililitra z pożywką R10.

Po poszyciu użyj odwróconego mikroskopu. Obserwuj morfologię komórki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez siedem dni, zastępując pożywkę świeżą pożywką R10 co dwa dni w celu różnicowania monocytów w makrofagi.

Po siedmiu dniach obserwuj morfologię komórki za pomocą odwróconego mikroskopu. Następnie usuń pożywkę z każdej studzienki i umyj komórki jednym mililitrem PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i nieprzylegające komórki. Następnie przygotować zawiesinę T.stromaticum conidia o końcowym stężeniu 8 razy 10 do 4 konidiów na mililitr w pożywce R10.

Dodaj jeden mililitr zawiesiny do każdej studzienki, aby uzyskać wielokrotność infekcji 1:10. Rzuć wyzwanie makrofagom przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji usuń pożywkę i umyj komórki PBS, aby usunąć niefagocytowane konidia.

Następnie dodaj jeden mililitr pożywki R10 do każdej studzienki i inkubuj płytkę w różnym czasie. Po odpowiedniej inkubacji usuń pożywkę i dodaj jeden mililitr PBS do tej studzienki. Następnie za pomocą pęsety i igły usuń okrągłe szkiełka pokrywy z dołków.

Następnie zabejcuj szkiełka nakrywkowe za pomocą elementów zestawu do barwienia. Po wyschnięciu szkiełek nakrywkowych przymocuj je do szkiełka podstawowego za pomocą środka montażowego Aby oznaczyć żywotność konidiów, rzuć wyzwanie makrofagom za pomocą T.stromaticum conidia i inkubuj płytkę przez różne czasy w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla. Po każdej inkubacji należy dwukrotnie przemyć komórki PBS w celu usunięcia niefagocytozowanych konidiów.

Następnie dodaj 0,5 mililitra sterylnej wody destylowanej i inkubuj przez 30 minut. Po potwierdzeniu, że komórki są zlizowane, zbierz zawiesinę do 1,5-mililitrowej probówki. Odwirować zawiesinę o stężeniu 6 000 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucić supernatant przed ponownym podwieszeniem osadu w 10 mikrolitrach sterylnej wody destylowanej.

Wstrzyknąć 10 mikrolitrów zawiesiny na płytkę PDA i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza w ciemności. Na początku procesu fagocytozy zaobserwowano wolne konidia, konidia przyczepione do zewnętrznej błony makrofagów lub całkowicie zinternalizowane przez makrofagi. Wraz ze wzrostem czasu fagocytozy wolne i konidia przyczepione do błony zewnętrznej zostały całkowicie zinternalizowane przez makrofagi.

Konidia obserwowano również w górnej płaszczyźnie w porównaniu z makrofagami, a w tym samym makrofagu znaleziono więcej niż jedno konidium. Po długich okresach fagocytozowane konidia kiełkują wewnątrz makrofagów, a wolne konidia kiełkują w pożywce R10, tworząc strzępki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Fagocytozowane konidia pozostały żywotne nawet po 120 godzinach interakcji z makrofagami.

Po fagocytozie wzrost monitorowano pod kątem czasu potrzebnego do zajęcia przez kulturę całej płytki i wytworzenia kolorowych zielonych konidiów.