Name: Test żywotności Trichoderma stromaticum Conidia w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj metodę oceny żywotności konidiów Trichoderma stromaticum w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej. Technika ta pozwala badać mechanizmy przetrwania grzybów wewnątrz komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez następujące brazylijskie instytucje finansowe: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) z grantami RED0011/2012 i RED008/2014. U.R.S., J.O.C. i M.E.S.M. uznają stypendium przyznane odpowiednio przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) i FAPESB.

Kwestie etyczne i uczestnicy badania 
Wszystkie eksperymenty z udziałem ludzi opisane w niniejszej pracy zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską oraz brazylijskim prawem federalnym i zatwierdzone przez Komisję Etyczną State University of Santa Cruz (kod identyfikacyjny projektu: 550.382/ 2014).
Krew obwodowa ludzi została pobrana od zdrowych ochotników z miasta Ilhéus w stanie Bahia w Brazylii, którzy nie byli narażeni na działalność zawodową związaną z badanym grzybem. Wykluczono osoby z zgłoszonymi schorzeniami medycznymi lub przyjmujące leki. Wszyscy uczestnicy dobrowolnie zgodzili się na udział w badaniu i podpisali formularz świadomej zgody przed włączeniem do niniejszego badania.
1. Przygotowanie odczynników i roztworów
UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy należy przygotować następujące odczynniki i roztwory. Informacje dotyczące dostawców odczynników i materiałów znajdują się w Tabeli Materiałów (TOM).
<ol>
	<li>Przygotować zrównoważony sterylny roztwór soli buforowej z fosforanem (PBS) 1x. 
	UWAGA: W niniejszym protokole nie zastosowano PBS wolnego od endotoksyn.</li>
	<li>Przygotować podłoże agar ziemniaczano-dekstrozowe (PDA) i wlać po 20 mL do każdej szalki Petriego dla hodowli T. stromaticum. Przygotować sześć płytek z PDA dla każdego donora, wykorzystując jedną płytkę dla każdego stanu czasowego: 3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h. Dodatkowo przygotować trzy płytki dla każdej kontroli: trzy dla kontroli Trichoderma oraz trzy dla kontroli z podłożem R10. W celu optymalnego odzyskania konidiów należy użyć szalek Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm lub 100 mm x 15 mm.</li>
	<li>Sterylizować 100% glicerol.</li>
	<li>Przygotować podłoże R10 do hodowli komórkowej: podłoże RPMI uzupełnione o 10% płatkowej surowicy bydlęcej oraz 1% antybiotyku (penicylina/streptomycyna).</li>
	<li>Sterylizować wodę destylowaną do lizy komórek.</li>
	<li>Przygotować wodę o pH 7,0 do procesu barwienia. 
	UWAGA: W razie potrzeby skorygować pH za pomocą pH-metru oraz roztworów 0,1 M/L NaOH i 0,1 M/L HCl.</li>
	<li>Sterylizować okrągłe szkiełka zakryjące (13 mm) oraz pęsety.</li>
</ol>
2. Trichoderma stromaticum hodowla i przetwarzanie
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu matki (M1) z T. stromaticum: 
	UWAGA: Wymagane jest przygotowanie kultury matczynej (M1), aby zapewnić, że wszystkie eksperymenty zostaną przeprowadzone na kulturze z tego samego świeżego pokolenia (F1).
	<ol>
		<li>Hodowla T. stromaticum inakulum w szalkach Petriego z PDA w temperaturze 28 °C w ciemności przez 7–10 dni, aż do zaobserwowania konidiów i zazielenienia się kultury.</li>
		<li>Przemyć hodowlę T. stromaticumZa pomocą pipety dodaj 3–5 ml buforu PBS na powierzchnię hodowli. Zbierz PBS z płytki i ponownie nanieś go na hodowlę, aby stopniowo usuwać konidia za pomocą pipety. Powtarzaj ten proces tyle razy, ile będzie to konieczne, aż zawiesina stanie się ciemnozielona. 
		UWAGA: Alternatywnie, w celu odzyskania konidiów, sugeruje się delikatne przemycie kultury poprzez dodanie do płytki 3-5 ml PBS, a następnie wykonywanie ruchów okrężnych aż do momentu, gdy zawiesina zmieni kolor na zielony. Powtarzanie pipetowania pozwala na zebranie większej ilości konidiów.</li>
		<li>Przenieś odzyskaną zawiesinę z płytki do sterylnej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety. Powtórz kroki 2.1.2-2.1.3 tyle razy, ile będzie to konieczne, aby uzyskać więcej konidiów.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę przy 1160 x g przez 5 min w temperaturze 12 °Cnastępnie osad resuspender w 5 ml PBS. Powtórzyć ten krok (2.1.4) trzykrotnie, aby uzyskać zawiesinę wolną od strzępek. 
		UWAGA: Aby prawidłowo resuspendować osad, po wirowaniu zaleca się krótkie wymieszanie w wstrząsarzu wortexowym.</li>
		<li>Resuspenduj końcowy osad w 2–3 ml PBS, a następnie policz konidia w komorze Neubauera, stosując rozcieńczenie 1:100 lub 1:1000. 
		UWAGA: W optymalnych warunkach końcowe stężenie wynosi 2 x 108 konidiów/ml można odzyskać z hodowli. Ocena żywotności konidiów metodą wykluczania błękitu trypanu jest opcjonalna.</li>
		<li>Rozdziel zawiesinę do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml, dodając do każdej probówki 0,5 ml zawiesiny konidiów (z kroku 2.1.5). Następnie dodaj 0,5 ml sterylnego, 100% glicerolu, aby otrzymać zapasy M1. Krótko wymieszaj na wortexie, opisz probówki i przechowuj w temperaturze −20 °C lub −80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla T. stromaticum oraz pozyskiwanie konidiów do eksperymentu
	<ol>
		<li>Szalka 10 µL zawiesiny M1 (przygotowanej w kroku 2.1) w PDA przy 28 °C w ciemności przez 7–10 dni, aż do czasu zaobserwowania konidiów i zmiany koloru kultury na zielony, w celu uzyskania świeżej generacji F1. 
		UWAGA: Aby zapewnić świeżość *T. stromaticum* hodowla do eksperymentu, ocena czasu wymaganego do wzrostu grzyba oraz czasu wymaganego do różnicowania makrofagów.</li>
		<li>Zebrać konidia, powtarzając kroki 2.1.2–2.1.4.</li>
		<li>Resuspender końcowy osad w 2–3 ml PBS. Ocenić żywotność konidiów za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu lub policzyć konidia zgodnie z opisem w punkcie 2.1.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC)
UWAGA: PBMC uzyskuje się metodą bariery gęstości z wykorzystaniem roztworu polisacharozy o gęstości 1,077 g/mL30.
<ol>
	<li>Odmiar 15 mL roztworu polisacharozy do jednej probówki o pojemności 50 mL dla każdej próbki pobranej od dawcy.</li>
	<li>Pobierz 20 mL krwi od każdego dawcy, używając trzech lub czterech probówek z EDTA. Do każdego eksperymentu zakwalifikuj minimum czterech dawców. Nie łącz krwi od dawców; zamiast tego użyj każdej próbki osobno jako replikatu biologicznego. W przypadku każdego dawcy przenieś krew do jednej probówki 50 mL i dodaj PBS, aby uzyskać objętość końcową 35 mL.</li>
	<li>Powoli przenieś zawiesinę krwi (krok 3.2) wzdłuż ścianki probówki zawierającej roztwór polisacharozy (krok 3.1), aby utworzyć zawiesinę dwufazową. 
	UWAGA: Aby zapobiec zmieszaniu krwi z roztworem polisacharozy, dodawaj krew powoli. Do izolacji PBMC zaleca się użycie minimum 7 mL krwi od każdego dawcy.</li>
	<li>Natychmiast odwiruj probówkę z zawiesiną dwufazową przy 1 600 x g przez 30 min w temperaturze 24 °C. Zaprogramuj wirowanie PBMC: ustaw przyspieszenie 1 i hamowanie 0, aby uniknąć gwałtownego zatrzymania wirowania.</li>
	<li>Po wirowaniu zaobserwuj powstanie białego pierścienia zawierającego PBMC. Erytrocyty i granulocyty znajdują się w warstwie dolnej, następna warstwa zawiera roztwór polisacharozy, a PBMC znajdują się w białym pierścieniu pomiędzy roztworem polisacharozy a osoczem (warstwa górna). Zbierz biały pierścień, delikatnie aspirując go za pomocą pipety lub sterylnej pipety Pasteura, tak aby nie pobrać erytrocytów, osocza ani roztworu polisacharozy, i przenieś do probówki 15 mL.</li>
	<li>Dodaj PBS do probówki 15 mL zawierającej PBMC, aby uzyskać objętość końcową 10 mL. Zhomogenizuj zawiesinę i odwiruj probówkę przy 1 600 x g przez 30 min w temperaturze 24 °C.</li>
	<li>Przemyj komórki trzykrotnie przy 1 600 x g przez 5 min w temperaturze 24 °C przy użyciu 10 mL PBS. Następnie resuspenduj końcowy osad w 2 mL pożywki R10.</li>
	<li>Oceń żywotność komórek metodą wykluczania błękitu trypanu i policz komórki w komorze Neubauera.</li>
</ol>
4. Kinetyka fagocytozy
UWAGA: Makrofagi pochodzące z monocytów krwi obwodowej człowieka są traktowane konidiami T. stromaticum przy wielokrotności infekcji (MOI) 1:10 lub wyłącznie medium R10 jako kontrolą. Wielokrotność infekcji (MOI) reprezentuje stosunek dodanych czynników zakaźnych do celów infekcji i jest przedstawiana jako liczby bezwzględne: MOI = czynniki:cele31. W tym przypadku stosujemy 1 konidie T. stromaticum (czynnik) na 10 makrofagów (cele). Następnie komórki są inkubowane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez różne okresy czasu (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h). Następnie do wizualizacji przylegających makrofagów uczestniczących w procesie fagocytozy pod mikroskopem wykorzystuje się okrągłe szkiełko nakrywkę. Schemat doświadczenia przedstawiono na rysunku (Rysunek 1).
UWAGA: Sugeruje się użycie płytek 24-dołkowych.
<ol>
	<li>Traktowanie makrofagów pochodzenia ludzkiego konidiami T. stromaticum
	<ol>
		<li>Do każdego dołka za pomocą sterylnej pęsety wprowadź sterylną okrągłą szkiełko podstawowe (13 mm).</li>
		<li>Dostosuj objętość zawiesiny komórkowej uzyskanej w krokach 3.7-3.8, aby wysiać 8 x 105 komórek na dołek do końcowej objętości 1 mL w pożywce R10. Użyj mikroskopu odwróconego, aby ocenić morfologię komórek. 
		UWAGA: Komórki muszą być zawieszone w pożywce i mieć obły kształt.</li>
		<li>Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 7 dni, wymieniając pożywkę na świeżą pożywkę R10 co 2 dni w celu dyferencjacji monocytów w makrofagi32. Obserwuj morfologię komórek za pomocą mikroskopu odwróconego. Makrofagi będą wykazywać morfologię wrzecionowatą, z płaskimi i rozciągniętymi kształtami; można również zaobserwować zwiększony stosunek cytoplazmy oraz obecność pseudopodiów. Poszukuj adherentnych makrofagów pochodzenia mononuklearnego. 
		UWAGA: Bardzo niewielka proporcja nieróżnicujących się monocytów może pozostać w zawiesinie w pożywce.</li>
		<li>Usuń pożywkę z każdego dołka za pomocą pipety i przemyj komórki 1 mL PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i komórki nieadherentne.</li>
		<li>Używając zawiesiny przygotowanej w kroku 2.2, przygotuj nową zawiesinę konidii T. stromaticum o końcowym stężeniu 8 x 104 konidii/mL w pożywce R10.</li>
		<li>Do każdego dołka traktowanego (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h) dodaj 1 mL zawiesiny konidii przygotowanej w kroku 4.1.5, aby uzyskać MOI 1:10. Do kontrolek dodaj jedynie 1 mL pożywki R10.</li>
		<li> Poddaj makrofagi działaniu konidii T. stromaticum przez 3 h w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Po 3 h usuń pożywkę i przemyj komórki, aby usunąć niepofagocytowane konidia.</li>
		<li>Do każdego dołka dodaj 1 mL pożywki R10 i inkubuj płytkę przez różne odstępy czasu (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h) w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie i analiza
	<ol>
		<li>Po zakończeniu odpowiedniej inkubacji (krok 4.1.8) usuń pożywkę z każdego dołka i dodaj do niego 1 mL PBS.</li>
		<li>Wyjmij okrągłe szkiełka podstawowe z dołków za pomocą sterylnej pęsety i igły w celu zabarwienia przy użyciu zestawu do barwienia. 
		UWAGA: Alternatywnie barwienie można przeprowadzić metodą May-Grünwald-Giemsa33.</li>
		<li>Do każdego z okrągłych szkiełek podstawowych dodaj fiksator do barwienia (5 s), barwnik 1 (5 s), barwnik 2 (2 s) oraz wodę buforową o pH 7,0 (5 s), które są składnikami zestawu do barwienia. Odczekaj do wyschnięcia i przymocuj szkiełka podstawowe do szkiełka przedmiotowego za pomocą medium montażowego.</li>
		<li>Ilościowo określ wynik: Policz łącznie 100 makrofagów (Mø) dla każdego punktu czasowego. Używając mikroskopu optycznego i obiektywu 100x z olejem imersyjnym, policz liczbę makrofagów z pofagocytowanymi konidiami (równanie [1]). 
		<img alt="Wzór fagocytozy pokazujący procent konidii pochłoniętych przez makrofagi w badaniu mikrobiologicznym." src="/files/ftp_upload/65231/65231eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> (1)</li>
		<li>Oblicz liczbę pofagocytowanych konidii na makrofag: Wyznacz korelację liczby konidii obecnych w 100 makrofagach podzieloną przez liczbę makrofagów z co najmniej jedną pofagocytowaną konidią (równanie [2])34. 
		<img alt="Schemat wzoru pojemności fagocytycznej; analiza stosunku pofagocytowanych konidii do MΦ z konidiami." src="/files/ftp_upload/65231/65231eq02v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> (2) 
		​UWAGA: Do oceny i liczenia konidii można użyć oprogramowania ImageJ35.</li>
		<li>Wykonaj zdjęcia fagocytozy z każdej próbki i punktu czasowego, używając obiektywów 40x i 100x, aby przedstawić wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu hodowli Trichoderma; ustawienie różnicowania PBMC; analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65231/65231fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przedstawienie testu fagocytozy i żywotności konidiów z wykorzystaniem makrofagów pochodzących z monocyto-limfocytów krwi obwodnej człowieka. (1-10) Test fagocytozy: T. stromaticum należy hodować na PDA, a konidia odzyskać poprzez przemycie płytki PBS. PBMCs należy wyizolować metodą gradientu gęstości zgodnie z opisanym protokołem, hodować w płytkach 24-dołkowych z jałowymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi przez 7 dni w celu różnicowania w makrofagi, a następnie poddać działaniu z MOI 1:10 w różnych odstępach czasu. Okrągłe szkiełka nakrywkowe należy usunąć i zbarwić za pomocą zestawu do barwienia, a następnie przeanalizować wyniki za pomocą mikroskopii świetlnej. (1-8,11-13) Test żywotności konidiów: Po izolacji PBMCs hoduje się w płytkach 24-dołkowych bez okrągłych szkiełek nakrywkowych przez 7 dni w celu różnicowania w makrofagi, a następnie poddaje działaniu z MOI 1:10 przez różne odstępy czasu. Komórki należy zlizować poprzez inkubację z wodą destylowaną; zawiesinę następnie wirować, a resuspensionowanego osadu wysiać na PDA w celu analizy kinetyki wzrostu Trichoderma. Rycina ta została zaprojektowana przy użyciu bazy obrazów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65231/65231fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
5. Analiza żywotności konidiów po fagocytozie
UWAGA: Dołączono schemat projektu eksperymentalnego (Rycina 1).
UWAGA: Należy używać płytek 24-dołkowych.
<ol>
	<li>Poddaj makrofagi pochodzenia ludzkiego działaniu *T. stromaticum* konidia
	<ol>
		<li>Powtórzyć kroki 4.1.2–4.1.8 w celu zróżnicowania monocytów, a następnie poddać makrofagi działaniu T. stromaticum konidia. 
		UWAGA: W dołkach nie należy stosować okrągłych szkiełek nakrywkowych. Należy zastosować takie same odstępy czasowe, jakich użyto do badania kinetyki fagocytozy, aby możliwe było skorelowanie fagocytozy z żywotnością konidiów.</li>
		<li>Oceń wpływ pożywki R10 na T. stromaticum wzrost, wykorzystując studzienki z zawiesiną przygotowaną w kroku 4.1.5 (pożywka R10 + konidia) jako kontrolę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test żywotności konidiów
	<ol>
		<li>Po każdym okresie inkubacji (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h) należy usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS, aby usunąć konidia, które nie zostały pochłonięte w procesie fagocytozy. 
		UWAGA: Próbki kontrolne zawierające podłoże R10 i konidia nie powinny być płukane.</li>
		<li>Do każdego dołka należy dodać 0,5 ml sterylnej wody destylowanej, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez 30 min. Po tym czasie należy ocenić morfologię komórek pod mikroskopem odwróconym, aby upewnić się, że doszło do lizy komórek.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę i przenieść ją do probówek o pojemności 1,5 ml. Odwirować zawiesinę w miniwirówce z prędkością 6 000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie odlej supernatant, a pellet resuspender w 10 µL sterylnej wody destylowanej, a następnie zaszczepić 10 µL zawiesiny na płytkę zawierającą agar PDA przy 28 °C w ciemności.</li>
		<li>Przygotuj kontrolę pozytywną dla T. stromaticum wzrost: Należy użyć zawiesiny T. stromaticum konidia (krok 2.2), aby przygotować nową zawiesinę o stężeniu końcowym 8 x 106 konidia/ml. Wysiew na płytki. 10 µL tej zawiesiny w PDA w 28 °C w ciemności. 
		UWAGA: 10 µL tej zawiesiny będzie zawierać tę samą liczbę konidiów (8 x 104), której użyto do zainfekowania makrofagów pochodzących z monocytów krwi obwodowej. Różnica między tą kontrolą pozytywną a kontrolą wspomnianą w kroku 5.1.2 polega na tym, że kontrola opisana powyżej w kroku 5.1.2 służy do oceny potencjalnego wpływu pożywki R10 na Trichoderma wzrost podczas procesu fagocytozy. Ta kontrola pozytywna w kroku 5.2.5 z wykorzystaniem zawiesiny z T. stromaticum konidia zebrane w PBS stanowią kontrolę dla Trichoderma wzrost bez wpływu pożywki R10, aby odzwierciedlić naturalny sposób wzrostu grzyba. Dzięki zastosowaniu tej kontroli możliwe jest ocenienie, czy pożywka R10 wpływa na Trichoderma wzrost</li>
		<li>Obserwuj kinetykę wzrostu T. stromaticum codziennie na podłoże PDA i fotografować kulturę.</li>
		<li>Analiza: Do oceny wyników można wykorzystać dwa parametry: 1) czas (w dniach) potrzebny na zajęcie przez kulturę całej płytki hodowlanej oraz 2) czas (w dniach) do pojawienia się charakterystycznej zielonej pigmentacji T. stromaticum konidia w hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Zastosuj test Kruskala-Wallisa, aby określić statystycznie istotne różnice pomiędzy 8 grupami/wariantami traktowania. Przyjmij wartość p &lt; 0,05 za statystycznie istotną. Wszystkie dane przedstawiono jako średnie ± odchylenie standardowe (SD). Na rysunkach symbol # oznacza istotność statystyczną przy p &lt; 0,05.</li>
</ol>

Fungal Clearance Efficiency of Macrophages

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W przypadku kilku patogenów grzybiczych, w tym Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans i innych, fagocytoza konidialna lub drożdżakowa jest kluczowym procesem, który pozwala na badanie zdarzeń cytoplazmatycznych i molekularnych w interakcjach makrofag-patogen, a także na określenie czasu śmierci zinternalizowanych konidiów 14,39,40. Fagocytoza jest kluczowym procesem w interakcji Tric...

Rodzaj Trichoderma (Zamówienie: Hypocreales, Rodzina: Hypocreaceae) składa się z wszechobecnych, saprofitycznych grzybów, które są pasożytami innych gatunków grzybów i są zdolne do wytwarzania szeregu komercyjnie użytecznych enzymów1. Te gatunki grzybów są wykorzystywane do produkcji białek heterologicznych2, produkcji celulozy3, etanolu, piwa, wina i papieru4, w przemyśle tekstylnym5, przemyśle spożywczym6, oraz w rolnictwie jako środki kontroli biologicznej7,8. Oprócz przemysłowego zainteresowania tymi gatunkami grzybów, rosnąca liczba infekcji u ludzi nadała niektórym gatunkom Trichoderma status oportunistycznych patogenów9.
Trichoderma spp. szybko rośnie w kulturze, z początkowo białymi i bawełnianymi koloniami, które zmieniają kolor na zielonkawo-żółty do ciemnozielonego10. Są przystosowane do życia w szerokim zakresie warunków pH i temperatury, a gatunki oportunistyczne są w stanie przetrwać w fizjologicznym pH i temperaturach, a tym samym kolonizować różne tkanki ludzkie11,12,13. Co ważne, wzrost częstości zakażeń Trichoderma spp. może być związany z czynnikami wirulencji, a te nie są dobrze zbadane. Ponadto badania koncentrujące się na zrozumieniu odpowiedzi immunologicznej na oportunistyczne gatunki Trichoderma są nadal rzadkie.
Podczas infekcji, wraz z neutrofilami, makrofagi reprezentują linię obrony odpowiedzialną za fagocytozę, a tym samym zapobiegają wzrostowi i kolonizacji patogenów w różnych tkankach. Wykorzystując receptory rozpoznawania wzorców, takie jak receptory Toll-podobne i receptory lektyny typu C, makrofagi fagocytozują grzyby i przetwarzają je w fagolizosomy, promując w ten sposób wybuch oddechowy, uwalnianie cytokin prozapalnych i niszczenie mikroorganizmów fagocytozowanych14. Mechanizm fagocytozy może być jednak zakłócony i uniknięty przez różne strategie mikrobiologiczne, takie jak rozmiar i kształt komórek grzyba; obecność kapsułek utrudniających fagocytozę; zmniejszenie liczby receptorów indukujących fagocytozę; przebudowa struktury włókien aktynowych w cytoplazmie; utrudnianie tworzenia pseudopodiów; i ucieczka fagosomu lub fagolizosomu po procesie fagocytozy14.
Wiele patogenów, w tym Cryptococcus neoformans, wykorzystuje makrofagi jako niszę do przetrwania w organizmie gospodarza, rozprzestrzeniania się i wywoływania infekcji15. Test fagocytozy i klirensu służy do oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom oraz do identyfikacji strategii mikrobiologicznych stosowanych w celu uniknięcia wrodzonego układu odpornościowego15,16,17. Tego typu technika może być również wykorzystana do zbadania zróżnicowanej kinetyki fagocytozy, opóźnionego zakwaszenia fagosomu i wybuchu oksydacyjnego, które skutkują zmniejszonym zabijaniem grzybów18.
Różne metody mogą być używane do oceny fagocytozy, przeżywalności grzybów i unikania procesu dojrzewania fagosomu. Należą do nich mikroskopia fluorescencyjna, która służy do obserwacji fagocytozy, lokalizacji komórkowej i cząsteczek wytwarzanych podczas fagocytozy19; cytometria przepływowa, która dostarcza danych ilościowych na temat fagocytozy i służy do oceny różnych markerów zaangażowanych w ten proces20,21; mikroskopia przyżyciowa, która służy do oceny wychwytywania drobnoustrojów i dojrzewania fagosomów<klasa SUP="xref">22; fagocytoza za pośrednictwem przeciwciał, która służy do oceny swoistości procesu fagocytozy dla patogenu23; i inni24,25,26,27.
Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje powszechną, tanią i bezpośrednią metodę wykorzystującą mikroskop optyczny i test wzrostu płytki do oceny fagocytozy i zabijania konidiów grzybowych. Protokół ten dostarczy czytelnikom instrukcji krok po kroku dotyczących wykonywania testu fagocytozy i klirensu przy użyciu ludzkich makrofagów pochodzących z krwi obwodowej monojądrowej wystawionych na działanie T. stromaticum. PBMC zostały użyte, ponieważ Trichoderma conidia są stosowane jako biokontrola przeciwko fitopatogenom i bionawóz do upraw roślin na całym świecie i spowodowały kilka infekcji u ludzi, zwanych trichodermozą. Poza tym istnieją tylko dwie wcześniejsze prace skupiające się na interakcji między Trichoderma conidia a ludzkim układem odpornościowym, w których badaliśmy neutrofile28 i autofagię w makrofagach29. W artykule tym pokazano najpierw, w jaki sposób można badać fagocytozę konidiów T. stromaticum za pomocą makrofagów pochodzących z PBMC, a następnie jak można ocenić żywotność pochłoniętych konidiów za pomocą prostych technik opartych na mikroskopii. Protokół ten może dodatkowo ułatwić badania nad odpowiedzią immunologiczną związaną z makrofagami lub mechanizmami związanymi z modulacją układu odpornościowego.

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td>CLS431470</td><td>Probówki wirówkowe 15 mL, polipropylen, stożkowe dno z pokrywką, indywidualnie sterylna</td></tr><tr><td>24-dołkowa płaska płytka do hodowli komórkowych</td><td>Kasvi</td><td>K12-024</td><td>Wykonana z polistyrenu z oznaczeniem alfanumerycznym; Płytka do hodowli komórkowej jest wolna od DNaz, RNaz i pirogenów oraz substancji cytotoksycznych; Sterylizowane promieniowaniem gamma;</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 do hodowli komórkowych</td><td>Sanyo</td><td>303082</td><td>Inkubator CO2 służy do tworzenia i kontrolowania warunków podobnych do warunków życia ludzkiego, umożliwiając w ten sposób wzrost i proliferację różnych typów komórek in vitro.</td></tr><tr><td>Wirówka Mikroprobówka (typ eppendorf) 1,5 ml</td><td>Capp</td><td>5101500</td><td>Wykonana z polipropylenu, z nakrętką przymocowaną do probówki do otwierania i zamykania jedną ręką. Ma polerowane wnętrze zapobiegające adhezji białek i zapewniające widoczność próbki, ponieważ jest wolne od DNazy, RNazy i pirogenów</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe 15 mm</td><td>Olen</td><td>K5-0015</td><td>Szkiełka nakrywkowe okrągłe są stosowane w technikach mikroskopowych w hodowlach komórkowych. Wykonany z super przezroczystego półprzezroczystego szkła; o grubości 0,13 mm</td></tr><tr><td>Klasa II Typ B2 (Total Exhaust) Szafy bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Esco Lifesciences group</td><td>2010274</td><td>Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinet (AB2) zapewniają ochronę produktu, operatora i środowiska oraz nadają się do pracy ze śladowymi ilościami toksycznych chemikaliów i środków przypisanych do poziomów bezpieczeństwa biologicznego I, II lub III. W szafie klasy II typu B2 całe powietrze nawiewane i nawiewane jest po filtracji HEPA/ULPA odprowadzane do środowiska zewnętrznego bez recyrkulacji po powierzchni roboczej.</td></tr><tr><td>Dekstroza Agar ziemniaczany pożywka</td><td>Merck</td><td>145</td><td>Agar ziemniaczany dekstrozowy jest stosowany w hodowli i oznaczaniu liczby drożdży i grzybów</td></tr><tr><td>Probówka próżniowa do pobierania krwi EDTA</td><td>FirstLab</td><td>FL5-1109L</td><td>EDTA jest zalecanym antykoagulantem do rutynowych zabiegów hematologicznych, ponieważ jest to najlepszy antykoagulant do zachowania morfologii komórek.</td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>1.07961&nbsp;</td><td>Środek utrwalający; Entellan to bezwodne medium montażowe do stałego montażu do mikroskopii.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>A2720801</td><td>Surowica bydlęca płodu (FBS) jest&nbsp; Uniwersalny suplement wzrostu pożywek do hodowli komórkowych i tkankowych. FBS to naturalny koktajl większości czynników wymaganych do przyłączania, wzrostu i proliferacji komórek, skuteczny w przypadku większości typów komórek ludzkich i zwierzęcych (w tym owadów).</td></tr><tr><td>Flaticon</td><td></td><td></td><td>&nbsp; baza obrazów</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>24900988</td><td>Środek krioprotekcyjny glicerol służy do zamrażania komórek i zarodników</td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td></td><td></td><td>roztwór polisacharozy</td></tr><tr><td>Obraz J</td><td></td><td></td><td>&nbsp; Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Precision</td><td>7105</td><td>Szkiełko do mikroskopii 26 x 76 mm Matowe docierane Grubość 1,0 do 1,2 mm. Wykonane ze specjalnego szkła optycznego i zapakowane w przekładkę z jedwabnego papieru o wysokiej jakości przezroczystości wolnej od niedoskonałości</td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>Prism</td><td>C1801</td><td>Mini wirówka Prism została zaprojektowana tak, aby była niezwykle kompaktowa i zajmowała wyjątkowo mało miejsca. Zawiera 2 wymienne wirniki z szybkozłączką, które obracają się z prędkością do 6000 obr./min. Elektroniczny hamulec zapewnia szybkie zwalnianie, a samootwierająca się pokrywa umożliwia łatwy dostęp do próbki, skracając czas obsługi.</td></tr><tr><td>Komora Neubauera</td><td>Kasvi</td><td>K5-0011</td><td>Komora licząca Neubauera służy do liczenia komórek lub innych zawieszonych cząstek.</td></tr><tr><td>Szybkość panoptyczna&nbsp;</td><td>Laborclin</td><td>620529</td><td>Laborclin's&nbsp; panoptic fast c to zestaw do szybkiego barwienia w hematologii</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny - 10 000U</td><td>LGC- Biotechnologia&nbsp;</td><td>BR3011001</td><td>antybiotyk stosuje się w celu uniknięcia możliwego zanieczyszczenia przez manipulację zewnętrzną w stosunku do przepływu laminarnego.</td></tr><tr><td>szalka Petriego 90 x 15 mm Gładki</td><td>Cralplast</td><td>18248</td><td>Jednorazowa szalka Petriego; Wykonane z wysoce przezroczystego polistyrenu (PS); płaskie dno; Gładki; Rozmiar: 90 x 15 mm.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>thermo fisher Scientific</td><td>10010001</td><td>PBS to roztwór soli fizjologicznej na bazie wody o prostym składzie. Jest izotoniczny i nietoksyczny dla większości komórek. Zawiera chlorek sodu i bufor fosforanowy i został opracowany w celu zapobiegania szokowi osmotycznemu przy jednoczesnym utrzymaniu równowagi wodnej żywych komórek.</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur 3 ml Sterylna</td> pipeta <td>Accumax</td><td>AP-3-B-S</td><td>STERYLNA ACCUMAX PASTEUR 3 ML o pojemności 3 ml, wykonana z przezroczystego polietylenu o niskiej gęstości (LDPE) i indywidualnie sterylna</td></tr><tr><td>wirówka z chłodzeniem</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-HM16R</td><td>Wirówka z chłodzeniem Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R to wirówka z chłodzeniem z przyjaznym dla użytkownika panelem sterowania, który ułatwia wstępne ustawienie prędkości, wartości RCF, czas trwania,&nbsp; temperatury i profilu pracy. Megafuge 16R może osiągnąć maksymalne prędkości&nbsp; 15 200 obr./min i maksymalny RCF 25 830 x g.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Merck</td><td>MFCD00217820</td><td>HEPES Modification, z L-glutaminą i 25 mM HEPES, bez wodorowęglanu sodu, proszek, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Mikropipety jednokanałowe</td><td>Eppendorf</td><td>Z683809</td><td>Mikropipety jednokanałowe służą do dokładnego przenoszenia i pomiaru bardzo małych ilości cieczy.</td></tr><tr><td>Końcówka do mikropipetora</td><td>Corning</td><td>4894</td><td>pojemność 10 &mikro; L oraz 1,000 &mikro; L Autoklawowalny</td></tr><tr><td>trójokularowy mikroskop odwrócony</td><td>LABOMED</td><td>VU-7125500</td><td>Pozwala obserwować komórki wewnątrz probówek i butelek, bez konieczności ich otwierania, unikając w ten sposób problemów z zanieczyszczeniem.</td></tr></tbody></table>

test żywotności trichoderma stromaticum conidia w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej

Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages

Makrofagi reprezentują kluczową linię obrony i są odpowiedzialne za zapobieganie wzrostowi i kolonizacji patogenów w różnych tkankach. Fagocytoza konidialna jest kluczowym procesem, który pozwala na badanie zdarzeń cytoplazmatycznych i molekularnych związanych z interakcjami makrofagów-patogenów, a także na określenie czasu śmierci zinternalizowanych konidiów. Technika polegająca na fagocytozie konidiów grzybowych przez makrofagi jest szeroko stosowana w badaniach oceniających modulację odpowiedzi immunologicznej przeciwko grzybom. Unikanie fagocytozy i ucieczka fagosomów są mechanizmami zjadliwości grzybów. W tym miejscu przedstawiamy metody, które można zastosować do analizy fagocytozy, klirensu i żywotności T. stromaticum conidia, grzyba, który jest stosowany jako środek kontroli biologicznej i bionawozu i jest zdolny do wywoływania infekcji u ludzi. Protokół składa się z 1) hodowli Trichodermy, 2) przemywania w celu uzyskania konidiów, 3) izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu metody roztworu polisacharozy i różnicowania PBMC w makrofagi, 4) metody fagocytozy in vitro z wykorzystaniem okrągłych szkiełek nakrywkowych i barwienia oraz 5) testu klirensu w celu oceny żywotności konidiów po fagocytozie konidiów. Podsumowując, techniki te można wykorzystać do pomiaru skuteczności usuwania grzybów przez makrofagi.

Technika obejmująca fagocytozę konidiów grzybów przez makrofagi jest powszechnie stosowana w badaniach oceniających modulację odpowiedzi immunologicznych przeciwko grzybom. Wykorzystaliśmy fagocytozę konidiów T. stromaticum do oceny żywotności konidiów po fagocytozie, ponieważ unikanie fagocytozy i ucieczka z fagosomów są mechanizmami wirulencji grzybów. Badacze powinni wykonywać te techniki jako jedne z pierwszych testów podczas badania gatunków o znaczeniu klinicznym.
<p class="jove_content biglegend" fo:k...

Technika polegająca na fagocytozie konidiów grzybowych przez makrofagi jest szeroko stosowana do badań oceniających modulację odpowiedzi immunologicznej przeciwko grzybom. Celem pracy jest przedstawienie metody oceny zdolności fagocytozy i klirensu makrofagów pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej pochodzących z monojądrowych stymulowanych Trichoderma stromaticum conidia.

Test żywotności Trichoderma stromaticum Conidia w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu interakcji między grzybami Trichoderma a układem odpornościowym ssaków. W jaki sposób niektóre gatunki Trichoderma powodują choroby? W jaki sposób mogą modulować układ odpornościowy i jak ta modulacja może wpływać na rozwój choroby?Aby odpowiedzieć na to pytanie, używamy randomizowanych modeli in vitro. Pokazujemy, że gatunek Trichoderma moduluje makrofagi i neutrofile poprzez celowanie w receptory zaangażowane w proces fagocytozy. Receptory te obejmują receptory toll-podobne i receptory interleukiny.Kiedy następuje spadek pojemności fagocytów komórek odpornościowych, zwiększa się podatność na patogeny, zwłaszcza patogeny wewnątrzkomórkowe. Grzyby mają wiele mechanizmów inwazji, aby przetrwać w żywicielu. Należą do nich unikanie fagocytozy i przetrwanie w makrofagach.Gatunki patogenów wykorzystują makrofagi jako konie trojańskie, aby przetrwać inseminację gospodarza. Tutaj proponujemy dowiedzieć się, czy Trichoderma może przetrwać w makrofagach i jak długo przeżywają. Na początek umieść 10 mikrolitrów zawiesiny wyjściowej Trichoderma stromaticum na płytce PDA.Inkubuj kulturę w temperaturze 28 stopni Celsjusza w ciemności przez 7 do 10 dni, aż konidia zostaną zaobserwowane, a kultura zmieni kolor na zielony, aby uzyskać świeże pokolenie F1. Umyj kulturę, dodając trzy do pięciu mililitrów PBS do płytki, a następnie zbierz i ponownie dozuj PBS na kulturę, aby stopniowo usunąć konidia. Powtarzaj ten proces, aż zawiesina zmieni kolor na ciemnozielony.Odzyskaną zawiesinę z płytki przenieść do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować zawiesinę o stężeniu 1,160 G przez pięć minut w temperaturze 12 stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS. Zawieś ostatnią osadkę w dwóch do trzech mililitrach PBS i policz konidia w komorze Neubauera.Przenieś krew pobraną od dawcy do 50-mililitrowej probówki i dodaj PBS, aby uzyskać końcową objętość 35 mililitrów. Powoli przenosić krew wzdłuż ścianki probówki zawierającej roztwór polisacharozy, aby utworzyć dwufazową zawiesinę. Natychmiast odwirować zawiesinę o stężeniu 1 600 G przez 30 minut w temperaturze 24 stopni Celsjusza.Po odwirowaniu obserwuj tworzenie się białego pierścienia zawierającego PBMC i zbierz go, delikatnie zasysając do 15-mililitrowej probówki. Następnie dodaj PBS do probówki zawierającej PBMC, aby uzyskać końcową objętość 10 mililitrów. Homogenizować zawiesinę i odwirowywać w stężeniu 1,600 G przez 30 minut w temperaturze 24 stopni Celsjusza.Po odwirowaniu przemyć komórki trzykrotnie w temperaturze 1 600 G przez pięć minut 10 mililitrami PBS przed ponownym zawieszeniem osadu w dwóch mililitrach pożywki R10. Aby potraktować makrofagi pochodzenia ludzkiego Trichoderma stromaticum conidia, za pomocą sterylnej pęsety dodaj okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe do każdego dołka 24-dołkowej płytki. Policz zawiesinę PBMC wyizolowaną z ludzkiej krwi i dostosuj objętość do płytki 8 razy od 10 do 5 komórek na studzienkę do końcowej objętości jednego mililitra z pożywką R10.Po poszyciu użyj odwróconego mikroskopu. Obserwuj morfologię komórki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez siedem dni, zastępując pożywkę świeżą pożywką R10 co dwa dni w celu różnicowania monocytów w makrofagi.Po siedmiu dniach obserwuj morfologię komórki za pomocą odwróconego mikroskopu. Następnie usuń pożywkę z każdej studzienki i umyj komórki jednym mililitrem PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i nieprzylegające komórki. Następnie przygotować zawiesinę T.stromaticum conidia o końcowym stężeniu 8 razy 10 do 4 konidiów na mililitr w pożywce R10.Dodaj jeden mililitr zawiesiny do każdej studzienki, aby uzyskać wielokrotność infekcji 1:10. Rzuć wyzwanie makrofagom przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji usuń pożywkę i umyj komórki PBS, aby usunąć niefagocytowane konidia.Następnie dodaj jeden mililitr pożywki R10 do każdej studzienki i inkubuj płytkę w różnym czasie. Po odpowiedniej inkubacji usuń pożywkę i dodaj jeden mililitr PBS do tej studzienki. Następnie za pomocą pęsety i igły usuń okrągłe szkiełka pokrywy z dołków.Następnie zabejcuj szkiełka nakrywkowe za pomocą elementów zestawu do barwienia. Po wyschnięciu szkiełek nakrywkowych przymocuj je do szkiełka podstawowego za pomocą środka montażowego Aby oznaczyć żywotność konidiów, rzuć wyzwanie makrofagom za pomocą T.stromaticum conidia i inkubuj płytkę przez różne czasy w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla. Po każdej inkubacji należy dwukrotnie przemyć komórki PBS w celu usunięcia niefagocytozowanych konidiów.Następnie dodaj 0,5 mililitra sterylnej wody destylowanej i inkubuj przez 30 minut. Po potwierdzeniu, że komórki są zlizowane, zbierz zawiesinę do 1,5-mililitrowej probówki. Odwirować zawiesinę o stężeniu 6 000 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucić supernatant przed ponownym podwieszeniem osadu w 10 mikrolitrach sterylnej wody destylowanej.Wstrzyknąć 10 mikrolitrów zawiesiny na płytkę PDA i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza w ciemności. Na początku procesu fagocytozy zaobserwowano wolne konidia, konidia przyczepione do zewnętrznej błony makrofagów lub całkowicie zinternalizowane przez makrofagi. Wraz ze wzrostem czasu fagocytozy wolne i konidia przyczepione do błony zewnętrznej zostały całkowicie zinternalizowane przez makrofagi.Konidia obserwowano również w górnej płaszczyźnie w porównaniu z makrofagami, a w tym samym makrofagu znaleziono więcej niż jedno konidium. Po długich okresach fagocytozowane konidia kiełkują wewnątrz makrofagów, a wolne konidia kiełkują w pożywce R10, tworząc strzępki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Fagocytozowane konidia pozostały żywotne nawet po 120 godzinach interakcji z makrofagami.Po fagocytozie wzrost monitorowano pod kątem czasu potrzebnego do zajęcia przez kulturę całej płytki i wytworzenia kolorowych zielonych konidiów.

viability-assay-trichoderma-stromaticum-conidia-inside-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Jung, A. L. et al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia wstępne traktowanie makrofagów pęcherzykami błony zewnętrznej (OMV) Legionella pneumophila w celu zbadania ich wpływu na replikację bakterii. Zmieniając sygnalizację immunologiczną gospodarza, OMV sprawiają, że makrofagi są bardziej podatne na infekcje. Wyższa liczba kolonii w leczonych komórkach, w porównaniu z...

Oznaczanie replikacji Legionella pneumophila w makrofagach poddanych działaniu pęcherzyków błony zewnętrznej

W tym filmie demonstrujemy test efferocytozy do badania klirensu komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Efferocytoza to wieloetapowy proces, w którym komórki apoptotyczne są pochłaniane przez fagocyty i degradowane w pęcherzykach zwanych efferosomami. Protokół ten zapewnia metodę wizualizacji zinternalizowanych i niezinternalizowanych części poszczególnych komórek apoptotycznych oraz ilościowego określenia efferocytozy.

Test esterocytozy utrwalonych: metoda badania wychwytu efferocytarnego komórek apoptotycznych przez makrofagi przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film pokazuje obrazowanie żywych komórek do analizy aktywności przeciwgrzybiczej u ludzkich neutrofili przy użyciu fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus. Początkowo w neutrofilach wykrywana jest zarówno czerwona, jak i purpurowa fluorescencja, podczas gdy czerwona fluorescencja zmniejsza się z czasem, co wskazuje na degradację konidiów i potwierdza aktywność przeciwgrzybiczą neutrofili.

Ocena w czasie rzeczywistym aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Tutaj pokazujemy, jak cytometria obrazowa może być wykorzystana do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza w hodowli.  Ta technika może być używana jako alternatywa dla wyliczania CFU.

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Obecny artykuł przedstawia protokół do ustanowienia systemu modelowego hodowli komórkowych in vitro do badania interakcji fakultatywnego wewnątrzkomórkowego patogenu grzyba ludzkiego Candida glabrata z ludzkimi makrofagami, co będzie użytecznym narzędziem do poszerzenia naszej wiedzy o mechanizmach wirulencji grzybów.

Stworzenie systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w ludzkich makrofagach THP-1

Metoda oceny zdolności izolowanych makrofagów pęcherzykowych myszy do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

W tym artykule opisany jest protokół infekcji makrofagów Cryptococcus neoformans. Wyjaśniono również metodę usuwania steroli z makrofagów. Protokoły te stanowią przewodnik do badania zakażeń grzybiczych in vitro i badania roli steroli w takich infekcjach.

Zubożenie cholesterolu makrofagów i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Tutaj opisujemy protokół oceny aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus w połączeniu z mikroskopią wideo żywych komórek i cytometrią przepływową. Wygenerowane dane dostarczają informacji na temat interakcji między komórką gospodarza a Aspergillus, takich jak działanie grzybobójcze, fagocytoza, migracja komórek i hamowanie wzrostu grzybów.

Obrazowanie na żywo aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Poznaj metodę oceny żywotności konidiów Trichoderma stromaticum w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej. Technika ta pozwala badać mechanizmy przetrwania grzybów wewnątrz komórek immunologicznych.

Test żywotności Trichoderma stromaticum Conidia w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej

Przeglądaj więcej filmów