Name: Ocena wielkości kropelek lipidów i fuzji w komórkach wątroby bydła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę oceny wielkości kropelek lipidów i ich fuzji w komórkach wątroby bydła przy użyciu barwienia Oil Red O oraz obrazowania żywych komórek. To proste i powtarzalne podejście ułatwia badania metabolizmu lipidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspólnie wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (U1904116).

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie ze standardami etycznymi Komitetu Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Rolniczego Henan (prowincja Henan, Chiny).
1. Hodowla hepatocytów bydlęcych
<ol>
	<li>Rozmrozić pierwszorzędowe komórki hepatocytów17 i odwirować 400 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Pierwotne komórki hepatocytów były hodowane i utrzymywane zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem17.</li>
	<li>Wyrzucić zamrożony roztwór do przechowywania za pomocą pipety i zawiesić go w 1 ml pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco. Następnie użyj komory do liczenia komórek, aby obliczyć liczbę komórek na mililitr, a następnie oblicz stężenie powyższej zawiesiny komórek i dostosuj stężenie komórek do 1 x 107 komórek / ml.
	<ol>
		<li>Dodać zawiesinę komórkową do naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm zawierającego 3 ml powyższej pożywki. Hodować komórki i inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80%, wyrzuć pożywkę i spłucz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie dodaj 750 μl 0,25% trypsyny, aby strawić komórki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 minuty, a następnie zneutralizować je tą samą ilością 10% FBS. Zebrać zawiesinę komórkową do odwirowania przy 200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Barwienie O na czerwono
<ol>
	<li>Dodać 800 μl pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS i DMEM do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej szklane szkiełka nakrywkowe. Pobrać 50 μl zawiesiny komórkowej (otrzymanej w kroku 1.3) i dodać ją do 950 μl PBS w celu wymieszania. Użyj komory do zliczania komórek, aby obliczyć liczbę komórek na mililitr, a następnie oblicz stężenie powyższej zawiesiny komórek. Na koniec dostosować stężenie komórek do 4 x 104/ml w każdym dołku i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach wyrzucić pożywkę hodowlaną i przemyć PBS. Zawiesić za pomocą 800 μl pożywki indukcyjnej DMEM zawierającej 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Rozpuścić łącznie 100 μl LA (patrz tabela materiałów) w 900 μl bezwodnego etanolu i przygotować roztwór wzorcowy (100 mmol/l). Dodać gradient 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L i 200 μmol/L LA do płytki 24-dołkowej. Powtórz każdy zabieg cztery razy. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Utrwalić 400 μl 4% paraformaldehydu przez 20 minut. Wyrzucić roztwór utrwalający i przemyć go trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Inkubuj komórki z 60% alkoholem izopropylowym przez 5 minut, a następnie wyrzuć. Dodaj świeżo przygotowany roztwór roboczy czerwieni olejowej O (patrz tabela materiałów) (stosunek 3:2 czerwonego oleju O:woda) przez 20-30 minut i wyrzuć roztwór barwiący. Umyj komórki PBS dwa do pięciu razy, aż nie będzie nadmiaru roztworu barwnika.</li>
	<li>Dodać 300 μl roztworu barwiącego hematoksylinę (stosunek hematoksyliny do wody 1:10) i ponownie farbować jądro przez 1-2 minuty. Wyrzuć roztwór barwnika i umyj komórki PBS dwa do pięciu razy. Wyjąć szklane szkiełka nakrywkowe z płytki 24-dołkowej i umieścić je na szkiełkach mikroskopowych (strona z komórkami skierowanymi w dół) po upuszczeniu 10 μl szczeliwa w postaci tabletek (patrz tabela materiałów) na szkiełko.</li>
	<li>Po uszczelnieniu obserwuj i zobrazuj LD komórek pod soczewką olejową mikroskopu optycznego (patrz Tabela materiałów). Zmierz średnicę LD za pomocą oprogramowania cellSens i przeanalizuj liczbę i rozmiar LD.</li>
</ol>
3. Pomiar wielkości i liczby LD
<ol>
	<li>Przechwytywanie obrazów: Włączaj kolejno przełącznik komputera i mikroskopu, umieść szkiełko na platformie załadowczej, otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz Spis materiałów) i podłącz komputer, aby wyświetlić obraz.
	<ol>
		<li>Znajdź obrazy przy niskiej mocy i wlej odpowiednią ilość olejku cedrowego na szkiełko obrazowe. Dostosuj współczynnik obserwacji do 100x, ustaw automatyczną ekspozycję i uchwyć obrazy, dostosowując odpowiednie pole view. Wybierz trzy barwione slajdy komórkowe dla każdej grupy do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar średnicy: Losowo wybierz 60 LD dla każdego obrazu, aby zmierzyć średnice. Po pomiarze każdego obrazu zapisz obrazy i wprowadź wyniki pomiarów do tabeli w celu późniejszej analizy średniego rozmiaru i współczynnika dystrybucji LD.</li>
	<li>Pomiar ilości: Wybierz trzy obrazy dla każdego barwionego i sfotografowanego slajdu i losowo wybierz trzy komórki do pomiaru ilości na każdym obrazie. Policz i przeanalizuj liczbę LD wokół komórki i oblicz średnią liczbę LD w komórce.</li>
</ol>
4. Dynamiczna obserwacja fuzji LD
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami hodowli komórkowej, jak wspomniano w krokach 1.1-1.3. Gdy komórki osiągną 80%, wyrzuć pożywkę i spłucz PBS, a następnie traw je 750 μl trypsyny przez 3 minuty. Następnie dodać 750 μl pożywki, odwirować przy 200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej, policzyć i dostosować stężenie komórek do 5 x 105 komórek/ml w naczyniu o średnicy 35 mm. Hodowla w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną wzrost do 80%, zmień pożywkę na DMEM + 150 μmol/L LA przez 24 godziny i kontynuuj hodowlę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu akumulacji LDs.</li>
	<li>Po 24 godzinach usunąć pożywkę hodowlaną. Przemyć przylegające komórki PBS i inkubować je z neutralną sondą fluorescencyjną 10 μg/ml BODIPY 493/503 (patrz tabela materiałów) w ciemności przez 30 minut. Po inkubacji umyć komórki w naczyniu hodowlanym trzykrotnie PBS i dodać DMEM + 150 μmol/L LA. 
	UWAGA: Unikaj ekspozycji na światło w trakcie i po barwieniu 10 μg/ml BODIPY; 1 mg/ml produktu leczniczego BODIPY rozcieńczano PBS (1:100).</li>
	<li>Umieść naczynie hodowlane w rowku mikroskopu stacji żywej komórki (patrz Tabela materiałów), aby obserwować dynamiczne zmiany LD. Włącz zasilanie stacji roboczej żywej komórki zgodnie z sekwencją początkową i unikaj światła.
	<ol>
		<li>Włącz zasilanie, transmisyjne źródło światła, źródło zasilania mikroskopu, źródło światła fluorescencyjnego lampy rtęciowej, źródło zasilania kamery z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD), źródło zasilania hosta komputera, zawór CO2 i inkubator CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj wodę destylowaną do rowka na platformie ładunkowej, uważając, aby nie przejść przez otwór wentylacyjny.</li>
	<li>Włącz komputer i uruchom "NIS-Elements". Najpierw znajdź odpowiednie pole widzenia na soczewce obiektywu 4x, a następnie kolejno dostosuj je do soczewki obiektywu 40x. Wybierz E100 do obserwacji próbki w mikroskopie i L100 do podglądu i fotografowania próbki na komputerze. 
	UWAGA: E100 i L100 to przyciski regulacji mikroskopu na stacji roboczej z komórką mieszkalną (patrz Tabela materiałów), reprezentujące odpowiednio okular i ekran komputera.</li>
	<li>Zaprojektuj parametry, takie jak kanał fluorescencji (np. Ph-40x, izotiocyjanian fluoresceiny [FITC], migawka) i oczekiwany czas fotografowania dla eksperymentu. Ustaw czas fotografowania w czasie, w tym interwał fotografowania wynoszący 5 minut między każdymi dwoma zdjęciami i łączny czas fotografowania 6 godz. 
	UWAGA: Długotrwałe fotografowanie wymaga korzystania z funkcji stabilizacji ostrości systemu idealnego ustawiania ostrości (PFS). W tym celu najpierw dostosuj pole widzenia i długość ostrości, następnie kliknij PFS na ekranie komputera, a na koniec dostosuj spiralę precyzyjnego ustawiania ostrości.</li>
	<li>Wybierz różne tryby kanału, pojedynczy kanał lub wszystkie, wybierz inne pole view, kliknij podgląd, dostosuj pole widzenia, ustaw te parametry i kliknij rozpocznij bieg, aby rozpocząć strzelanie. Najpierw zrób zdjęcie próbne przez 5 minut; Może to zająć dużo czasu po tym, jak operacja jest normalna.</li>
	<li>Po wykonaniu nagrywania wybierz Plik > Zapisz jako > Zapisz typ > formacie avi, aby wyeksportować dane do filmu w formacie "avi". Użyj formatu obrazu ".nd2", aby zapisać program danych i wyeksportować zdjęcia.</li>
	<li>Aby wyłączyć urządzenie, wyłącz je w odwrotnej kolejności.</li>
</ol>
5. Statystyki i analiza wyników
<ol>
	<li>Analizowanie danych przy użyciu jednokierunkowej usługi ANOVA. Podaj wyniki jako średni ± błąd standardowy.</li>
</ol>

Live Cell Imaging of Lipid Droplet Size and Fusion Using Oil Red O and BODIPY

<ol><li>Fujimoto, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+just+fat%3A+the+structure+and+function+of+the+lipid+droplet%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Not just fat: the structure and function of the lipid droplet.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838(2011).</li>
<li>Grasselli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+potential+translational+value%3A+The+effects+of+3%2C5-L-diiodothyronine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine.</a> Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).</li>
<li>Herdt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruminant+adaptation+to+negative+energy+balance%3A+Influences+on+the+etiology+of+ketosis+and+fatty+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).</li>
<li>Pino-de la Fuente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+regulation+of+hepatic+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism.</a> Life Sciences. 298, 120522(2022).</li>
<li>O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mega-stokes+pyrene+ceramide+conjugates+for+STED+imaging+of+lipid+droplets+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells.</a> Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+droplet+fusion+and+growth+by+CIDE+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).</li>
<li>Tütüncü Konyar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+insoluble+polysaccharides+and+neutral+lipids+in+the+developing+anthers+of+an+endangered+plant+species%2C+Pancratium+maritimum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Systematics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum.</a> Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).</li>
<li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY+%28493%2F503%29+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358(2011).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+characterization+of+intracellular+lipids+in+situ+by+Nile+Red+red%2Fyellow+emission+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio.</a> Micron. 39 (7), 819-824 (2008).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+polarity-sensitive+fluorescent+dyes+based+on+the+BODIPY+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Dyes+and+Pigments%22%5BJournal%5D)">The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore.</a> Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials. 11 (9), 1768(2018).</li>
<li>Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases%2C+reproductive+performance%2C+and+changes+in+milk+production+associated+with+subclinical+ketosis+in+dairy+cows%3A+A+meta-analysis+and+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review.</a> Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).</li>
<li>Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+elevated+nonesterified+fatty+acids+and+%CE%B2-hydroxybutyrate+concentrations+with+early+lactation+reproductive+performance+and+milk+production+in+transition+dairy+cattle+in+the+northeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States.</a> Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).</li>
<li>Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+experimental+steatosis+in+vitro%3A+hepatocyte+cell+culture+in+lipid+overload-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62543(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nonesterified+fatty+acids+on+the+synthesis+and+assembly+of+very+low+density+lipoprotein+in+bovine+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).</li>
<li>Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+their+interactions+with+other+organelles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).</li>
<li>Sanjabi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+hypertrophy%3A+a+crucial+determining+factor+in+insulin+regulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes.</a> Scientific Reports. 5, 8816(2015).</li>
<li>Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subtle+balance+between+lipolysis+and+lipogenesis%3A+a+critical+point+in+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis.</a> Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).</li>
<li>Yang, A., Mottillo, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+lipolysis%3A+from+molecular+mechanisms+of+regulation+to+disease+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics.</a> Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).</li>
<li>Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+liver+disease%3A+from+basic+biology+to+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).</li>
<li>Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+myocellular+fat+stores%3A+lipid+droplet+dynamics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).</li>
<li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cis-and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626(2020).</li>
<li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li>
<li>Fei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphatidic+acid+in+the+formation+of+%26%2334%3Bsupersized%26%2334%3B+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for phosphatidic acid in the formation of &#34;supersized&#34; lipid droplets.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002201(2011).</li>
<li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+fluorescent+dye+BODIPY+in+the+study+of+lipid+dynamics+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecules. 23 (7), 1594(2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

W zależności od stanów patologicznych, wątrobowe LD ulegają ogromnym zmianom w swojej wielkości i liczbie. LD są szeroko obecne w komórkach hepatocytów i odgrywają kluczową rolę w zdrowiu i chorobach wątroby18. Ilość i wielkość LD są podstawą obecnych badań nad biogenezą LD19. Wielkość i liczba LD dla komórek i tkanek odzwierciedla ich zdolność do magazynowania i uwalniania energii. Dynamiczne zmiany LD utrzymują stabilność aktywności metabolicznej lipidów...

Nagromadzenie kropelek lipidów (LD) w hepatocytach jest typową cechą niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD), która może prowadzić do zwłóknienia wątroby i raka wątrobowokomórkowego. Stwierdzono, że najwcześniejszą manifestacją stłuszczenia wątroby jest stłuszczenie, charakteryzujące się akumulacją LD w cytoplazmie hepatocytów1. Stłuszczenie wątroby jest niezmiennie związane ze zwiększoną liczbą i/lub rozszerzonym rozmiarem LDs2. Uważa się, że LD są generowane z retikulum endoplazmatycznego (ER), składającego się z trójglicerydów (TG) jako rdzenia, i są otoczone białkami i fosfolipidami3. Jako organelle subkomórkowe odpowiedzialne za magazynowanie TG, LD wykazują różne cechy dotyczące ich wielkości, liczby, składu lipidowego, białek i interakcji z innymi organellami, z których wszystkie wpływają na homeostazę energetyczną komórki4. Poziom TG jest dodatnio skorelowany z wielkością LDs, a wyższa wewnątrzkomórkowa zawartość TG może tworzyć większe LDs5. LD zwiększają swój rozmiar poprzez lokalną syntezę TG, inkorporację lipidów w ER i fuzję wielu LDs6. Komórki (adipocyty, hepatocyty itp.), które zawierają duże LD, mają specjalny mechanizm skutecznego zwiększania magazynowania lipidów przez fuzję LD. Dynamiczne zmiany LD odzwierciedlają różne stany metabolizmu energetycznego komórki. Kluczowe znaczenie ma opracowanie metodologii, które pozwolą na obserwację i analizę różnych LD wątrobowych w zdrowych i nieprawidłowych komórkach.
Głównymi niefluorescencyjnymi barwnikami dla LD są Sudan Black B i olej czerwony O. Sudan Black B barwi neutralne lipidy, fosfolipidy i sterydy7. Czerwień olejowa O jest używana głównie do barwienia LD mięśni szkieletowych, kardiomiocytów, tkanki wątroby, komórek tłuszczowych itp<klasa sup = 'xref'>8. i jest uważana za standardowe narzędzie do ilościowego wykrywania stłuszczenia wątroby u myszy i ludzi <klasa sup = 'xref'>9. Dynamiczna zmiana LD odbywa się głównie za pomocą barwienia fluorescencyjnego. Czerwień nilowa i BODIPY są powszechnie stosowanymi fluorescencyjnymi barwnikami lipidowymi10,11. W porównaniu z czerwienią nilową, BODIPY ma silniejszą przepuszczalność tkanek i lepiej wiąże się z LDs12. LD znakowane BODIPY mogą być używane do barwienia żywych komórek i kolokalizacji z innymi organellami13.
Częstość występowania stłuszczenia wątroby jest znacznie wyższa u przeżuwaczy niż u zwierząt monogastrycznych14. W okresie przejściowym krowy mleczne doświadczają stanu ujemnego bilansu energetycznego3. Duże ilości nieestryfikowanych kwasów tłuszczowych (kwas palmitynowy, kwas oleinowy, kwas linolowy itp.) są syntetyzowane w TG w hepatocytach bydlęcych, co prowadzi do nieprawidłowości funkcjonalnych wątroby i znacznie obniża jakość produktów mlecznych i wydajność produkcji15. Niniejsze badanie ma na celu opracowanie protokołu do analizy wielkości i liczby LD, a także do monitorowania dynamiki fuzji LD. Skonstruowaliśmy model powstawania LD poprzez dodanie różnych stężeń kwasu linolowego (LA) w hepatocytach16 i obserwowaliśmy zmiany wielkości i liczby LD podczas procesu poprzez barwienie LD czerwienią olejową O. Ponadto zaobserwowano również proces szybkiego łączenia LD poprzez barwienie BODIPY 493/503.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna</td><td>Odczynnik Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Odczynnik Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>odczynnik do 2295015 invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olej cedrowy</td><td>Solarbio</td><td>C7140</td><td>odczynnik</td></tr><tr>do liczenia komórek <td>wyposażenie</td><td>komory</td><td></td><td></td> do</tr><tr><td>hodowli komórkowych Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do wykrywania komórek materiałowych&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Olympus IX73</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sprzęt Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Odczynnik Gibco</td><td>2492319</td><td></td></tr><tr><td>hematoksylina</td><td>DingGuo</td><td>AR0712</td><td></td></tr><tr><td>Widok obrazu</td><td></td><td></td><td>analiza obrazu sodtware</td></tr><tr><td>kwas linolowy</td><td>Solarbio</td><td>SL8520</td><td>odczynnik</td></tr><tr><td>Live Cell Station</td><td>Nikon A1 HD25</td><td></td><td>wyposażenie</td></tr><tr><td>NIS-Elements&nbsp;</td>Olej <td>do oprogramowania</td> <td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>czerwony O</td><td>Solarbio</td><td>G1260</td><td>odczynnik</td></tr><tr><td>mikroskop optyczny</td><td>Olympus IX73</td><td></td><td>sprzęt</td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna 100 razy;</td><td>Odczynnik NCM Biotech</td><td>CLOOC5</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana solą</td><td>fizjologiczną</td><td>Hyklon</td><td>SH30258.01</td></tr><tr><td>odczynnik Pipeta</td><td>Sprzęt Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środek uszczelniający</td><td>Odczynnik Solarbio</td><td>S2150</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena wielkości kropelek lipidów i fuzji w komórkach wątroby bydła

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

Kropelki lipidów (LDs) to organelle, które odgrywają ważną rolę w metabolizmie lipidów i neutralnym magazynowaniu lipidów w komórkach. Są one związane z różnymi chorobami metabolicznymi, takimi jak otyłość, stłuszczenie wątroby i cukrzyca. W komórkach wątroby rozmiary i liczba LD są oznakami stłuszczenia wątroby. Co więcej, reakcji stresu oksydacyjnego, autofagii komórkowej i apoptozie często towarzyszą zmiany rozmiarów i liczby LD. W związku z tym wymiary i ilość LD są podstawą obecnych badań nad mechanizmem biogenezy LD. Tutaj, w komórkach wątroby bydlęcej indukowanych kwasami tłuszczowymi, opisujemy, jak używać czerwieni olejowej O do barwienia LD oraz do badania rozmiarów i liczby LD. Rozkład wielkości LD jest analizowany statystycznie. Proces łączenia się małych LD w duże LD jest również obserwowany przez system obrazowania żywych komórek. Obecne prace pozwalają na bezpośrednią obserwację trendu zmiany wielkości LD w różnych warunkach fizjologicznych.

Barwienie kropli lipidowych (LD) w komórkach przedstawiono na Rysunku 1. Czerwone kropki reprezentują komórkowe LD, a niebieskie kropki reprezentują jądra komórkowe. Można zauważyć, że pod wpływem działania LA rozmiar i liczba LD na każdym zdjęciu są różne.
Wraz ze zwiększeniem dawki LA, średnica i liczba LD wykazywały tendencję do znaczącego wzrostu w zależności od stężenia LA (Rysunek 2). Jak pokazano na Rysunku...

Obecny protokół opisuje, jak używać czerwonego oleju O do barwienia kropelek lipidów (LDs), obliczać wielkość i liczbę LD w modelu hepatocytów tłuszczowych indukowanych kwasami tłuszczowymi, oraz używać BODIPY 493/503 do obserwacji procesu łączenia się małych LD w duże LD za pomocą obrazowania żywych komórek.

Ocena wielkości kropelek lipidów i fuzji w komórkach wątroby bydła

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

Nasze badania koncentrują się na liczbie kropelek lipidów i wielkości indukowanej przez kwas linolowy w komórkach wątroby. Dodatkowo naszym celem jest dostarczenie wglądu w mechanizm stłuszczenia wątroby. Ostatnie postępy w tej dziedzinie badań sugerują, że cholina, CCT alfa, ustanowiona indukowana autofagia, może regulować wielkość kropelek lipidów w komórkach wątroby bydła.Co więcej, obserwacje na stanowiskach pracy z żywymi komórkami wykazały, że fosfolipidy mają znaczący wpływ na fuzję kropelek lipidów. Obecnie wspomaganie genów, pęseta fluorescencyjna, chromatografia cieczowa, analiza omiczna, chromatografia pojedyncza, cytometria przepływowa i inne technologie są wykorzystywane do grupowania rozległych badań w tej dziedzinie. Metoda eksperymentalna ma pewne ograniczenia.Na przykład zjawisko ograniczonych pól można zaobserwować tylko w przypadku pól kropelek lipidów i pod pewnym lotem odpadów. Barwienie czerwienią olejową O jest wygodniejsze, tańsze i szerzej stosowane do pomiaru pozornej wielkości kropelek lipidów niż barwienie fluorescencyjne kropelek lipidów. Jest prosty w obsłudze i wymaga mniej sprzętu.Co więcej, bezpośrednio obserwujemy ten fenomenalny proces fuzji lipid

evaluation-of-lipid-droplet-size-and-fusion-in-bovine-hepatic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono dwie techniki izolowania kropelek lipidów komórkowych z 1) komórek drożdży i 2) ludzkich łożysk. Centralnym elementem obu procedur jest wirowanie w gradionym gradimencie gęstości, w którym powstałą pływającą warstwę zawierającą kropelki można łatwo zwizualizować za pomocą oka, wyekstrahować i określić ilościowo za pomocą analizy Western Blot w celu uzyskania czystości.

Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Ten protokół ustanawia nowatorską metodę izolacji i oczyszczania kropelek lipidów z wątroby myszy, przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego.

Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół indukowania stłuszczenia pęcherzyków wątroby w zróżnicowanych komórkach HepaRG za pomocą soli kwasu tłuszczowego oleinianu sodu i stosujemy metody wykrywania i kwantyfikacji akumulacji lipidów, w tym koherentną mikroskopię rozpraszania Ramanowskiego (CARS), analizę cytofluorymetryczną, barwienie czerwienią olejową O i qPCR.

Indukowanie i charakterystyka stłuszczenia pęcherzykowego w zróżnicowanych komórkach HepaRG

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

Ten artykuł opisuje użycie komórek HepG2 indukowanych kwasem oleinowym jako modelu dla stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną.

Modelowanie in vitro odkładania się tłuszczu w stłuszczeniowej chorobie wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną

Ten protokół umożliwia reprodukowalną wizualizację kropli lipidowych i dynamiki organelli podczas mitozy z wykorzystaniem zsynchronizowanych komórek hepatomu.

Metoda oparta na fluorescencji do wizualizowania dynamiki kropelek lipidowych i organelli podczas mitozy w komórkach hepatoma

Pierwotne hepatocyty stanowią cenne narzędzie do oceny funkcji biochemicznych, molekularnych i metabolicznych w fizjologicznie istotnym systemie eksperymentalnym. Opisujemy niezawodny protokół perfuzji wątroby szczura in situ, który pozwala na konsekwentne uzyskiwanie żywotnych hepatocytów w ilości do 1,0 × 108 komórek na preparat, przy żywotności komórek w zakresie 88 ~ 96%.

Izolacja i hodowla pierwotna komórek wątroby szczura

Opracowaliśmy test fuzji komórek, który pozwala na ilościowe określenie zdarzeń fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy.

Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Poznaj metodę oceny wielkości kropelek lipidów i ich fuzji w komórkach wątroby bydła przy użyciu barwienia Oil Red O oraz obrazowania żywych komórek. To proste i powtarzalne podejście ułatwia badania metabolizmu lipidów.

Ocena wielkości kropelek lipidów i fuzji w komórkach wątroby bydła

Przeglądaj więcej filmów