Name: Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę wyrównania obrazów vis-OCTF in vivo z obrazami konfokalnymi siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia walidację morfologii pęczków aksonów komórek zwojowych siatkówki w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 oraz Knights Templar Eye Foundation.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Wirginii i były zgodne z wytycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt z Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Obrazowanie in vivo vis-OCT
<ol>
	<li>System vis-KTZ
	<ol>
		<li>Wyobraź sobie oczy myszy za pomocą systemu vis-OCT dla małych zwierząt, który wykorzystuje źródło światła superkontinuum, które zapewnia oświetlenie światłem widzialnym w zakresie od 480 nm do 650 nm. Upewnij się, że moc padająca na rogówkę wynosi 1 mW i użyj częstotliwości linii A 25 kHz i czasu integracji 39,3 μs na linię A.</li>
		<li>Upewnij się, że zakres detekcji spektralnej spektrometru wynosi od 508 nm do 613 nm, co zapewnia rozdzielczość osiową 1,3 μm w siatkówce. Całkowita objętość obrazowania wynosi około 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1 500 μm (z). Rozdzielczość boczna wynosi od 4,5 μm w środku pola widzenia do 8,7 μm w odległości 350 μm od środka11,13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie myszy
	<ol>
		<li>Znieczulij myszy o pochodzeniu C57BL/6 i dowolnej płci za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia koktajlu ketaminy (114 mg / kg) i ksylazyny (17 mg / kg) i rozszerz ich źrenice za pomocą 1% kropli tropikamidowych. Potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez utratę odruchu pedałowania po mocnym uszczypnięciu palca</li>.
		<li>Podczas obrazowania utrzymuj mysz w cieple za pomocą lampy grzewczej na podczerwień. Po każdym pobraniu obrazu zastosuj sztuczne łzy, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozycjonowanie myszy do obrazowania
	<ol>
		<li>Umieść znieczuloną mysz na uchwycie na zwierzę i utrzymuj mysz w odpowiedniej pozycji za pomocą dwóch pasków na rzepy. 
		UWAGA: Uchwyt na zwierzę umożliwia ruch w trzech wymiarach (regulacja w pionie, precyzyjna regulacja w poziomie, a także regulacja nachylenia i odchylenia) w celu umieszczenia lasera w oku myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosowywanie parametrów obrazowania
	<ol>
		<li>Włącz komputer i otwórz oprogramowanie, do którego się odwołuje, które automatycznie włączy laser.</li>
		<li>Wyreguluj uchwyt zwierzęcia, aż laser będzie stabilny i wyśrodkowany w oku myszy. Wizualizuj tylną część oka za pomocą podglądu En Face w interfejsie oprogramowania, pola widzenia (FOV) powierzchownego splotu naczyniowego i B-scan, przekroju siatkówki w obrębie FOV.</li>
		<li>Uzyskaj wolumin vis-OCT, klikając przycisk Acquire w interfejsie oprogramowania po wykonaniu drobnych regulacji ostrości optycznej, która składa się z 512 linii A/B-skan i 512 B-skanów/objętość. 
		UWAGA: Ten proces trwa ~10,5 s. Akwizycja obrazu jest sterowana przez wbudowany estymator indeksu jakości (QI), aby zapewnić, że obrazy poniżej określonego progu (QI < 45) nie są uwzględniane.
		<ol>
			<li>Dla każdej myszy pobierz cztery woluminy vis-OCT z tego samego oka. Ustaw głowę nerwu wzrokowego (ONH) w każdym z czterech rogów pola widzenia, aby pokryć różne obszary siatkówki. 
			UWAGA: Takie umieszczenie minimalizuje krzywiznę siatkówki, co maksymalizuje współczynnik odbicia RNFL w całym polu widzenia. Potrzeba ~1 minuty, aby przestawić oko pomiędzy każdym akwizycją (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza Vis-OCTF 
	UWAGA: MATLAB służy do wykonywania analizy obrazu.
	<ol>
		<li>Aby wygenerować fibergramy vis-OCT z objętości vis-OCT, użyj metody progowej opartej na intensywności (linia kodu MATLAB 808) w celu wykrycia powierzchni siatkówki. 
		UWAGA: Te linie używają funkcji nieregulacji do regulacji wartości intensywności bscan. Argument [0,0087 0,08] przekazany do imadjust określa zakres intensywności, który ma być odwzorowany na pełny zakres dynamiczny obrazu wyjściowego.</li>
		<li>Przytnij RNFL, wybierając pierwszą głębokość ~16 μm. Zobacz wiersz kodu Matlab 782. 
		UWAGA: Typowa grubość RNFL in vivo u dorosłej myszy C57BL/6 typu dzikiego wynosi ~14 μm i może się różnić w zależności od metody segmentacji13.</li>
		<li>Zmień ścieżki pliku RAW (wiersz 9), Pliki do rekonstrukcji (wiersz 11) i nazwę pliku (wiersz 15), kliknij Uruchom i poczekaj, aż obraz OCT zostanie przeanalizowany przez kod MATLAB. Oblicz rzut średniej intensywności wzdłuż kierunku osiowego (z) (linie kodu MATLAB 905-908), aby wygenerować obraz fibergramu składający się z wiązek aksonów RGC i otaczających naczyń krwionośnych. Zmontuj cztery obrazy po przetworzeniu fibergramu dla każdego pola widzenia, wyrównując naczynia krwionośne za pomocą wybranego edytora graficznego, o łącznych wymiarach ~1,2 x 1,2 mm. Pliki RAW są zwykle zapisywane w folderze: Halo Data, pod datą obrazowania OCT (np. 0606 Opticent). 
		UWAGA: Kody MATLAB są dostępne w pliku uzupełniającym 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie konfokalne ex vivo
<ol>
	<li>Eutanazja myszy
	<ol>
		<li>Po uzyskaniu danych vis-OCT należy poddać myszy eutanazji mieszaniną pentobarbitalu sodu (390 mg/ml) i fenytoiny sodowej (50 mg/ml). Fenytoina sodowa działa poprzez wzmacnianie działania pentobarbitalu sodu, który jest szeroko stosowany w eutanazji gryzoni14,15. Dla każdej myszy użyj 0,2 ml/20 g rozcieńczonej mieszaniny (156 mg/ml) i przetnij 20 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie 20 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS16,17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie i orientacja oka
	<ol>
		<li>Wyłuszczyć oczy i zrobić znak po stronie skroniowej, aby wskazać orientację.</li>
		<li>Po dokładnym usunięciu przedniej komory, soczewki ocznej, ciała szklistego i zamocować muszle oczne w PFA na 30 min.</li>
		<li>Myj muszle oczne PBS przez 30 minut, a roztwór PBS wymieniaj 3x podczas mycia. Następnie myć 0,5% Triton X-100 w PBS (pH 7,5) przez 30 min.</li>
		<li>Inkubować muszle oczne w buforze blokującym (5% surowica osła z 2,5% albuminą surowicy bydlęcej i 0,5% Triton X-100 w soli fizjologicznej buforowanej Tris [pH 7,5]) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne 
	UWAGA: Muszle oczne są teraz gotowe do barwienia pierwszorzędowymi przeciwciałami mysiego anty-Tuj1 w celu wykrycia wiązek aksonów RGC i szczurzego anty-ICAM-2 w celu wykrycia naczyń krwionośnych.
	<ol>
		<li>Inkubować muszle oczne przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami, mysim anty-Tuj1 (1:200 w buforze blokującym) i szczurzym anty-ICAM-2 (1:500 w buforze blokującym), w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Myj muszle oczne 3-5 razy przez 1 godzinę za każdym razem buforowanym fosforanem roztworem soli fizjologicznej zawierającym 0,5% Triton X-100 (PBST) w celu zminimalizowania tła i usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał.</li>
		<li>Po umyciu inkubować muszle oczne przez noc z przeciwciałami drugorzędowymi, immunoglobuliną G przeciwko mysim osłom sprzężoną z barwnikiem Alexa Fluor 488 (zielona fluorescencja) i antyszczurzą IgG osła skoniugowaną z barwnikiem Alexa Fluor 594 (czerwona fluorescencja), wszystkie rozcieńczone w stosunku 1:1000 w buforze blokującym, w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Następnego dnia przemyj muszle oczne 3-5 razy przez 1 godzinę każdy PBST, aby zminimalizować tło i usunąć niezwiązane przeciwciało.</li>
		<li>Przenieść muszle oczne na szalkę Petriego PBS przed płaskim mocowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płaska siatkówka
	<ol>
		<li>Po procesie barwienia immunologicznego wyizoluj siatkówki z muszli ocznych pod mikroskopem.</li>
		<li>Pokrój siatkówki na cztery liście i zamontuj je płasko warstwą RGC skierowaną do góry. Pozostaw znak po stronie skroniowej przymocowany do siatkówki, aby wskazać orientację.</li>
		<li>Szkiełko nakrywkowe siatkówki z podłożem montażowym13,18. Uszczelnij slajdy lakierem do paznokci13,18,19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie konfokalne 
	UWAGA: Przetwarzanie obrazów konfokalnych przeprowadzono za pomocą oprogramowania ZEN Microscopy Software.
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop konfokalny i w trybie lokalizacji znajdź obszar zainteresowania za pomocą okularu mikroskopu.</li>
		<li>W trybie akwizycji skonfiguruj kafelki tak, aby pokrywały całą siatkówkę i wycinki stosu z, aby pokryć wszystkie warstwy informacji. Wyobraź sobie co najmniej 25 kafelków na całej siatkówce, aby pokryć całkowitą objętość 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) przy rozmiarze piksela 1,24 μm/piksel.</li>
		<li>Rzutuj warstwy stosu Z, aby utworzyć dwuwymiarowe obrazy mikroskopii konfokalnej en face (Rysunek 1C,D)11,13,19,20,21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wyrównanie obrazów in vivo i ex vivo
<ol>
	<li>Po przetworzeniu fibergramu utwórz złożony obraz, który zawiera cztery obrazy uzyskane z każdej myszy, wyrównując wszystkie naczynia krwionośne za pomocą wybranego edytora graficznego. 
	UWAGA: Średnio końcowy obraz kompozytowy ma wymiary około 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y), jak pokazano na rysunku Rysunek 1B.</li>
	<li>Użyj głowy nerwu wzrokowego (ONH) i wzoru naczyń krwionośnych jako punktów orientacyjnych, aby wyrównać kompozytowy fibergram. Wyrównanie in vivo i ex vivo należy uzyskać, nakładając na siebie wzór naczyń krwionośnych złożonych obrazów OCT z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki przebarwionej ICAM-2.</li>
</ol>

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

<ol><li>Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+retinal+ganglion+cell+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development of retinal ganglion cell structure and function.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).</li>
<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+types+of+retinal+ganglion+cells%3A+current+status+and+implications+for+neuronal+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li>
<li>Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture%2C+function%2C+and+assembly+of+the+mouse+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Architecture, function, and assembly of the mouse visual system.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).</li>
<li>Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+function%2C+organization%2C+and+development+of+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus.</a> Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).</li>
<li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+glaucomatous+optic+neuropathy%3A+the+synergy+between+clinical+observation+and+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).</li>
<li>Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glaucoma%3A+thinking+in+new+ways-a+role+for+autonomous+axonal+self-destruction+and+other+compartmentalised+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).</li>
<li>Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+injury+signaling+and+compartmentalized+injury+response+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769(2019).</li>
<li>Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-dependent+morphological+and+functional+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+mouse+models+of+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nature+and+Science%22%5BJournal%5D)">Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma.</a> Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).</li>
<li>Tatham, A. J., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+structural+progression+in+glaucoma+with+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography.</a> Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).</li>
<li>Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible-light+optical+coherence+tomography%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Visible-light optical coherence tomography: a review.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).</li>
<li>Miller, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy+for+quantitative+imaging+of+retinal+ganglion+cell+axon+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).</li>
<li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+inner+retinal+layer+structure+in+mice+after+eye-opening+using+visible-light+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography.</a> Experimental Eye Research. 211, 108756(2021).</li>
<li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+damages+in+retinal+ganglion+cell+axon+bundles+monitored+non-invasively+by+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).</li>
<li>Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+Injection+of+Ethanol+for+the+Euthanasia+of+Laboratory+Mice+%28Mus+musculus%29+and+Rats+%28Rattus+norvegicus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).</li>
<li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic%2C+Behavioral%2C+and+Histologic+Responses+to+Various+Euthanasia+Methods+in+C57BL%2F6NTac+Male+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+degeneration+of+retinal+and+superior+collicular+functions+in+mice+with+sustained+ocular+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).</li>
<li>Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+laser-induced+mouse+model+of+chronic+ocular+hypertension+to+characterize+visual+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+experimental+glaucoma+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).</li>
<li>Thomson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-1+knockout+mice+as+a+genetic+model+of+open-angle+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).</li>
<li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+ocular+hypertension+induces+dendritic+degeneration+of+mouse+retinal+ganglion+cells+that+depends+on+cell+type+and+location%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).</li>
<li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+analysis+of+retinal+ganglion+cell+damage+at+individual+axon+bundle+level+in+mice+using+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).</li>
</ol>

Chang, S., Brak; Xu, W., Brak; Wentylator, W., Brak; McDaniel, J.A., Brak; D.A. Millera, Żaden; M. Grannonico, Żaden; M. Liu, Żaden; X. Liu, Żaden; H.F. Zhang ma interesy finansowe w firmie Opticent Health, która nie wspierała tej pracy.

W tym protokole są dwa kroki, które wymagają uwagi. Po pierwsze, konieczne jest upewnienie się, że zwierzę jest w głębokim znieczuleniu i że jego oczy są w pełni rozszerzone przed obrazowaniem vis-OCT. Jeśli myszy nie są odpowiednio znieczulone, ich szybki oddech może prowadzić do niestabilnych ruchów obrazów en face , co może niekorzystnie wpłynąć na jakość fibergramu. Co więcej, niewystarczająca dylatacja może mieć również negatywny wpływ na jakość obrazu, ponieważ tęczówka może blokować światło, uniemożliwiaj...

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) odgrywają kluczową rolę w przetwarzaniu informacji wizualnych, odbierając sygnały synaptyczne przez swoje drzewa dendrytyczne w wewnętrznej warstwie splotowatej (IPL) i przekazując informacje za pośrednictwem swoich aksonów w warstwie włókien nerwowych siatkówki (RNFL) do mózgu1,2,3,4. W stanach chorobowych, takich jak jaskra, wczesne zwyrodnienie RGC może powodować subtelne zmiany w RNFL, warstwie komórek zwojowych (GCL), IPL i nerwie wzrokowym zarówno u pacjentów, jak i u modeli gryzoni5,6,7,8,9. Wczesne wykrycie tych zmian morfologicznych w RGC jest zatem niezbędne do szybkiej interwencji w celu zapobieżenia RGC i utracie wzroku.
Niedawno opracowaliśmy nową technologię obrazowania klinicznego zwaną optyczną koherentną tomografią światła widzialnego (vis-OCT), aby zaspokoić potrzebę monitorowania in vivo uszkodzeń RGC. Vis-OCT poprawił rozdzielczość osiową, osiągając 1,3 μm w siatkówce10, 11, pozwalając na wizualizację poszczególnych wiązek aksonów RGC w RNFL. Następnie utworzono fibergrafię vis-OCT (vis-OCTF) w celu śledzenia i ilościowego określania uszkodzeń RGC na poziomie pojedynczej wiązki aksonów u myszy11,12,13. Jednak obrazowanie konfokalne ex vivo tej samej siatkówki, co złoty standard, jest często konieczne do walidacji wyników in vivo. Dlatego badanie to pokaże, jak wyrównać obrazy in vivo uzyskane przez vis-OCTF z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy. Protokół ma na celu walidację wyników in vivo za pomocą obrazowania konfokalnego ex vivo i stworzenie podstaw do badania zmian molekularnych i komórkowych leżących u podstaw uszkodzeń RGC w stanach chorobowych.

<table><tbody><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halo 100</td><td>Opticent Health, Evanston, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss LSM800</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leki i przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu (PFA)</td><td>Santz Cruz Biotechnology, SC-281692</td><td></td><td>1-2 krople</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca albumina w proszku</td><td>Fisher Scientific, BP9706-100</td><td></td><td>1:10</td></tr><tr><td>Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 barwnik</td><td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202</td><td></td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Donkey anti rat Alexa Fluor 594 barwnik</td><td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209</td><td></td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Euthasol (mieszanina pentobarbitalu sodu (390 mg/ml) i fenytoiny sodowej (50 mg/ml))</td><td>Covetrus, NDC 11695-4860-1</td><td></td><td>15,6 mg/ml</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Covetrus, NADA043304</td><td></td><td>114 mg/kg</td></tr><tr><td>Mysi anty-Tuj1</td><td>Prezent od Anthony'ego J. Spano, University of Virginia</td><td></td><td>1:200</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>Millipore Sigma, S30-100 mL</td><td></td><td>1:100</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, 10x), pH 7,4 (Zawiera 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4 i 20 mM KH2PO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Kat # J62036. K3</td><td></td><td>1:10</td></tr><tr><td>Szczur anty-ICAM-2</td><td>BD Pharmingen, Cat#553325</td><td></td><td>1:500</td></tr><tr><td>Krople tropikamidu&nbsp;</td><td>Covetrus, NDC17478-102-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (klasa odczynnika)</td><td>VWR, CAS: 9002-93-1</td><td></td><td>1:20</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Vectashield</td><td>Vector Laboratories Inc. H2000-10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Covetrus, NDC59399-110-20</td><td></td><td>17 mg/kg</td></tr></tbody></table>

wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

W ostatnich latach obrazowanie siatkówki in vivo, które dostarcza nieinwazyjnych, w czasie rzeczywistym i podłużnych informacji o systemach i procesach biologicznych, jest coraz częściej stosowane do uzyskania obiektywnej oceny uszkodzeń neuronów w chorobach oczu. Obrazowanie konfokalne ex vivo tej samej siatkówki jest często konieczne w celu walidacji wyników in vivo, zwłaszcza w badaniach na zwierzętach. W tym badaniu zademonstrowaliśmy metodę wyrównywania konfokalnego obrazu siatkówki myszy ex vivo z jej obrazami in vivo. Nowa, gotowa do zastosowania klinicznego technologia obrazowania, zwana światłowodową optyczną tomografią koherentną w świetle widzialnym (vis-OCTF), została zastosowana do uzyskania obrazów in vivo siatkówki myszy. Następnie przeprowadziliśmy obrazowanie konfokalne tej samej siatkówki jako "złoty standard", aby zweryfikować obrazy in vivo vis-OCTF. Badanie to nie tylko umożliwia dalsze badania mechanizmów molekularnych i komórkowych, ale także stanowi podstawę do czułej i obiektywnej oceny uszkodzeń neuronów in vivo.

Złożony fibergram vis-OCT porównano z odpowiadającym mu obrazem konfokalnym siatkówki zamontowanej na płasko, poddanej immunostynowaniu Tuj-1 w celu uwidocznienia aksonów RGC (Rycyna 1D, górny panel). Pęczki aksonów obrazowane za pomocą vis-OCTF można dopasować do pęczków aksonów znakowanych Tuj-1 na obrazie konfokalnym. Naczynia krwionośne zazwyczaj wykazują wyraźne struktury rozgałęzień w porównaniu z otaczającymi je pęczkami aksonów na obrazach fibergramu, co można dopasować do naczyń krw...

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Przedstawiamy protokół wyrównywania obrazów in vivo vis-OCTF z immunobarwionymi włóknami nerwowymi siatkówki ex vivo w celu walidacji naszej nowatorskiej technologii obrazowania. Vis-OCTF umożliwia wizualizację włókien nerwowych siatkówki in vivo, a proces ten potwierdza dokładność naszych ustaleń. Nasz protokół łączy obrazowanie in vivo i ex vivo, aby zapewnić wizualizację struktury siatkówki w czasie rzeczywistym i potwierdzone wyniki.Proces ten ma zastosowanie do większości modalnych chorób oczu, pod warunkiem, że przednia część oka pozwala na obrazowanie optyczne. Obejmuje to retinopatię cukrzycową i modele niedokrwienia siatkówki. Badania te stanowią podstawę do ustalenia obiektywnej oceny uszkodzeń neuronów u ludzi, co może znacznie poprawić diagnostykę i leczenie jaskry w przyszłości.Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy na uchwycie na zwierzę i zabezpieczenia jej dwoma paskami na rzepy. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie, aby aktywować laser. Wyreguluj uchwyt zwierzęcia, aby wyśrodkować laser w oku myszy.Wizualizuj tylną część poprzez podgląd na twarzy, pole widzenia powierzchownego splotu naczyniowego, skan B i przekrój siatkówki w polu widzenia. Uzyskaj optyczną

alignment-visible-light-optical-coherence-tomography-fibergrams-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje technikę obrazowania in vivo do wykrywania i ilościowego określania stanu zapalnego oka w mysim modelu poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Technika ta, znana jako optyczna tomografia koherentna (OCT), generuje obrazy przekroju poprzecznego oka o wysokiej rozdzielczości w celu oceny postępu choroby.

Obrazowanie optycznej koherentnej tomografii do oceny zapalenia błony naczyniowej oka w modelu mysim

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy.  J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu...

Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający uzyskać trójwymiarową (3D) fluorescencję (3D) i obraz siatkówki OCT o dużym polu widzenia (FOV) za pomocą nowatorskiej platformy multimodalnej do obrazowania. Przedstawimy konfigurację systemu, metodę wyrównania i protokoły operacyjne. Przeprowadzone zostaną badania obrazowe in vivo, a ich wyniki zostaną przedstawione.

Multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO) i optycznej koherentnej tomografii (OCT)

Przedstawiono szczegółowy protokół oceny odczytów strukturalnych i wizualnych u gryzoni za pomocą optycznej koherentnej tomografii i odpowiedzi optokinetycznej. Wyniki dostarczają cennych informacji dla badań okulistycznych i neurologicznych.

Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Poznaj metodę wyrównania obrazów vis-OCTF in vivo z obrazami konfokalnymi siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia walidację morfologii pęczków aksonów komórek zwojowych siatkówki w czasie rzeczywistym.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów