Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy
June 30th, 2023
Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.
Przedstawiamy protokół wyrównywania obrazów in vivo vis-OCTF z immunobarwionymi włóknami nerwowymi siatkówki ex vivo w celu walidacji naszej nowatorskiej technologii obrazowania. Vis-OCTF umożliwia wizualizację włókien nerwowych siatkówki in vivo, a proces ten potwierdza dokładność naszych ustaleń. Nasz protokół łączy obrazowanie in vivo i ex vivo, aby zapewnić wizualizację struktury siatkówki w czasie rzeczywistym i potwierdzone wyniki.
Proces ten ma zastosowanie do większości modalnych chorób oczu, pod warunkiem, że przednia część oka pozwala na obrazowanie optyczne. Obejmuje to retinopatię cukrzycową i modele niedokrwienia siatkówki. Badania te stanowią podstawę do ustalenia obiektywnej oceny uszkodzeń neuronów u ludzi, co może znacznie poprawić diagnostykę i leczenie jaskry w przyszłości.
Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy na uchwycie na zwierzę i zabezpieczenia jej dwoma paskami na rzepy. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie, aby aktywować laser. Wyreguluj uchwyt zwierzęcia, aby wyśrodkować laser w oku myszy.
Wizualizuj tylną część poprzez podgląd na twarzy, pole widzenia powierzchownego splotu naczyniowego, skan B i przekrój siatkówki w polu widzenia. Uzyskaj optyczną koherentną tomografię światła widzialnego lub objętość vis-OCT po dokonaniu drobnych korekt ostrości optycznej. Ustaw głowę nerwu wzrokowego w każdym z czterech rogów pola widzenia, aby pokryć różne obszary siatkówki.
Użyj metody progowej opartej na intensywności, aby wykryć powierzchnię siatkówki i wygenerować gramy włókien vis-OCT z objętości. Przytnij warstwę włókien nerwowych siatkówki lub RNFL, wybierając głębokość pierwszych 16 mikrometrów. Następnie oblicz projekcję średniej intensywności wzdłuż kierunku osiowego, aby wygenerować obraz grama włókna składający się z wiązek aksonów komórek zwojowych siatkówki i otaczających naczyń krwionośnych.
Wyrównaj naczynia krwionośne za pomocą edytora graficznego, aby zmontować cztery obrazy w procesie obróbki końcowej. Kompozytowy gram włókien vis-OCT porównuje się z odpowiadającym mu obrazem konfokalnym płaskiej siatkówki wybarwionej immunologicznie TUJ1 dla aksonów RGC. Naczynia krwionośne wykazują wyraźne struktury rozgałęzione, które można dopasować do naczyń krwionośnych oznaczonych ICAM II na obrazie konfokalnym.
Porównanie mikroskopii konfokalnej ex vivo i mikroskopii konfokalnej in vivo vis-OCT wykazało identyczne sieci pęczków aksonów RGC i otaczające je naczynia krwionośne siatkówki. Zanużuj oczy myszy poddanej eutanazji, zaznaczając stronę skroniową w celach orientacyjnych. Wyjmij przednią komorę, następnie wyjmij soczewkę i ciało szkliste, a następnie umieść muszle oczne w paraldehydzie na 30 minut.
Myć muszle oczne PBS przez 30 minut, trzykrotnie wymieniając roztwór. Następnie myć 0,5%Triton X-100 przez 30 minut. Inkubować muszle oczne w buforze blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.
Po barwieniu immunologicznym należy odizolować siatkówki od muszli ocznych za pomocą mikroskopu. Podziel siatkówki na cztery liście i zamontuj je płasko z warstwą komórek zwojowych siatkówki skierowaną do góry. Upewnij się, że znak po stronie skroniowej pozostaje przymocowany w celu orientacji.
Przykryj siatkówki medium montażowym, umieść szkiełka nakrywkowe i uszczelnij szkiełka za pomocą lakieru do paznokci. Włącz mikroskop konfokalny i w trybie lokalizacji znajdź obszar zainteresowania za pomocą okularu. Przełącz się w tryb akwizycji i skonfiguruj kafelki pokrywające całą siatkówkę wraz z plasterkami stosu Z dla wszystkich warstw informacji.
Wyobraź sobie co najmniej 25 kafelków na całej siatkówce, aby uzyskać całkowitą objętość. Wyświetlaj warstwy stosu Z, aby wygenerować dwuwymiarowe obrazy mikroskopii konfokalnej na twarzy. Kompozyt vis-OCT gram włókien porównuje się z odpowiadającym mu obrazem konfokalnym płaskiej siatkówki wybarwionej immunologicznie TUJ1 dla aksonów RGC.
Naczynia krwionośne wykazują wyraźne struktury rozgałęzione, które można dopasować do naczyń krwionośnych oznaczonych ICAM II na obrazie konfokalnym. Porównanie mikroskopii konfokalnej ex vivo i mikroskopii konfokalnej in vivo vis-OCT wykazało identyczne sieci pęczków aksonów RGC i otaczające je naczynia krwionośne siatkówki. Zacznij od utworzenia obrazu kompozytowego przy użyciu czterech obrazów uzyskanych z każdej myszy.
Użyj edytora graficznego, aby wyrównać wszystkie naczynia krwionośne. Wykorzystaj wzory nerwu wzrokowego, głowy i naczyń krwionośnych jako punkty orientacyjne do wyrównania grama włókna kompozytowego. Nakładaj na siebie złożone obrazy OCT i obrazy konfokalne tej samej siatkówki barwionej ICAM II, aby uzyskać wyrównanie in vivo i ex vivo.
Kompozytowy gram włókien vis-OCT porównuje się z odpowiadającym mu obrazem konfokalnym płaskiej siatkówki wybarwionej immunologicznie TUJ1 dla aksonów RGC. Naczynia krwionośne wykazują wyraźne struktury rozgałęzione, które można dopasować do naczyń krwionośnych oznaczonych ICAM II na obrazie konfokalnym. Porównanie mikroskopii konfokalnej ex vivo i mikroskopii konfokalnej in vivo vis-OCT wykazało identyczne sieci pęczków aksonów RGC i otaczające je naczynia krwionośne siatkówki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje sposób dopasowania obrazów fibografii optycznej koherencji światła widocznego in vivo (vis-OCTF) z obrazami konfokalnymi ex vivo siatkówek mysich. Ma na celu zweryfikowanie morfologii pęczków aksonów komórek zwojowych siatkówki obserwowanych na obrazach in vivo, stosując kombinację technik obrazowania optycznego stosowanych w różnych chorobach oczu.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Obrazowanie optyczne
- Badania nad siatkówką
Tło
- Techniki obrazowania in vivo są niezbędne do oceny struktury siatkówki w czasie rzeczywistym.
- To badanie wykorzystuje vis-OCTF i mikroskopię konfokalną do walidacji anatomicznej.
- Metodologia pozwala na ocenę włókien nerwowych siatkówki i ich zmian morfologicznych.
- Ważne dla zrozumienia chorób takich jak retinopatia cukrzycowa i jaskra.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnej metody dopasowania między technikami obrazowania in vivo i ex vivo.
- Potwierdzenie anatomicznej dokładności pęczków aksonów komórek zwojowych siatkówki in vivo.
- Zapewnienie kompleksowej wizualizacji struktur siatkówki, która pomaga w ocenie chorób.
Zastosowane metody
- Wykorzystuje techniki optycznej koherencji światła widocznego (vis-OCT) i obrazowania konfokalnego.
- Wykorzystuje model myszy do oceny struktur włókien nerwowych siatkówki, koncentrując się na warstwie komórek zwojowych siatkówki.
- Protokół obejmuje znieczulenie myszy, ich pozycjonowanie i aktywację urządzeń do obrazowania.
- Kroki obejmują przycinanie i dopasowanie obrazów za pomocą charakterystycznych obiektów takich jak naczynia krwionośne i główka nerwu wzrokowego.
- Konfokalne immunobarwienie jest używane do wizualizacji aksonów RGC w celu porównania z fibogramem vis-OCT.
Główne wyniki
- Protokół z powodzeniem potwierdza morfologię pęczków aksonów RGC zidentyfikowanych na obrazach vis-OCT.
- Obrazowanie konfokalne i vis-OCT ujawnia identyczne sieci naczyń krwionośnych i aksonów siatkówki.
- To dopasowanie zwiększa niezawodność obrazowania in vivo do oceny patologii siatkówki.
Wnioski
- Badanie pokazuje solidną metodę korelacji obrazowania siatkówki in vivo i ex vivo.
- Zwiększa potencjał zastosowania tej techniki do rozumienia i diagnozowania chorób siatkówki.
- Stawia podstawy pod lepszą diagnozę i leczenie jaskry na podstawie obiektywnej oceny.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable alignment of in vivo vis-OCTF and ex vivo confocal retinal images enables objective, quantitative validation of neural damage in preclinical eye disease models. This capability strengthens predictive confidence in non-invasive imaging biomarkers and supports translational continuity from animal studies to human disease evaluation. The approach is directly relevant for de-risking early discovery and advancing portfolio decisions in ophthalmic R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous validation of in vivo imaging biomarkers against gold-standard ex vivo confocal data.
- Supports mechanistic de-risking by confirming neural structure integrity in disease models.
- Facilitates objective assessment of retinal ganglion cell axon damage for target validation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible imaging outputs for quantitative comparison across experimental conditions.
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening in retinal disease models.
- Enables high-content, scalable imaging workflows for robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vivo imaging readouts with ex vivo molecular markers for translational biomarker development.
- Ensures continuity of neural damage assessment from preclinical models to potential clinical endpoints.
- Supports risk-adjusted advancement of ophthalmic candidates based on objective neural integrity metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This alignment protocol bridges early discovery imaging with preclinical validation, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification in ophthalmic research.
- Discovery Biology: Confirms biological relevance of in vivo imaging findings through direct comparison with immunostained ex vivo tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Provides high-resolution, statistically comparable measurements of retinal nerve fiber integrity.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and continuity between animal models and human disease studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging-validation workflow for diverse retinal disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural damage assessment.
- Operational Value: Standardizes imaging validation, improving reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in ophthalmic portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in both in vivo optical imaging and ex vivo confocal microscopy.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and image analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and alignment procedures.
- Must be adapted for specific retinal disease models and animal strains as needed.
- Alignment precision and image quality are critical for robust validation and downstream analysis.
