Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji
2 czerwca 2023
Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.
Nasze laboratorium bada zmiany w mitochondriach i metabolizmie energetycznym oraz ich wpływ na zdrowe i patologiczne procesy, takie jak aktywacja immunologiczna, rak lub zaburzenia metaboliczne. Naszym celem jest pomoc w opracowaniu nowych metod leczenia szerokiej gamy zaburzeń poprzez zapewnienie lepszego zrozumienia funkcji mitochondriów i metabolizmu energetycznego. Narzędzia takie jak proteomika oparta na spektrometrii mas, metabolomika i genetyczne badania przesiewowe CRISPR-Cas9 stają się coraz bardziej popularne do identyfikacji mechanizmów molekularnych zarówno w funkcji mitochondriów, jak i metabolizmie energetycznym w określonych typach komórek i środowiskach.
W przeciwieństwie do innych metod, nasz protokół wykorzystuje dwa etapy oczyszczania, wirowanie różnicowe i wychwytywanie immunologiczne w celu izolacji mitochondriów. Ma to kilka zalet, takich jak lepsze usuwanie zanieczyszczeń, a także jest potężnym narzędziem do identyfikacji nowych białek mitochondrialnych. Nasz protokół zapewnia wgląd w skład, a tym samym funkcję mitochondriów w różnych typach komórek i środowiskach.
Może to pomóc nam lepiej zrozumieć normalne procesy, takie jak aktywacja immunologiczna, ale także procesy patologiczne, takie jak rak. Skupimy się na makrofagach mitochondrialnych. Przetestujemy, jak zmienia się skład mitochondriów podczas odpowiedzi immunologicznej, aby lepiej zrozumieć ich funkcję.
Nasze odkrycia mogą doprowadzić do opracowania leków o działaniu przeciwzapalnym.
Przegląd
Niniejsze opracowanie przedstawia dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, mający na celu pogłębienie wiedzy na temat funkcji mitochondrialnych oraz metabolizmu energetycznego w różnych kontekstach biologicznych, w tym podczas aktywacji immunologicznej i w nowotworach. Kompatybilność tej metody z komórkami pierwotnymi oraz tkankami umożliwia jej szersze zastosowanie w odkrywaniu i ilościowym określaniu białek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Funkcja mitochondriów
- Metabolizm energetyczny
- Procesy patologiczne, takie jak nowotwory i aktywacja immunologiczna
Wprowadzenie
- Badanie wpływu zmian mitochondrialnych na zdrowie i choroby
- Doskonalenie strategii terapeutycznych poprzez lepsze zrozumienie mechanizmów molekularnych
- Wykorzystanie spektrometrii mas i innych narzędzi do analiz proteomicznych
Zastosowane metody
- Dwuetapowy protokół oczyszczania z wykorzystaniem wirowania różnicowego i wychwytu immunologicznego
- Pierwotne komórki i tkanki do izolacji mitochondriów
- Technologie proteomiki i metabolomiki
Główne wyniki
- Usprawnione oczyszczanie mitochondriów prowadzące do lepszej identyfikacji białek mitochondrialnych
- Wgląd w skład mitochondriów wpływający na odpowiedzi immunologiczne
- Potencjalne implikacje dla celowanego opracowywania leków, takich jak terapie przeciwzapalne
Wnioski
- Badanie ustanawia nowy protokół analizy mitochondriów bez manipulacji genetycznych
- Wyniki mają istotne znaczenie dla zrozumienia i leczenia różnych schorzeń związanych z dysfunkcją mitochondriów
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokowierną izolacja mitochondriów jest kluczowa dla dokładnego wykrywania i kwantyfikacji białek w systemach istotnych dla przebiegu chorób. Ten dwuetapowy protokół bez użycia znaczników umożliwia solidną charakterystykę proteomów mitochondrialnych z komórek pierwotnych i tkanek, co zwiększa pewność predykcyjną w badaniach wczesnego etapu odkryć oraz w badaniach translacyjnych. Zwiększona czystość i ilościowe wyniki spektrometrii mas bezpośrednio wspomagają walidację celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego w różnych obszarach terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie składu białek mitochondrialnych w stanach chorobowych i fizjologicznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez izolację organelli z minimalną ilością zanieczyszczeń.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki proteomice subtraktywnej i analizie ilościowej.
- Zwiększa pewność prognostyczną dla celów mitochondrialnych podczas selekcji projektów w portfolio.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia wysokiej jakości preparaty mitochondrialne do dalszych analiz proteomicznych.
- Standaryzuje ilość materiału wejściowego w celu uzyskania powtarzalnych ilościowych analiz spektrometrii mas.
- Umożliwia niezawodną detekcję nowych białek mitochondrialnych w kampaniach screeningowych.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w różnych liniach komórkowych, komórkach pierwotnych oraz tkankach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie profili białek mitochondrialnych do modeli związanych z chorobami oraz odkrywanie biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez umożliwienie porównań między różnymi systemami.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne w badaniach translacyjnych dzięki zapewnieniu kompleksowej charakterystyki organelli.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu, skorygowane o ryzyko, w oparciu o ilościowe dane proteomiczne.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w ciąg procesu odkrywania – od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po badania przedkliniczne – umożliwiając rzetelną analizę mitochondriów na każdym z tych etapów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie precyzyjnego profilowania białek mitochondrialnych.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary oparte na spektrometrii mas oraz obliczenia wzbogaceń do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i walidację modeli chorób dzięki proteomice specyficznej dla organelli.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje zestandaryzowany, beztagowy przepływ pracy, który można dostosować do wielu systemów biologicznych i programów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad mitochondriami.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność izolacji oraz analizy mitochondriów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie wysokiej jakości danych do walidacji celów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację i rozwój celów oraz szlaków mitochondrialnych w oparciu o dostosowane do ryzyka kryteria.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w izolacji organelli oraz ilościowej spektrometrii mas.
- Konieczny jest dostęp do wirówek oraz infrastruktury proteomicznej.
- Zaleca się standaryzację przygotowania próbek i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych typów komórek i tkanek bez konieczności modyfikacji genetycznej.
- Wynik zależy od dokładnej optymalizacji w celu zminimalizowania zanieczyszczeń i maksymalizacji wydajności.
