Name: Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj półautomatyczną izolację frakcji naczyniowej zrębu z mysiej tkanki tłuszczowej przy użyciu dysocjatora tkankowego. Ta metoda zwiększa powtarzalność i redukuje zmienność eksperymentalną w badaniach nad adipogenezą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Takahito Wada i Saiko Yoshida (Uniwersytet Tokijski, Tokio, Japonia) za ich eksperymentalną pomoc. Praca ta została sfinansowana z następujących grantów dla Y.H.: grant badawczy z University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, numer grantu 19K17976; grant dla Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) od Japońskiej Fundacji Enzymologii Stosowanej, numer grantu 17F005; grant Fundacji Badań Farakologicznych; grant Fundacji Pamięci Mochidy na badania medyczne i farmaceutyczne; grant Fundacji MSD Life Science; stypendium Fundacji Zdrowia Daiwa Securities; grant Tokijskiej Fundacji Badań Biochemicznych; Grant na badania w dziedzinie nauk przyrodniczych przyznany przez Fundację Naukową Takeda; oraz grant Fundacji Badań Medycznych SENSHIN.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Tokijskiego i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Tokijskiego.
1. Przygotowanie roztworu enzymu i pożywki
<ol>
	<li>Umieścić obie strony pachwinowej białej tkanki tłuszczowej (prawa i lewa strona, około 150 mg) od 7-8-tygodniowej myszy i 2,5 ml roztworu enzymu do probówki C dysocjatora.</li>
	<li>Enzym D należy rozpuścić w 3 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle Substrate (DMEM)/F12 bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS) lub antybiotyków, enzym R w 2,7 ml DMEM/F12 bez FBS lub antybiotyków, a enzym A w 1 ml buforu A.</li>
	<li>Przygotować 2,5 ml roztworu enzymu, dodając 100 μl enzymu D, 50 μl enzymu R, 12,5 μl enzymu A i 2,35 ml DMEM/F12 bez FBS lub antybiotyków do probówki C. Ustawić probówkę C z roztworem enzymu na lodzie.</li>
</ol>
2. Izolacja tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Eutanazja 7-8-tygodniowego samca myszy C57BL/6J (około 20 g) przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Na czystej ławce, aby wyizolować pachwinową białą tkankę tłuszczową, przetnij skórę/ostrymi nożyczkami na brzuchu i w kierunku kończyn dolnych. Odizoluj tkankę tłuszczową od wewnętrznej strony ud za pomocą ostrych/ostrych nożyczek. Jedna strona pachwinowej tkanki tłuszczowej waży ~75 mg.</li>
	<li>Umieść izolowaną tkankę tłuszczową w probówce C z roztworem enzymu na lodzie i trzymaj rurkę w czystej ławce, aby zachować sterylność.</li>
</ol>
3. Rozdrabnianie i trawienie tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Na czystej ławie dodaj 2,5 ml roztworu enzymu do probówki C.</li>
	<li>Tkankę tłuszczową zmielić na małe kawałki, tnąc ostrymi/ostrymi nożyczkami 50 razy. Pokrój tkankę tłuszczową na ~2 mm2 kawałki.</li>
	<li>Szczelnie zamknij nakrętkę rurki C, odwróć rurkę do góry nogami i przymocuj ją do tulei dysocjatora tkanek z założoną nasadką. Następnie trawić próbkę przez ~40 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: W tym badaniu użyto dysocjatora gentleMACS Octo z grzejnikami (Miltenyi Biotec 130-096-427) i zastosowano preinstalowany program "37C_mr_ATDK_1".</li>
</ol>
4. Filtracja zawiesiny komórkowej
<ol>
	<li>Wstępnie podgrzany DMEM/F12 zawierający 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny do 37 °C.</li>
	<li>Odłączyć probówkę C od dysocjatora tkanek i zatrzymać trawienie, dodając 5 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i delikatnie pipetując cztery razy.</li>
	<li>Wirować przy 700 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić osad, dodając 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i delikatnie pipetując pięć razy.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm umieszczone na nowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wirować przy 250 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
</ol>
5. Poszycie komórek
<ol>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad, dodając 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i pipetując dziesięć razy.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową umieścić na 10 cm naczyniu pokrytym kolagenem i umieścić szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) na 1-2 godziny < />
	UWAGA: Naczynia pokryte kolagenem nie są absolutnie wymagane. Jednak z doświadczenia wynika, że naczynia pokryte kolagenem pomagają w przyleganiu preadipocytów, a tym samym zwiększają przeżywalność komórek.</li>
	<li>Odessać pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie 3 ml PBS na pranie.</li>
	<li>Dodać 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i umieścić szalki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ).</li>
</ol>
6. Pasażowanie preadipocytów
<ol>
	<li>Następnego dnia odessać pożywkę (komórki będą przylegać, a zatem pożywkę można odessać), przemyć komórki dwukrotnie 3 ml PBS na przemycie i dodać 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80% zbieżności (zwykle 4 dni po izolacji SVF), podziel komórki na cztery 10-centymetrowe naczynia pokryte kolagenem.
	<ol>
		<li>W szczególności odessać pożywkę, umyć komórki PBS (temperatura pokojowa [RT]), dodać 1 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny i inkubować przez 5 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Dodać 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny, aby stłumić aktywność trypsyny. Po pipetowaniu odwirować przy 440 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki, dodając 40 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny, a następnie umieścić komórki w czterech 10-centymetrowych naczyniach pokrytych kolagenem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie przejdź przez komórki, gdy osiągną 80% konfluencji.</li>
</ol>
7. Przygotowanie antygenu T dużego antygenu T SV40 do retrowirusa do unieśmiertelnienia preadipocytów (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Co najmniej 3 dni przed uwiecznieniem, płytka Platinum-E (Plat-E) packaging cells29 o gęstości 3,0 x 105 komórek/ml w 2 ml DMEM z 10% FBS bez antybiotyków. Użyj hemekytometru, aby policzyć komórki.</li>
	<li>Następnego dnia przetransfekuj 4 μg pBABE-neo largeTcDNA (dodaj plazmid genu #1780) za pomocą Lipofectamine 2000, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Po 24 godzinach odessać pożywkę i dodać 2 ml DMEM z 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną.</li>
	<li>Następnego dnia zbierz retrowirusowy supernatant. Retrowirus może być natychmiast użyty do unieśmiertelnienia lub przechowywany w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
8. Unieśmiertelnienie preadipocytów za pomocą dużego antygenu T SV40 (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Przejście i ekspansja preadipocytów dwukrotnie po izolacji SVF.</li>
	<li>Umieść komórki na płytkach 6-dołkowych o gęstości 0,5-1,0 x 10,4 komórki/ml w 2 ml DMEM/F12 z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Użyj hemekytometru, aby policzyć komórki.</li>
	<li>Następnego dnia przygotować 250 μl świeżego lub rozmrożonego retrowirusa wykazującego ekspresję dużego antygenu T SV40 na zagłębienie z płytek 6-dołkowych. Wirować przy 440 x g przez 5 minut i umieścić supernatant w nowej probówce.</li>
	<li>Dodać 750 μl DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny oraz 1 μl polibrenu na 250 μl retrowirusowego supernatantu, aby otrzymać działającego wirusa.</li>
	<li>Odessać pożywkę i dodać 1,000 μl działającego retrowirusa do każdej studzienki zawierającej preadipocyty.</li>
	<li>Dodaj 1 ml DMEM/F12 z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny 4 godziny później.</li>
	<li>Następnego dnia oddziel zakażone preadipocyty do 10-centymetrowego naczynia i wybierz zakażone komórki za pomocą DMEM/F12 zawierającego 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny i 500 μg/ml neomycyny. Aby monitorować dobór antybiotyków, przygotuj naczynie z niezakażonych komórek z neomycyną.</li>
	<li>Kontynuuj przechodzenie zainfekowanych komórek za pomocą neomycyny, aż wszystkie niezainfekowane komórki w naczyniu monitora umrą.</li>
</ol>
9. Różnicowanie adipocytów
<ol>
	<li>Ułóż komórki na płytce. W przypadku płytek 12-dołkowych należy poszczepić komórki o gęstości 4,0 x 104 komórek/ml w 1 ml DMEM/F12 zawierającym 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Gdy preadipocyty ulegną zlewaniu (48-72 godziny po posiewie, należy odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką różnicującą (patrz tabela 1 dla składu).</li>
	<li>W 2. dniu różnicowania (tj. 48 godzin po wywołaniu różnicowania) należy zastąpić pożywkę pożywką podtrzymującą (patrz Tabela 1 dla składu). Następnie zmieniaj podłoże konserwacyjne co 2 dni. Różnicowanie końcowe osiąga się w 7 dniu różnicowania.</li>
	<li>Czerwony olej o barwienie
	<ol>
		<li>W przypadku barwienia na czerwono olejem, odessać pożywkę i przepłukać komórki 1 ml PBS na studzienkę. Utrwal komórki, dodając 1 ml 4% formaldehydu na studzienkę i inkubuj komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Podczas inkubacji rozcieńczyć 0,5% roztwór podstawowy czerwieni olejowej (w alkoholu izopropylowym) do 0,3% przy użyciu ddH2O i przefiltrować roztwór roboczy za pomocą bibuły filtracyjnej.</li>
		<li>Po 15 minutach inkubacji usunąć formaldehyd, przepłukać komórki 60% alkoholem izopropylowym, dodać 1 ml przefiltrowanego oleju czerwonego o roztworu roboczego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po inkubacji umyj komórki bieżącą wodą. Następnie obserwuj adipocyty obciążone lipidami pod odwróconym mikroskopem (powiększenie: obiektyw 20x i okular 10x).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza ekspresji mRNA 
	UWAGA: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z listą starterów użytych w tym badaniu.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę i dodać 1 ml / studzienkę trizolu do studzienki.</li>
		<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, odłączyć komórki przez pipetowanie i zebrać próbki do probówek o pojemności 1,5 ml. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.</li>
		<li>Rozmrozić zamrożoną próbkę do temperatury regulowanej, dodać do niej 200 μl chloroformu i energicznie wstrząsać przez 15 s.</li>
		<li>Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie wirować w temperaturze 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usuń fazę wodną (górną, bezbarwną) i przenieś do nowych probówek. Nigdy nie przenoś fazy białkowej (środkowej, białej) lub fazy fenolowo-chloroformowej (dolnej, różowej).</li>
		<li>Powoli dodawaj równą objętość 70% EtOH i delikatnie wymieszaj. Nie wirować.</li>
		<li>Załadować próbkę (do 700 μl) do kolumny wirowej RNA umieszczonej w probówce zbiorczej. Pamiętaj, aby uwzględnić wszelkie osady, które mogły się uformować.</li>
		<li>Wirować z prędkością 9 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać 700 μl buforu RW1, wirować z prędkością 9 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić przepływ.</li>
		<li>Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i dodać 500 μl buforu RPE.</li>
		<li>Wirować z prędkością 9 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu RPE, wirować w temperaturze 9 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić przepływ.</li>
		<li>Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i wirować (kolumny bez buforu) w temperaturze 9 000 x g przez 1-2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodaj 30 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę kolumny.</li>
		<li>Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty. Następnie wirować w temperaturze 9 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, aby wymyć RNA.</li>
		<li>Sprawdź stężenie RNA za pomocą fluorospektrometru. 
		UWAGA: Zaleca się wyrównanie stężenia w tym miejscu.</li>
		<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję przy użyciu ~200 ng matrycy RNA. Użyj komercyjnego ilościowego zestawu do reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR-RT) i postępuj zgodnie z protokołem producenta. Po reakcji rozcieńczyć cDNA 20 razy do 200 μl.</li>
		<li>Dodaj 2,0 μl cDNA, 3,0 μl Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μl 100 μM startera do przodu qPCR, 0,018 μl 100 μM startera odwrotnego qPCR i 0,96 μl ddH2O do każdego dołka na płytce 384-dołkowej.</li>
		<li>Przeprowadzić qPCR (etap wstrzymania: 50°C przez 2 minuty i 95°C przez 2 minuty; Etap PCR: 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 min; etap krzywej topnienia: 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min i 95 °C przez 15 s). Do oceny ilościowej należy użyć metody krzywej standardowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

<ol><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+expression+of+tumor+necrosis+factor-alpha%3A+direct+role+in+obesity-linked+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance.</a> Science. 259 (5091), 87-91 (1993).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li>
<li>Kajimura, S., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+in+brown+adipose+tissue+biology%3A+Molecular+control+of+brown+fat+development+and+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis.</a> Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+obesity%3A+from+discovery+to+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of obesity: from discovery to biology.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).</li>
<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bigger+picture+of+FTO-the+first+GWAS-identified+obesity+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene.</a> Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).</li>
<li>Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+obesity+variant-exercise+interaction+on+changes+in+body+weight+and+BMI%3A+The+Taiwan+biobank+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+activity+attenuates+the+genetic+predisposition+to+obesity+in+20%2C000+men+and+women+from+EPIC-Norfolk+prospective+population+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study.</a> PLoS Medicine. 7 (8), e1000332(2010).</li>
<li>Claussnitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+obesity+variant+circuitry+and+adipocyte+browning+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).</li>
<li>Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+adipogenesis+in+fibroblasts+by+PPAR+gamma+2%2C+a+lipid-activated+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor.</a> Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+controls+a+brown+fat%2Fskeletal+muscle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).</li>
<li>Rajakumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+determines+and+maintains+brown+adipocyte+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity.</a> Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).</li>
<li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+co-localizes+with+PPAR%CE%B3+and+transcriptionally+controls+the+brown+fat+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program.</a> Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+differentially+controls+adipogenic+and+myogenic+gene+program+through+distinct+pathways+to+ensure+brown+and+beige+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation.</a> PLoS Genetics. 16 (9), e1009044(2020).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+determines+the+cis-effect+of+genetic+variation+on+Ucp1+expression+in+murine+thermogenic+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes.</a> iScience. 25 (8), 104729(2022).</li>
<li>Villanueva, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+subtype-selective+recruitment+of+TLE3+or+Prdm16+by+PPAR%CE%B3+specifies+lipid+storage+versus+thermogenic+gene+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).</li>
<li>Pearson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TLE3+promotes+the+mitochondrial+program+in+beige+adipocytes+and+improves+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+maintains+white+adipocyte+identity+through+suppression+of+the+beige+cell+thermogenic+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublines+of+mouse+3T3+cells+that+accumulate+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid.</a> Cell. 1 (3), 113-116 (1974).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+established+preadipose+cell+line+and+its+differentiation+in+culture+II.+Factors+affecting+the+adipose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion.</a> Cell. 5 (1), 19-27 (1975).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+heritable+changes+leading+to+increased+adipose+conversion+in+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells.</a> Cell. 7 (1), 105-113 (1976).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).</li>
<li>Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture%3A+a+simple%2C+reproducible%2C+efficient+and+economic+technique+for+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+adipose+tissue+and+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).</li>
<li>Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+freshly+isolated+human+adipose+stromal+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Surgery+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications.</a> Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).</li>
<li>Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+respirometric+measurements+of+UCP1-mediated+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 56-61 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+mouse+adipocytes+using+hypotonic+buffer+to+enrich+nuclear+fraction+before+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation.</a> STAR Protocols. 4 (1), 102093(2023).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma konkurencyjnego interesu finansowego związanego z tą pracą.

W tym miejscu opisaliśmy protokół izolacji SVF z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i przeprowadzenia różnicowania adipocytów in vitro. Zastosowanie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejszyło zmienność eksperymentalną, zmniejszyło ryzyko zanieczyszczenia i zwiększyło odtwarzalność. Chociaż procedura ta jest krytycznym krokiem w ramach przedstawionego protokołu, proces jest wysoce zautomatyzowany i nie jest potrzebna optymalizacja. Jednak w zależności od wieku myszy i składu ...

Biologia tkanki tłuszczowej przyciąga coraz większą uwagę ze względu na rosnące rozpowszechnienie otyłości i cukrzycy typu 2 na całym świecie1. Adipocyty magazynują nadmiar energii w postaci kropelek lipidów, które są uwalniane po wygłodzeniu. Co więcej, tkanka tłuszczowa utrzymuje homeostazę energetyczną układu, służąc jako narząd endokrynny i komunikując się z innymi tkankami2,3. Co ciekawe, zarówno nadmiar tkanki tłuszczowej (otyłość), jak i utrata tkanki tłuszczowej (lipodystrofia) są związane z insulinoopornością i cukrzycą1. Adipocyty dzielą się na trzy typy: białe, brązowe i beżowe1. Białe adipocyty magazynują głównie nadmiar energii w postaci lipidów, podczas gdy brązowe i beżowe adipocyty rozpraszają energię w postaci ciepła za pośrednictwem mitochondrialnego białka rozprzęgającego białko-1 (Ucp1)1,4. Warto zauważyć, że beżowe adipocyty (zwane również "indukowalnymi" brązowymi adipocytami) pojawiają się w białej tkance tłuszczowej w odpowiedzi na zimną lub współczulną stymulację i wykazują wzorce ekspresji genów, które pokrywają się, ale różnią się od tych z "klasycznych" brązowych adipocytów5. Ostatnio przewidywano, że brązowe i beżowe adipocyty będą potencjalnymi celami leczenia przeciw otyłości i cukrzycy, którego celem jest "zwiększenie rozpraszania energii", a nie "tłumienie poboru energii"4. Pomocniczo, allel ryzyka wariantu otyłości FTO rs1421085 u ludzi, który wykazuje najsilniejszy związek z wyższym wskaźnikiem masy ciała (BMI) wśród popularnych wariantów6,7 i wykazuje różne interakcje gen-środowisko8,9, ma negatywnie regulować różnicowanie i funkcję adipocytów beżowych10. Receptor aktywowany proliferatorem peroksysomów γ (PPARγ) jest znany jako główny regulator transkrypcji adipogenezy i jest niezbędny i wystarczający do różnicowania adipocytów11. Regulatory transkrypcji, takie jak domena homologiczna PRD1-BF1-RIZ1 zawierająca 16 (PRDM16), wczesny czynnik komórek B 2 (EBF2) i czynnik jądrowy I-A (NFIA), mają kluczowe znaczenie dla różnicowania i funkcji brązowo-beżowych adipocytów12,13,14,15,16,17,18. Z drugiej strony, programowanie genów białych adipocytów wymaga regulatorów transkrypcji, takich jak białko wzmacniające podobne do transducyny 3 (TLE3) i białko palca cynkowego 423 (ZFP423)19,20,21.
Systemy modelowe in vitro umożliwiają przeprowadzanie badań molekularnych, które mają na celu lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw funkcji i dysfunkcji adipocytów. Chociaż istnieją publicznie dostępne i unieśmiertelnione linie komórkowe preadipocytów, takie jak 3T3-L1 i 3T3-F442A22,23,24, hodowla pierwotnych preadipocytów i różnicowanie w adipocyty byłyby bardziej odpowiednim modelem do badania adipogenezy in vivo. Izolacja zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej jest dobrze znaną metodą otrzymywania pierwotnych preadipocytów25,26. Jednak trawienie kolagenazy tkanki tłuszczowej, które jest powszechnie wykonywane przy użyciu wytrząsarki bakteryjnej z rurką, może powodować zmienność eksperymentalną i jest podatne na zanieczyszczenie27,28. W tym miejscu opisujemy alternatywny protokół, który wykorzystuje delikatny dysocjator tkanek do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) do trawienia kolagenazy w celu łatwiejszej izolacji SVF.

<table><tbody><tr><td>Naczynie 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>płytka 12-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie 60 mm</td><td>IWAKI</td><td>3010-060</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji tkanki tłuszczowej, myszy i szczurów</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-808</td><td>zawartość: Enzym D, Enzym R, Enzym A i bufor A</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe 70 &mikro; m</td><td>BD falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia pokryte kolagenem, 100 mm</td><td>BD</td><td>#356450</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia pokryte kolagenem, 60 mm</td><td>BD</td><td>#354401</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I Płaszcz Microplate 6 dołków</td><td>IWAKI</td><td>4810-010</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Wako</td><td>041-18861</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>Nie</td><td>dotyczy</td><td>autoklawu przed użyciem</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne,/ostre</td><td>autoklaw N/A</td><td>N/A</td><td>przed użyciem</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne, ostre/ostre</td><td>autoklaw N/A</td><td>N/</td><td>A przed użyciem</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>N/A</td><td>N/</td>A <td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACSOcto Dysocjator z grzałkami</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R Injection U-100</td><td>Eli Lilly</td><td>872492</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Izobutylometyloksantyna (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>17018-1G</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Neomycyna Siarczan</td><td>Fujifilm</td><td>146-08871&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-neo largeTcDNA (SV40)</td><td>Dodaj gen#</td><td>1780</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki PBS</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E (Plat-E) Opakowanie retrowirusowe Komórka linii komórkowej</td><td>biolab</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12996-81</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>#FSQ-201</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Rozyglitazon</td><td>Wako</td><td>180-02653</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T2877-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Badanie in vitro różnicowania białych, brązowych i beżowych adipocytów umożliwia badanie autonomicznych funkcji adipocytów i ich mechanizmów. Unieśmiertelnione białe linie komórkowe preadipocytów są publicznie dostępne i szeroko stosowane. Jednak pojawienie się beżowych adipocytów w białej tkance tłuszczowej w odpowiedzi na sygnały zewnętrzne jest trudne do pełnego podsumowania przy użyciu publicznie dostępnych linii komórkowych białych adipocytów. Izolacja zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej jest powszechnie wykonywana w celu uzyskania pierwotnych preadipocytów i przeprowadzenia różnicowania adipocytów. Jednak ręczne mielenie i trawienie kolagenazy tkanki tłuszczowej może powodować zmienność eksperymentalną i jest podatne na zanieczyszczenie. W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowany półautomatyczny protokół, który wykorzystuje dysocjator tkankowy do trawienia kolagenazy w celu uzyskania łatwiejszej izolacji SVF, w celu zmniejszenia zmienności eksperymentalnej, zmniejszenia zanieczyszczenia i zwiększenia odtwarzalności. Uzyskane preadipocyty i adipocyty zróżnicowane mogą być wykorzystane do analiz funkcjonalnych i mechanistycznych.

Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie w pełni zróżnicowanych adipocytów z akumulacją lipidów 7 dni po indukcji różnicowania adipocytów. Stopień różnicowania adipocytów można ocenić za pomocą barwienia Oil Red O tryglicerydów i lipidów (Rysunek 1A) lub poprzez analizę ekspresji mRNA genów adipocytów za pomocą qPCR-RT, takich jak główny regulator adipogenezy Pparg oraz jego gen docelowy Fabp4 (Rysunek 1B). Aby zindukować różnicowanie adipocytów...

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Interesują nas brązowe i beżowe podtypy adipocytów o zróżnicowanej energii w postaci ciepła. Podczas gdy białe adipocyty na ogół magazynują energię w postaci powtórzeń, naszym celem jest opracowanie nowego leczenia otyłości i cukrzycy opartego na promowaniu wydatku energetycznego, a nie na tłumieniu spożycia energii. Zidentyfikowaliśmy czynnik transkrypcyjny w FY jako krytyczny regulator różnicowania adipocytów płucnych za pomocą otwartej analizy chromatycznej w całym kanonie.W FY i głównym transkrypcyjnym regulatorze adipogenezy przygotowują gamma, kolokalizują się jako wzmacniacze specyficzne dla brązowej tkanki tłuszczowej. W procesie izolacji zrębowych frakcji naczyniowych z masowej tkanki tłuszczowej, metoda mysia i trawienie kolagenazą tkanki tłuszczowej może prowadzić do zmienności eksperymentalnej i zanieczyszczenia. Nasza metoda wykorzystuje dysocjator tkankowy do trawienia kolagenazy, który ułatwia izolację XPF, zmniejsza zmienność eksperymentalną i zanieczyszczenie oraz poprawia odtwarzalność.Eksperymenty z wykorzystaniem indywidualnie zróżnicowanych adipocytów są niezbędne do prowadzenia badań w naszej dziedzinie. Nasz protokół zapewniłby łatwą i powtarzalną izolację SV

semi-automated-isolation-stromal-vascular-fraction-from-murine-white

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC) z mysiej tkanki tłuszczowej łuku okołoaortalnego. Po wyizolowaniu NCADSC są wykrywane, sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, a następnie hodowane na płytce, co sprzyja proliferacji komórek.

Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

Pierwotne białe preadipocyty wyizolowane z białych tkanek tłuszczowych u myszy mogą być różnicowane na komórki beżowe/brite. Przedstawiono niezawodny system modelu komórkowego do badania molekularnej regulacji "brązowienia" białego tłuszczu.

Izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Tkanka tłuszczowa (AT) to miejsce intensywnej aktywacji i interakcji komórek odpornościowych.  Prawie wszystkie komórki układu odpornościowego są obecne w AT, a ich proporcje są zmieniane przez otyłość.  Właściwa izolacja, kwantyfikacja i charakterystyka populacji komórek odpornościowych AT mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w chorobie immunometabolicznej.

Izolacja komórek odpornościowych tkanki tłuszczowej

Przedstawiamy protokół izolowania fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z tkanki tłuszczowej, które reprezentują obiecujące jednostki unaczynienia. Można je szybko wyizolować, nie wymagają przetwarzania in vitro, a tym samym mogą być stosowane do jednoetapowej prewaskularyzacji w różnych dziedzinach inżynierii tkankowej.

Izolacja fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z mysiej tkanki tłuszczowej jako jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej

Biała tkanka tłuszczowa (WAT) ma krytyczne braki w swoich obecnych pierwotnych modelach hodowli, co utrudnia rozwój farmakologiczny i badania metaboliczne. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania układu mikrofizjologicznego tkanki tłuszczowej poprzez umieszczanie WAT między arkuszami komórek zrębu. Ta konstrukcja zapewnia stabilną i adaptowalną platformę dla podstawowej kultury WAT.

Platforma mikrofizjologiczna dla ludzkiego tłuszczu: warstwowa biała tkanka tłuszczowa

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Tutaj opisujemy izolację, hodowlę i indukcję adipogenną preadipocytów pochodzących z frakcji naczyniowej zrębu z mysiej tkanki tłuszczowej okołoaortalnej, co pozwala na badanie funkcji okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej i jej związku z komórkami naczyniowymi.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna preadipocytów pochodzących z frakcji zrębu naczyniowego z mysiej tkanki tłuszczowej okołooortalnej

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Poznaj półautomatyczną izolację frakcji naczyniowej zrębu z mysiej tkanki tłuszczowej przy użyciu dysocjatora tkankowego. Ta metoda zwiększa powtarzalność i redukuje zmienność eksperymentalną w badaniach nad adipogenezą.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Przeglądaj więcej filmów