Rozwarstwienie i izolacja specyficznej dla regionu bezkomórkowej tkanki płucnej
September 29th, 2023
Prezentowany tutaj jest protokół izolacji regionalnej decelularyzowanej tkanki płucnej. Protokół ten zapewnia potężne narzędzie do badania złożoności macierzy zewnątrzkomórkowej i interakcji komórka-macierz
.Narządy pozbawione komórek są stale wykorzystywane w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej. Jednak większość tych badań dotyczy narządu jako całości, a nie poszczególnych obszarów anatomicznych. Opracowaliśmy tę metodę, aby przyjrzeć się poszczególnym regionom anatomicznym zdecelularyzowanych ludzkich płuc w celu uzyskania bardziej precyzyjnych systemów modelowych do dalszych zastosowań.
Podczas opracowywania systemów modelowych ważne jest, aby wziąć pod uwagę różne aspekty projektowe, aby system jak najlepiej podsumował normalną biologię. Dalej obejmuje to takie czynniki, jak stres środowiskowy, cykliczne naprężenia mechaniczne i elastyczność, które mogą się różnić w zależności od regionu płuc. Korzystając z tej metody, byliśmy w stanie wykazać, że macierz zewnątrzkomórkowa pochodząca z poszczególnych anatomicznych regionów płuc, zarówno ze zdrowych, jak i chorych płuc, ma wyraźne sygnatury proteomiczne.
Dzięki temu możemy lepiej zrozumieć choroby płuc i potencjalnie opracować nowe ścieżki terapeutyczne. Aby kontynuować te badania, nasze laboratorium opracowuje obecnie trójwymiarowe hydrożele ze zdrowej i chorej macierzy zewnątrzkomórkowej płuc. Te hydrożele pozwalają nam przeprowadzić modelowanie organoidów in vitro w celu wyjaśnienia roli interakcji komórka-macierz zewnątrzkomórkowa na odpowiednie zachowanie komórki: Zacznij od zastosowania techniki rozprowadzania za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby ostrożnie odsłonić drogi oddechowe pobranego płuca świni.
Najpierw zlokalizuj największą drogę oddechową, która zwykle ma średnicę od 2 do 4 centymetrów. Następnie użyj kleszczy, aby dotknąć długości dróg oddechowych na głębokość jednego cala. Na koniec trzymaj nożyczki chirurgiczne równolegle do dróg oddechowych i włóż zamknięte końcówki w tkankę otaczającą niewidoczne drogi oddechowe.
Delikatnie otwórz nożyczki chirurgiczne, aby rozsunąć otaczającą błonę. Wyjmij nożyczki i powstrzymaj się od przecinania jakiejkolwiek tkanki. Powtarzaj ten proces z przerwami, aby kontynuować odsłanianie dróg oddechowych.
Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij drogi oddechowe w punktach rozgałęzień i wypreparuj wzdłuż każdej gałęzi niezależnie. Odetnij obszary dróg oddechowych, mając pewność, że nienaruszone końce pozostaną możliwe do zidentyfikowania i łatwe do zlokalizowania. Umieść odcięte obszary dróg oddechowych w odpowiedniej rurce, przy czym rozmiar odciętych obszarów waha się od 1 do 5 centymetrów długości, a szerokość różni się w zależności od względnego położenia wzdłuż drzewa dróg oddechowych.
Delikatnie uciskaj naczynia krwionośne, aby je odsłonić i powoli odciągnij je od dróg oddechowych. Pozwól, aby naczynia krwionośne lekko się rozciągnęły i użyj nożyczek chirurgicznych, aby jeszcze bardziej oddzielić je od dróg oddechowych. Unikaj wywierania zbyt dużego nacisku, ponieważ może to spowodować rozerwanie naczyń krwionośnych.
Po odsłonięciu punktu rozgałęzienia w drzewie naczyniowym włóż zamknięte końcówki nożyczek chirurgicznych tuż poniżej punktu rozgałęzienia i między dwoma odpowiednimi obszarami naczyniowymi. Następnie powoli otwórz nożyczki, aby rozsunąć leżące pod nimi tkanki. Z przerwami użyj pęsety, aby usunąć rozrzuconą tkankę i wszelkie inne tkanki bezpośrednio otaczające naczynia krwionośne.
Przeciąć naczynia krwionośne w punkcie rozgałęzienia, gdy zakrywa obszary dróg oddechowych lub staje się uciążliwe dla każdego etapu rozwarstwienia. Następnie przeanalizuj każdą gałąź niezależnie. Upewnij się, że dwa końce układu krwionośnego pozostają rozpoznawalne i łatwo zlokalizowane w celu dalszej sekcji, a następnie odetnij obszary naczyń krwionośnych.
Aby wyciąć tkankę wyrostka zębodołowego, zlokalizuj obszar tkanki, który nie znajduje się w pobliżu dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych. Ściśnij niewielki obszar tkanki, który wydaje się być pozbawiony naczyń krwionośnych lub dróg oddechowych, i oderwij uszczypniętą tkankę od płuca. Tkanka wyrostka zębodołowego jest szeroko obecna w płucach i powinna być usuwana podczas sekcji.
Obserwuj obszar usuniętej tkanki i sprawdź, czy jest to tkanka wyrostka zębodołowego. Procedura ta została zastosowana do modelu ludzkiego płuca. Analiza spektrometrii mas tkanek akcyzowych wykazała, że skład ECM różni się w zależności od poszczególnych regionów pozbawionych komórek płuc, w tym ECM całego płuca, ECM wzbogaconego w pęcherzyki płucne, ECM dróg oddechowych i ECM unaczynienia W pozbawionych komórek płucach uzyskanych od pacjentów bez historii chorób płuc, białka związane z błoną podstawną wzrosły w ECM wzbogaconym w pęcherzyki płucne
.W tym samym czasie ECM dróg oddechowych został wzbogacony w białko ECM związane z chrząstką, takie jak agrekan. ECM układu naczyniowego został wzmocniony fibronektyną i innymi rozpuszczalnymi białkami ECM związanymi z naczyniami krwionośnymi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
W tym artykule przedstawiono protokół izolacji regionalnych zdecellularyzowanych tkanek płuc, umożliwiający szczegółowe badanie macierzy zewnątrzkomórkowej i interakcji komórka-macierz. Metoda koncentruje się na poszczególnych regionach anatomicznych zdecellularyzowanych płuc, aby wzmocnić systemy modelowe do różnych zastosowań.
Kluczowe Elementy Badań
Obszar Nauki
- Inżynieria tkankowa
- Badania nad Macierzą Zewnątrzkomórkową
- Techniki deCellularyzacji
Tło
- Zdecellularyzowane narządy są wykorzystywane w inżynierii tkankowej.
- Większość badań traktuje narząd jako całość, a nie poszczególne regiony.
- Zrozumienie różnic regionalnych jest kluczowe dla dokładnych systemów modelowych.
- Czynniki takie jak stres środowiskowy i sprężystość różnią się w zależności od regionu płuca.
Cel Badań
- Opracowanie metody analizy poszczególnych regionów anatomicznych zdecellularyzowanych płuc.
- Stworzenie precyzyjnych systemów modelowych do dalszych zastosowań.
- Zbadanie odrębnych sygnatur proteomicznych regionów płuc z płuc zdrowych i chorych.
Wykorzystane Metody
- Izolacja regionalnych zdecellularyzowanych tkanek płuc.
- Analiza właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Profilowanie proteomiczne regionów płuc.
- Studia porównawcze między tkankami zdrowymi a chorymi.
Główne Wyniki
- Zidentyfikowano odrębne sygnatury proteomiczne w różnych regionach płuc.
- Metoda umożliwia bardziej niuansowe zrozumienie biologii płuc.
- Wyniki potwierdzają znaczenie analizy regionalnej w inżynierii tkankowej.
- Uzyskano wgląd w interakcje komórka-macierz.
Wnioski
- Protokół wzmacnia badania nad inżynierią tkanek płuc.
- Analiza regionalna jest niezbędna dla dokładnej recykulacji biologicznej.
- Przyszłe aplikacje mogą skorzystać ze zrozumienia różnic regionalnych.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Region-specific decellularized lung tissue isolation enables precise interrogation of extracellular matrix (ECM) composition, supporting advanced model systems for respiratory disease research and tissue engineering. This approach enhances predictive confidence in early discovery by clarifying region-dependent ECM signatures, directly impacting target validation and mechanistic de-risking. The method positions biopharma teams to develop more disease-relevant preclinical models and inform portfolio decisions for regenerative and cell-based therapies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of ECM-driven hypotheses in distinct lung regions.
- Supports mechanistic de-risking by revealing region-specific proteomic signatures.
- Improves predictive confidence for target selection in respiratory disease models.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, region-specific ECM substrates for downstream assays.
- Enhances assay reproducibility by isolating anatomical variability in ECM composition.
- Supports quantitative proteomic readouts for robust compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro organoid modeling with disease-relevant ECM microenvironments.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using regionally accurate substrates.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying ECM contributions to cell behavior.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling teams to bridge ECM biology with translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on ECM-driven mechanisms in specific lung regions.
- Screening: Provides standardized, region-specific ECM for reproducible assay development.
- Analytics: Delivers quantitative proteomic outputs to compare ECM composition across regions.
- Translational Research: Aligns in vitro and in vivo models with disease-relevant ECM features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for isolating region-specific ECM across species and disease states.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ECM research.
- Operational Value: Standardizes tissue isolation for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying ECM contributions to disease modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative and cell-based therapy programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in anatomical dissection and ECM proteomics.
- Needs access to decellularized lung tissue and mass spectrometry infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across studies.
- Adaptable to multiple species and both healthy and diseased tissue sources.
- Dependent on careful isolation to avoid cross-contamination between regions.
