Rozwarstwienie i izolacja specyficznej dla regionu bezkomórkowej tkanki płucnej

Narządy pozbawione komórek są stale wykorzystywane w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej. Jednak większość tych badań dotyczy narządu jako całości, a nie poszczególnych obszarów anatomicznych. Opracowaliśmy tę metodę, aby przyjrzeć się poszczególnym regionom anatomicznym zdecelularyzowanych ludzkich płuc w celu uzyskania bardziej precyzyjnych systemów modelowych do dalszych zastosowań.

Podczas opracowywania systemów modelowych ważne jest, aby wziąć pod uwagę różne aspekty projektowe, aby system jak najlepiej podsumował normalną biologię. Dalej obejmuje to takie czynniki, jak stres środowiskowy, cykliczne naprężenia mechaniczne i elastyczność, które mogą się różnić w zależności od regionu płuc. Korzystając z tej metody, byliśmy w stanie wykazać, że macierz zewnątrzkomórkowa pochodząca z poszczególnych anatomicznych regionów płuc, zarówno ze zdrowych, jak i chorych płuc, ma wyraźne sygnatury proteomiczne.

Dzięki temu możemy lepiej zrozumieć choroby płuc i potencjalnie opracować nowe ścieżki terapeutyczne. Aby kontynuować te badania, nasze laboratorium opracowuje obecnie trójwymiarowe hydrożele ze zdrowej i chorej macierzy zewnątrzkomórkowej płuc. Te hydrożele pozwalają nam przeprowadzić modelowanie organoidów in vitro w celu wyjaśnienia roli interakcji komórka-macierz zewnątrzkomórkowa na odpowiednie zachowanie komórki: Zacznij od zastosowania techniki rozprowadzania za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby ostrożnie odsłonić drogi oddechowe pobranego płuca świni.

Najpierw zlokalizuj największą drogę oddechową, która zwykle ma średnicę od 2 do 4 centymetrów. Następnie użyj kleszczy, aby dotknąć długości dróg oddechowych na głębokość jednego cala. Na koniec trzymaj nożyczki chirurgiczne równolegle do dróg oddechowych i włóż zamknięte końcówki w tkankę otaczającą niewidoczne drogi oddechowe.

Delikatnie otwórz nożyczki chirurgiczne, aby rozsunąć otaczającą błonę. Wyjmij nożyczki i powstrzymaj się od przecinania jakiejkolwiek tkanki. Powtarzaj ten proces z przerwami, aby kontynuować odsłanianie dróg oddechowych.

Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij drogi oddechowe w punktach rozgałęzień i wypreparuj wzdłuż każdej gałęzi niezależnie. Odetnij obszary dróg oddechowych, mając pewność, że nienaruszone końce pozostaną możliwe do zidentyfikowania i łatwe do zlokalizowania. Umieść odcięte obszary dróg oddechowych w odpowiedniej rurce, przy czym rozmiar odciętych obszarów waha się od 1 do 5 centymetrów długości, a szerokość różni się w zależności od względnego położenia wzdłuż drzewa dróg oddechowych.

Delikatnie uciskaj naczynia krwionośne, aby je odsłonić i powoli odciągnij je od dróg oddechowych. Pozwól, aby naczynia krwionośne lekko się rozciągnęły i użyj nożyczek chirurgicznych, aby jeszcze bardziej oddzielić je od dróg oddechowych. Unikaj wywierania zbyt dużego nacisku, ponieważ może to spowodować rozerwanie naczyń krwionośnych.

Po odsłonięciu punktu rozgałęzienia w drzewie naczyniowym włóż zamknięte końcówki nożyczek chirurgicznych tuż poniżej punktu rozgałęzienia i między dwoma odpowiednimi obszarami naczyniowymi. Następnie powoli otwórz nożyczki, aby rozsunąć leżące pod nimi tkanki. Z przerwami użyj pęsety, aby usunąć rozrzuconą tkankę i wszelkie inne tkanki bezpośrednio otaczające naczynia krwionośne.

Przeciąć naczynia krwionośne w punkcie rozgałęzienia, gdy zakrywa obszary dróg oddechowych lub staje się uciążliwe dla każdego etapu rozwarstwienia. Następnie przeanalizuj każdą gałąź niezależnie. Upewnij się, że dwa końce układu krwionośnego pozostają rozpoznawalne i łatwo zlokalizowane w celu dalszej sekcji, a następnie odetnij obszary naczyń krwionośnych.

Aby wyciąć tkankę wyrostka zębodołowego, zlokalizuj obszar tkanki, który nie znajduje się w pobliżu dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych. Ściśnij niewielki obszar tkanki, który wydaje się być pozbawiony naczyń krwionośnych lub dróg oddechowych, i oderwij uszczypniętą tkankę od płuca. Tkanka wyrostka zębodołowego jest szeroko obecna w płucach i powinna być usuwana podczas sekcji.

Obserwuj obszar usuniętej tkanki i sprawdź, czy jest to tkanka wyrostka zębodołowego. Procedura ta została zastosowana do modelu ludzkiego płuca. Analiza spektrometrii mas tkanek akcyzowych wykazała, że skład ECM różni się w zależności od poszczególnych regionów pozbawionych komórek płuc, w tym ECM całego płuca, ECM wzbogaconego w pęcherzyki płucne, ECM dróg oddechowych i ECM unaczynienia W pozbawionych komórek płucach uzyskanych od pacjentów bez historii chorób płuc, białka związane z błoną podstawną wzrosły w ECM wzbogaconym w pęcherzyki płucne

W tym samym czasie ECM dróg oddechowych został wzbogacony w białko ECM związane z chrząstką, takie jak agrekan. ECM układu naczyniowego został wzmocniony fibronektyną i innymi rozpuszczalnymi białkami ECM związanymi z naczyniami krwionośnymi.