Name: Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji plazmidowego DNA do modelowania guzów mózgu z mutacjami pacjenta. Technika umożliwia badanie mikrośrodowiska nowotworowego i skuteczności immunoterapii w modelu mysim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Gi Bum Kimowi za immunofluorescencyjne barwienie i obrazy. Dziękujemy również Emily Hatanaka, Naomi Kobritz i Paulowi Lineschowi za pomocne porady dotyczące protokołu.

Wszystkie procedury w tym protokole zostały zatwierdzone przez Cedars Sinai Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Homozygotyczne myszy mTmG wyhodowano z myszami C57BL / 6J w celu uzyskania miotów heterozygotycznych myszy mTmG płci mieszanej do wykorzystania w następującym protokole. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Młode myszy poddano elektropoturze między 0 a 3 dniem po urodzeniu (P0-P3).
1. Konfiguracja chirurgiczna
<ol>
	<li>Spryskaj stół operacyjny chemicznym środkiem dezynfekującym (np. Vimoba) i zetrzyj, a następnie 70% etanolem i ponownie wytrzyj.</li>
	<li>Na stole operacyjnym umieść następujące narzędzia/materiały: pipety kapilarne z ciągniętego szkła (patrz odniesienie10 na temat sposobu wyciągania pipet), małe nożyczki, mały pojemnik na ostre narzędzia stanowiące zagrożenie biologiczne, pipetor mikrolitrowy i końcówki do pipet, 2x wycięte kwadratowe kawałki folii parafinowej, żel do elektrody, elektrody, uchwyt do mikrowstrzykiwacza i mieszanka plazmidu DNA (patrz Tabela materiałów i Plik uzupełniający 1).</li>
	<li>Umieść następujące nasadki na sprzęcie na stole chirurgicznym lub na podłodze, jeśli jest to wskazane: panel sterowania mikrowtryskiwaczem, uchwyt i wtyczka przymocowane do maszyny, podstawka do trzymania uchwytu mikrowtryskiwacza z boku (pomoc do), pedał nożny mikrowtryskiwacza (na podłodze), elektrody przymocowane do maszyny i pedał nożny elektrody (na podłodze) (patrz Tabela materiałów). 
UWAGA: Pedał nożny elektrody został umieszczony po prawej stronie pedału nożnego mikrowtryskiwacza jako przypomnienie o kolejności użytkowania.</li>
	<li>Włącz panele sterowania mikrowtryskiwaczem i elektrodami.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy ustawienia mikrowtryskiwacza są prawidłowe dla eksperymentu: ciśnienie musi wynosić od 220 do 450 hPa, w zależności od tego, w jaki sposób mieszanina plazmidu jest pobierana.</li>
		<li>Sprawdź, czy ustawienia na panelu elektrod są poprawne dla eksperymentu. 
		UWAGA: W obecnym eksperymencie (i większości naszych modeli guzów mózgu) używa się pięciu impulsów o napięciu 120 V (50 ms; oddzielonych od siebie 950 ms).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę plazmidu w mikrowstrzykiwaczu.
	<ol>
		<li>Wyjmij jedną wyciągniętą szklaną pipetę kapilarną i włóż ją do uchwytu mikrowtryskiwacza. Upewnij się, że końcówka jest przykręcona, aby utrzymać się na miejscu.</li>
		<li>Trzymaj uchwyt mikrowstrzykiwacza jedną ręką, a małe nożyczki drugą; umieść końcówkę pipety nad małym pojemnikiem na ostre narzędzia biologiczne. Przy zamkniętych nożyczkach lekko dociśnij wydłużoną szklaną pipetę kapilarną. Wytnij w miejscu, w którym widoczne jest zagięcie, około 2 mm od otworu. Jeśli cięcie wygląda na udane, ostrożnie odłóż na bok.</li>
		<li>Umieść dostępną w handlu probówkę z mieszaczem plazmidów płasko na stole operacyjnym i otwórz. Pudełko z końcówką do pipet lub inny przedmiot należy umieścić za dnem probówki, aby utrzymać ją stabilnie podczas pobierania mieszanki plazmidowej. Umieść szklaną pipetę, która jest przymocowana do linii mikroiniektora, płasko na stole i delikatnie włóż do probówki z mieszanką plazmidową, upewniając się, że końcówka dobrze znajduje się w mieszance w pobliżu dna probówki. 
		UWAGA: Ze względu na naturalne ssanie grawitacyjne, odsysanie mieszanki plazmidowej rozpocznie się w szklanej pipecie przed aktywnym wciągnięciem.</li>
		<li>Trzymając końcówkę szklanej pipety w mieszance plazmidowej, użyj panelu mikroiniektora, aby zwiększyć pobieraną ilość. Zaczynając od 0, przekręć prawe pokrętło i wybierz w kierunku ujemnym w kierunku -60 - spowoduje to przeniesienie mieszanki plazmidowej do szklanej pipety. Przynieś tylko ~ 1 cal mieszanki plazmidowej. Przekręć pokrętło z powrotem na 0, a następnie wyjmij końcówkę pipety z mieszanki. 
		UWAGA: Nie wyjmuj końcówki pipety z mieszanki w kierunku ujemnym, ponieważ spowoduje to wystrzelenie mieszanki do mikrowtryskiwacza i prawdopodobnie do rurki.</li>
		<li>Przetestuj ilość mieszanki w jednym wstrzyknięciu, wstrzykując mieszaninę na jeden pasek folii parafinowej. Użyj pedału nożnego i naciśnij raz, aby wstrzyknąć mieszankę na folię parafinową. Za pomocą pipety o pojemności 1 μl należy pobrać mieszaninę z folii parafinowej i sprawdzić, czy wynosi ona dokładnie 1 μl. 
		UWAGA: Jeśli jest nieco mniejsze niż 1 μL, ciśnienie mikrowtryskiwacza można zwiększyć. Jeśli ciśnienie zbliża się do 450 hPa i nadal jest mniejsze niż 1 μl, szklany otwór pipety jest zbyt mały i będzie musiał zostać bardziej przycięty. Zaleca się umieszczenie mieszanki plazmidowej z powrotem w probówce przed przycinaniem. Mimo to na nożyczkach nadal będzie pozostała resztkowa mieszanka, dlatego konieczne jest dokładne oczyszczenie nożyczek za pomocą DNazy, aby usunąć pozostałą mieszankę. Jeśli wstrzyknięcie jest większe niż 1 μl, konieczne będzie użycie nowej pipety z wyciągniętego szkła i przycięcie. Gdy testowana ilość wynosi dokładnie 1 μl, szklana końcówka pipety ma odpowiedni rozmiar.</li>
		<li>Powtórz krok 2.1.4, aby pobrać dodatkową mieszankę plazmidową do zabiegu lub około 2-3 cali do wyciągniętej szklanej pipety. Upewnij się, że mieszanina nie wchodzi zbyt głęboko do mikrowtryskiwacza, gdzie nie widać końca. 
		UWAGA: Podczas wciągania mieszanki plazmidowej bardzo ważne jest, aby unikać pęcherzyków powietrza. Jeśli obecne są pęcherzyki, konieczne jest powtórzenie tego kroku, usuwając mieszaninę plazmidu z wyciągniętej szklanej pipety i zaczynając od nowa. Obecne pęcherzyki powietrza będą szkodliwe dla następujących etapów podczas wstrzykiwania do komory młodego człowieka.</li>
		<li>Gdy mieszanina plazmidu jest gotowa w wyciągniętej szklanej pipecie, umieść przygotowaną pipetę na boku na stojaku na przyrząd lutowniczy i nie przeszkadzaj, aby przypadkowo jej nie dotknąć/uderzyć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zwierzęta do eksperymentu.
	<ol>
		<li>Przygotuj wiaderko na lód do znieczulenia szczeniąt. Dodaj wodę do pojemnika na lód, aby się rozpuścił i pomógł schłodzić uchwyt znieczulający (np. górną część pudełka na pipety).</li>
		<li>Umieść górną część pudełka na stopionym lodzie, aby ostygł.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij szczenięta z klatki i umieść je w schłodzonym pudełku, które pozostaje na lodzie. Umieść kolejną górę luźno na dole, aby wspomóc proces chłodzenia.</li>
		<li>Po 2-3 minutach sprawdź, co się dzieje ze szczeniętami. Oddziel szczenięta od siebie, pozostając w pozycji leżącej. 
		UWAGA: Szczenięta będą się wiercić, ale zwolni to wraz z uruchomieniem zimnego znieczulenia. Górną część pudełka można pominąć, aby ułatwić oglądanie szczeniąt.</li>
		<li>Aby sprawdzić, czy znieczulenie jest prawidłowe, uszczypnij ogon szczeniaka i poszukaj reakcji. W przypadku wystąpienia reakcji powtórzyć krok 2.2.4. Jeśli nie słychać pisku ani nie wykonuje się niewielkiego ruchu, szczenię jest gotowe do zabiegu. 
		UWAGA: Myszy nie powinny być trzymane na lodzie przez dłuższy czas, ponieważ wpłynie to na ich zdolność do regeneracji po zabiegu. Tylko liczba młodych, które mogą być zarówno wstrzyknięte, jak i poddane elektropostacji, gdy są jeszcze pod narkozą, musi być jednocześnie umieszczana na lodzie; Większe liczby można osiągnąć z doświadczeniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja mieszanki plazmidu DNA do komory mózgu
<ol>
	<li>Umieść szczeniaka na stole w pozycji brzusznej.</li>
	<li>Odciągnij lekko tył głowy, aby uwidocznić szwy czaszki przez skórę. Znajdź lambdę na czaszce. Komora/miejsce wstrzyknięcia znajduje się w połowie drogi między lambdą a okiem. 
	UWAGA: Lambda to miejsce, w którym przecinają się szwy strzałkowe i lambdoidalne. Zobacz reference11, aby uzyskać informacje na temat identyfikacji lambda na czaszce myszy.</li>
	<li>Przekłuć skórę szklaną końcówką pipety pod prostopadłym kątem (pipeta jest skierowana prosto do sufitu). Zwróć uwagę na lekkie wklęsłe wgłębienie podczas naciskania na czaszkę i początkowy opór. Po przekłuciu i przebiciu szklanej końcówki pipety przez wklęsłe wgłębienie, osiągany jest odpowiedni poziom wstrzyknięcia.</li>
	<li>Przytrzymaj szklaną końcówkę pipety na miejscu i naciśnij raz pedał nożny mikrowstrzykiwacza, aby wstrzyknąć 1 μl mieszanki plazmidów. 
	UWAGA: Istnieją dwa sposoby, aby wyraźnie zobaczyć, że wstrzyknięcie się powiodło. Po pierwsze, poproś innego członka laboratorium, aby obserwował, jak mieszanina plazmidu schodzi w szklanej pipecie podczas wstrzykiwania. Ponadto, jeśli używasz szybkiego zielonego lub innego barwnika w mieszance plazmidowej, barwnik widocznie rozprzestrzeni się w komorze pod skórą po wstrzyknięciu i jest łatwo widoczny, gdy jest trzymany przy lampie chirurgicznej.</li>
</ol>
4. Elektroporacja
<ol>
	<li>Umieść kawałek folii parafinowej (jeden kwadrat) na stole i wyciśnij żel elektrodowy na wierzch folii. Przykryj łopatki elektrod żelem elektrodowym, nakładając obfitą ilość na każdą łopatkę. Nadmiar kapiącego żelu można zetrzeć ręcznikiem papierowym. 
	UWAGA: Po pierwszym EP nie pozwól, aby żel z każdej łopatki dotykał drugiej strony. Spowoduje to przeniesienie ładunku, a po nałożeniu na głowę szczeniaka może być słyszalny skwierczący dźwięk. Stanie się tak również wtedy, gdy żel na głowie szczeniaka z jednej elektrody wejdzie w kontakt z żelem z innej. 
	UWAGA: Należy uważać, aby palce nie zbliżały się do łopatek podczas elektroporacji.</li>
	<li>Trzymaj ciało szczeniaka jedną ręką (zazwyczaj ręką niedominującą), trzymając palce daleko za głową. 
	UWAGA: Jeśli jest praworęczny, najłatwiej jest trzymać szczeniaka lewą ręką, a elektrody prawą. Jeśli jesteś leworęczny, zrób odwrotnie.</li>
	<li>Zbliż elektrody do głowy szczeniaka, aby upewnić się, że są we właściwej pozycji, z elektrodą dodatnią na zewnątrz głowy, w miejscu, w którym komora jest celowana (np. jeśli celujesz w lewą komorę, umieść dodatnią po lewej stronie szczeniaka, a ujemną po prawej stronie szczeniaka). Podczas ustawiania elektrod delikatnie przesuń palec (zwykle kciuk) po grzbietowej stronie ciała/szyi za głową, aby pomóc podnieść głowę na miejsce.</li>
	<li>Sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając ogon i kontynuuj elektroporację tylko wtedy, gdy szczenię znajduje się w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia. Lekko ściśnij łopatki elektrod na rostralnej części głowy myszy, umieszczając je nad oczami. Naciśnij raz pedał nożny elektrody, aby rozpocząć elektroporację. Protokół ten wykorzystuje pięć impulsów o napięciu 120 V (50 ms, oddzielonych od siebie o 950 ms); Każdy impuls będzie słyszalny.
	<ol>
		<li>Przy każdym impulsie obracaj łopatki elektrod lekko w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, tak aby dodatnia łopatka poruszała się w kierunku czubka głowy. 
		UWAGA: Przy odpowiedniej elektroporacji poczujesz/zobaczysz, jak ciało szczeniaka myszy drga przy każdym impulsie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ostatnim impulsie wyjmij łopatki i odłóż na bok. Przenieś szczeniaka do czystego ręcznika papierowego i poproś innego członka laboratorium, aby usunął żel z głowy szczeniaka i umieścił go pod lampą grzewczą na ręczniku papierowym "łódka". 
	UWAGA: Upewnij się, że lampa grzewcza nie znajduje się zbyt blisko szczeniąt. Upewnij się, że inny członek laboratorium pomoże w tym kroku i miej stałe oko na szczenięta. Często pomaga trzymanie szczeniąt w dłoni pod lampą grzewczą, aby zwiększyć ciepło dla szczeniaka. Delikatne masowanie brzucha szczeniaka może również pomóc w powrocie do zdrowia.</li>
	<li>Wróć szczenięta do klatki domowej, gdy ich ciała będą miały zdrowy różowawy kolor i będą piszczeć na lekkie uszczypnięcie ogona. 
	UWAGA: Przed umieszczeniem ich z powrotem w klatce weź niewielką ilość materiału ściółkowego do klatki domowej i delikatnie posmaruj nim szczenięta, aby uzyskać zapach klatki. Umieść szczenięta z powrotem w klatce pod ściółką i wróć do pomieszczenia trzymania.</li>
</ol>
5. Kroki pooperacyjne
<ol>
	<li>Niewykorzystaną mieszaninę plazmidów z szklanej pipety mikroiniektora należy zwrócić z powrotem do probówki. Jeśli pozostała wystarczająca ilość mieszanki, można ją wykorzystać w przyszłych procedurach. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wytrzyj żel z łopatek elektrod ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Przywróć wszystkie części wyposażenia z powrotem na ich pierwotne miejsce. 
	UWAGA: Jeśli nożyczki zostały użyte do przecięcia szklanej końcówki pipety po pobraniu mieszanki plazmidowej, pozostaw nożyczki do dokładnego oczyszczenia roztworem DNazy.</li>
	<li>Spryskaj stół chemicznym środkiem dezynfekującym, następnie wytrzyj, a następnie spryskaj 70% etanolem, a następnie ponownie wytrzyj.</li>
</ol>

In Vivo Brain Tumor Modeling via Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA

<ol><li>Brabetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biobank+of+patient-derived+pediatric+brain+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).</li>
<li>Hadad, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+glioblastoma+for+the+evaluation+of+novel+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies.</a> Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+models+recapitulate+heterogeneity+of+molecular+signatures+and+drug+response+in+pediatric+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma.</a> Nature Communications. 12 (1), 4089(2021).</li>
<li>Szatmári, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+the+mouse+glioma+261+tumor+model+for+experimental+glioblastoma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy.</a> Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).</li>
<li>Genoud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+anti-PD-1+and+anti-CTLA-4+immune+checkpoint+blockade+in+SB28+and+GL261+mouse+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models.</a> Oncoimmunology. 7 (12), 1501137(2018).</li>
<li>Reardon, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Nivolumab+vs+Bevacizumab+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%3A+the+CheckMate+143+phase+3+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncology%22%5BJournal%5D)">Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial.</a> JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).</li>
<li>Wainwright, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+therapeutic+efficacy+utilizing+combinatorial+blockade+against+IDO%2C+CTLA-4%2C+and+PD-L1+in+mice+with+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors.</a> Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).</li>
<li>Kim, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+somatic+mouse+mosaics+with+locus-specific%2C+stably+integrated+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements.</a> Cell. 179 (1), 251-267 (2019).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+assembly%2C+and+transduction+of+transgenic+elements+using+mosaic+analysis+with+dual+recombinase+%28MADR%29%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR).</a> STAR protocols. 1 (3), 100199(2020).</li>
<li>White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intertwined+evolution+and+development+of+sutures+and+cranial+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579(2021).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Breunig, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ets+factors+regulate+neural+stem+cell+depletion+and+gliogenesis+in+Ras+pathway+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma.</a> Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice%3A+new+tools+to+tackle+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+loss+of+function+analysis+in+cerebellar+granule+cells+using+in+utero+electroporation-based+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57311(2018).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knock-in+by+CRISPR%2FCas9+and+cell+sorting+in+macrophage+and+T+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e62328(2021).</li>
<li>Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells+in+utero+electroporation+or+viral+stereotaxic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e4093(2012).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2103(2010).</li>
<li>Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+for+glioblastoma%3A+is+it+working%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Therapy for glioblastoma: is it working.</a> Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostarczanie plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji pozwala na zastosowanie in vivo biologii molekularnej, podobnej do tej stosowanej w genetycznie modyfikowanych modelach myszy, ale z szybkością, lokalizacją i wydajnością transdukcji wirusa 8,13,14. Z tym ostatnim wiążą się jednak obawy dotyczące bezpieczeństwa, a także odpowiedzi immunologicznej. Wykazaliśmy w naszym systemie modelowania wykorzystującym dostarczani...

Modele guzów mózgu u myszy są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów powstawania i leczenia guzów mózgu. Obecne modele zazwyczaj obejmują szybko wykonane podskórne lub ortotopowe przeszczepy powszechnie stosowanych linii komórek nowotworowych, oparte na ograniczonej liczbie mutacji napędowych lub modelach ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta, przy użyciu myszy z niedoborem odporności, które utrudniają prawidłowe badania immunoterapii1,2,3,4. Ponadto te wyniki przedkliniczne mogą prowadzić do wyników fałszywie dodatnich, ponieważ takie modele mogą wykazywać dramatyczne, często lecznicze efekty w odpowiedzi na terapię, ale nie przekłada się to na klinikę2,5,6,7. Zdolność do szybkiego wytwarzania genetycznie modyfikowanych przedklinicznych modeli myszy, które lepiej odzwierciedlają sygnatury mutacji pacjentów, jest niezbędna do poprawy wiarygodności wyników przedklinicznych.
Oparte na elektroporacji (EP) dostarczanie plazmidów DNA w celu wywołania mutacji zarówno utraty funkcji (LOF), jak i wzmocnienia funkcji (GOF) pozwala na generowanie takich modeli. Opracowaliśmy metodę jeszcze dokładniejszego odwzorowania mutacji sterownika GOF zwaną analizą mozaikową z wymianą kasetową za pośrednictwem podwójnej rekombinazy lub MADR8. Metoda ta pozwala na ekspresję genu (lub genów) będących przedmiotem zainteresowania w kontrolowany, specyficzny dla locus sposób w komórkach somatycznych8. W połączeniu z innymi narzędziami molekularnymi, takimi jak zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR), różne mutacje pacjentów można łączyć w celu opracowania mysich modeli guza mózgu. Metoda ta została zastosowana w przypadku różnych guzów mózgu u dzieci, w tym glejaków i wyściółczaków8, a także modeli guzów mózgu u dorosłych, takich jak glejak (GBM).
Chociaż metoda modelowania guzów metodą EP nie jest tak powszechna jak przeszczep, poniższe pokazuje dotychczasową łatwość i wysoką powtarzalność tego systemu modelowania. Myszy mTmG są używane do wprowadzania DNA plazmidu MADR8,9. System ten pozwala na rekombinację docelowych miejsc rekombinazy loxP i Flp (FRT) zlokalizowanych w locus Rosa26 w celu późniejszej insercji plazmidu DNA dawcy (tj. genu GOF będącego przedmiotem zainteresowania)8,9. Poniższy protokół demonstruje prostotę tej metody po sumiennej praktyce i zdolność do opracowywania mysich modeli guzów mózgu w autochtoniczny, spójny sposób.

<table><tbody><tr><td>0,1-2,5 i mikro; L Pipeta 1-kanałowa</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>2 &micro; L końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-442</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>2-20 &mikro; L Pipeta 1-kanałowa</td><td>Eppendorf</td><td>3123000098</td><td></td></tr><tr><td>DNAZap PCR Rozwiązania do degradacji DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Kwadratowy elektroporator</td><td>BTX</td><td>45-0662</td><td></td></tr><tr><td>Żel elektrodowy</td><td>Parker Labs</td><td>PLI152CSZ</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green Dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pomocna dłoń Pomoc do</td><td>Pro'sKit</td><td>900-015</td><td></td></tr><tr><td>Mikro nożyczki preparacyjne, 4,5-calowe proste ostre</td><td>Roboz</td><td>RS-5916</td><td></td></tr><tr><td>Odmiana myszy: C57BL / 6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Szczep myszy: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>&nbsp; JAX: 007676</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Grainger</td><td>16Y894</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>129419</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa pęseta, średnica 7 mm</td><td>BTX</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na ostre przedmioty, 1-litrowy</td><td>Uline</td><td>S-15307</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe szklane kapilary, 4 cale, 1 mm OD, 0,58 mm ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Pipety kapilarne należy wyciągnąć - szczegółowe informacje znajdują się w odnośniku 10.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td>Ustawienia grzania: Ciepło #1 przy 880, Ciepło #2 przy 680; pociągnięcie przy 800. Zobacz odniesienie 10, aby uzyskać więcej informacji na temat ciągnięcia.&nbsp;</td></tr><tr><td>Rozwiązanie do tabletek Vimoba</td><td>Quip Laboratories</td><td>VIMTAB</td><td></td></tr><tr><td>XenoWorks Cyfrowy mikrowtryskiwacz</td><td>Sutter Instruments</td><td>BRE</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na mikropipety XenoWorks</td><td>Sutter Instruments</td><td>BR-MH</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego dna reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures

Modele nowotworów są kluczowe dla badań przedklinicznych guzów mózgu pod kątem odkrywania nowych, bardziej skutecznych metod leczenia. Przy dużym zainteresowaniu immunoterapią, jeszcze ważniejsze jest posiadanie spójnego, klinicznie istotnego, immunokompetentnego modelu myszy do badania populacji guza i komórek odpornościowych w mózgu oraz ich odpowiedzi na leczenie. Podczas gdy większość modeli przedklinicznych wykorzystuje przeszczep ortotopowy ustalonych linii komórek nowotworowych, przedstawiony tutaj system modelowania pozwala na "spersonalizowaną" reprezentację specyficznych dla pacjenta mutacji nowotworowych w stopniowym, ale skutecznym rozwoju na podstawie konstruktów DNA wstawionych do dzielących się nerwowych komórek prekursorowych (NPC) in vivo. Konstrukty DNA obejmują analizę mozaikową za pomocą metody wymiany kasetowej za pośrednictwem podwójnej rekombinazy (MADR), co pozwala na mutagenezę somatyczną mutacji sterownika w jednej kopii. Wykorzystując nowonarodzone młode myszy między urodzeniem a 3 dniem życia, NPC są celem poprzez wykorzystanie tych dzielących się komórek wyściełających boczne komory. Po mikroiniekcji plazmidów DNA (np. pochodzących z MADR, transpozonów, sgRNA kierowanego przez CRISPR) do komór następuje elektroporacja za pomocą łopatek otaczających obszar rostralny głowy. Po stymulacji elektrycznej DNA jest pobierane do dzielących się komórek, z potencjałem integracji z genomem. Zastosowanie tej metody zostało z powodzeniem wykazane w rozwoju nowotworów mózgu zarówno u dzieci, jak i dorosłych, w tym najczęstszego złośliwego guza mózgu, glejaka. W tym artykule omówiono i zademonstrowano różne etapy opracowywania modelu guza mózgu przy użyciu tej techniki, w tym procedurę znieczulania młodych młodych młodych myszy, do mikroiniekcji mieszanki plazmidowej, a następnie elektroporacji. Dzięki temu autochtonicznemu, immunokompetentnemu modelowi myszy naukowcy będą mieli możliwość rozszerzenia podejść do modelowania przedklinicznego w celu ulepszenia i zbadania skuteczności leczenia raka.

Opisany powyżej protokół został z powodzeniem zastosowany do opracowania mysich modeli guzów mózgu zarówno u dzieci, jak i u dorosłych, przy czym ten pierwszy został szczegółowo opisany w pracy Kim et al.8Przy zastosowaniu właściwej techniki i starannym zaplanowaniu konstrukcji plazmidu, skuteczność indukowania guzów za pomocą elektroporacji (EP) zazwyczaj wynosi 100%. Histologia jest najszybszym i najłatwiejszym sposobem sprawdzenia sukcesu insercji plazmidu DNA w przypadku użycia białka reporter...

Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Tumor models are critical for the preclinical testing of brain tumors in terms of exploring new, more efficacious treatments. With significant interest in ...

Technika ta koncentruje się na modelowaniu profili mutacji glejaka u pacjentów w immunokompetentnym modelu myszy oraz na tym, jak te różne mutacje wpływają na mikrośrodowisko guza i odpowiedź na leczenie. Sekwencjonowanie genomu i pojedynczych komórek identyfikuje, że mutacje genetyczne glejaka są związane z agresywnością raka i składnikami mikrośrodowiska guza, takimi jak populacja komórek odpornościowych. Mysie modele glejaka wielopostaciowego w badaniach przedklinicznych wykazują duży sukces w immunoterapii, prowadząc do wyników leczniczych i braku oznak wzrostu guza po leczeniu.Jednak efekty te nie są odzwierciedlone u pacjentów pod kątem wyniku lub przeżycia. Protokół ten podsumowuje profile mutacji guza glejaka u pacjenta w immunokompetentnym modelu myszy, umożliwiając stopniowy wzrost autochtonicznego guza i lepsze przewidywanie skuteczności leczenia, zwłaszcza w przypadku immunoterapii. Ten system modelowania integruje plazmidy DNA z genomem poprzez elektroporację myszy immunokompetentnych.Pozwala to uniknąć stosowania wirusów i przeszczepiania tysięcy komórek nowotworowych, z których oba mogą mieć własne działanie immunologiczne, co zakłóca dalsze wyniki. Wykorzystanie imm

modeling-brain-tumors-vivo-using-electroporation-based-delivery

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Tutaj opisujemy skuteczny i wszechstronny protokół do indukcji, monitorowania i analizy nowych glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o histopatologicznej charakterystyce ludzkiego GBM.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Przerzuty do mózgu są przyczyną ciężkiej zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z rakiem. Większość mysich modeli przerzutów do mózgu jest skomplikowana przez przerzuty ogólnoustrojowe, mylące analizę śmiertelności i wyników interwencji terapeutycznej. Przedstawiono tutaj protokół wewnętrznego wstrzykiwania komórek rakowych do tętnicy szyjnej, który wytwarza spójne guzy wewnątrzczaszkowe z minimalnymi guzami ogólnoustrojowymi.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek rakowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Rezonans paramagnetyczny elektronów o niskim polu (pasmo L, 1,2 GHz) przy użyciu rozpuszczalnych sond nitroksylowych i trytylowych jest demonstrowany do oceny fizjologicznie ważnych parametrów w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi.

In vivo (in vivo) Ocena EPR pH, pO2, stanu redoks oraz stężeń fosforanów i glutationu w mikrośrodowisku guza

Poznaj metodę elektroporacji plazmidowego DNA do modelowania guzów mózgu z mutacjami pacjenta. Technika umożliwia badanie mikrośrodowiska nowotworowego i skuteczności immunoterapii w modelu mysim.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta (Wideo) | JoVE Journal

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Przeglądaj więcej filmów