Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta
23 czerwca 2023
Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.
Technika ta koncentruje się na modelowaniu profili mutacji glejaka u pacjentów w immunokompetentnym modelu myszy oraz na tym, jak te różne mutacje wpływają na mikrośrodowisko guza i odpowiedź na leczenie. Sekwencjonowanie genomu i pojedynczych komórek identyfikuje, że mutacje genetyczne glejaka są związane z agresywnością raka i składnikami mikrośrodowiska guza, takimi jak populacja komórek odpornościowych. Mysie modele glejaka wielopostaciowego w badaniach przedklinicznych wykazują duży sukces w immunoterapii, prowadząc do wyników leczniczych i braku oznak wzrostu guza po leczeniu.
Jednak efekty te nie są odzwierciedlone u pacjentów pod kątem wyniku lub przeżycia. Protokół ten podsumowuje profile mutacji guza glejaka u pacjenta w immunokompetentnym modelu myszy, umożliwiając stopniowy wzrost autochtonicznego guza i lepsze przewidywanie skuteczności leczenia, zwłaszcza w przypadku immunoterapii. Ten system modelowania integruje plazmidy DNA z genomem poprzez elektroporację myszy immunokompetentnych.
Pozwala to uniknąć stosowania wirusów i przeszczepiania tysięcy komórek nowotworowych, z których oba mogą mieć własne działanie immunologiczne, co zakłóca dalsze wyniki. Wykorzystanie immunokompetentnego modelu mysiego, który podsumowuje profile mutacji pacjenta, pozwala na dokładniejszą ocenę wyników leczenia, zapobiegając pracochłonnemu zadaniu dostarczania fałszywie dodatnich wyników do kliniki. Na początek połóż znieczulone szczenię myszy na stole w pozycji brzusznej.
Lekko pociągnij tył głowy szczeniaka, aby uwidocznić szwy czaszki przez skórę. Znajdź lambdę na czaszce. Komora lub miejsce wstrzyknięcia będzie widoczne w połowie drogi między lambdą a okiem.
Pod prostopadłym kątem przekłuć skórę szklaną końcówką pipety. Zauważony zostanie początkowy opór i lekkie wklęsłe wgłębienie. Po przekłuciu przytrzymaj końcówkę na miejscu i naciśnij raz pedał nożny mikroiniektora, aby wstrzyknąć jeden mikrolitr mieszanki plazmidowej.
Rozpocznij dostarczanie plazmidu DNA opartego na elektroporacji, kładąc kwadratowy kawałek folii parafinowej na stole i ściskając żel elektrody na wierzchu folii. Następnie nałóż dużą ilość żelu elektrodowego na każdą łopatkę, aby całkowicie pokryć łopatki elektrod. Następnie trzymaj szczenię z mikrowstrzykniętą mieszanką plazmidowego DNA w niedominującej ręce, trzymając palce za głową.
Aby ustawić głowę szczeniaka do elektroporacji, delikatnie przesuń palec po następnej stronie grzbietowej za głową i umieść elektrodę dodatnią na zewnątrz głowy, gdzie celowana jest komora. Umieść elektrodę nad okiem szczeniaka i lekko ściśnij łopatki elektrody na rostralnej części głowy szczeniaka. Naciśnij pedał nożny elektrody, aby rozpocząć elektroporację.
Przy każdym impulsie obracaj łopatki elektrod lekko w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, tak aby dodatnia łopatka przesuwała się w kierunku czubka głowy. Po ostatnim impulsie wyjmij łopatki i odłóż je na bok. Myszy były w stanie agonalnym po pięciu miesiącach od elektroporacji, a pełny wzrost guza wykryto za pomocą białka reporterowego i analizy histologicznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę tworzenia mysich modeli guzów mózgu, które dokładnie odwzorowują powszechne mutacje występujące u pacjentów z glejakiem wielopostaciowym. Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu pozwala badaczom lepiej przewidzieć skuteczność leczenia, w szczególności w przypadku immunoterapii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Immunoterapia
Wprowadzenie
- Glioblastoma charakteryzuje się agresywnym przebiegiem nowotworowym.
- Genetyczne mutacje sterujące wpływają na mikrośrodowisko guza i odpowiedź na leczenie.
- Obecne modele przedkliniczne często nie pozwalają na prawidłowe przewidzenie wyników leczenia pacjentów.
- Modele immunokompetentne zapewniają dokładniejszą reprezentację choroby ludzkiej.
Cel badania
- Stworzenie modelu mysiego naśladującego mutacje glejaka wielopostaciowego u pacjentów.
- Badanie wpływu tych mutacji na wzrost guza oraz odpowiedź na leczenie.
- Zwiększenie wartości prognostycznej badań przedklinicznych dla immunoterapii.
Zastosowane metody
- Dostarczanie plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji.
- Integracja plazmidów DNA z genomem myszy immunokompetentnych.
- Modelowanie stopniowego autochtonicznego wzrostu guza.
- Sekwencjonowanie genomowe i jednokomórkowe w celu profilowania mutacji.
Główne wyniki
- Skuteczne modelowanie profili mutacji pacjentów z glejakiem wielopostaciowym.
- Identyfikacja populacji komórek odpornościowych związanych z zachowaniem guza.
- Wykazana skuteczność immunoterapii w badaniach przedklinicznych.
- Wskazanie rozbieżności między modelami mysimi a wynikami u pacjentów.
Wnioski
- Opracowany model stanowi wiarygodną platformę do testowania strategii immunoterapeutycznych.
- Pozwala on na lepsze zrozumienie oddziaływań w mikrośrodowisku guza.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model w celu usprawnienia strategii leczenia pacjentów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dostarczanie specyficznych dla pacjenta sygnatur mutacyjnych do komórek prekursorowych neuronów myszy immunokompetentnych za pomocą elektroporacji umożliwia tworzenie wysoce prognostycznych, autochtonicznych modeli guzów mózgu do przedklinicznej oceny immunoterapii. Podejście to niweluje lukę translacyjną między standardowymi ksenoprzeszczepami linii komórkowych a wynikami klinicznymi poprzez odtworzenie mikrośrodowiska guza i kontekstu immunologicznego. Model ten wspiera dostosowanie ryzyka przy wdrażaniu środków immunoonkologicznych, dostarczając bardziej relewantnych klinicznie danych dotyczących skuteczności i mechanizmów działania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mutacji sterujących w glejakach wielopostaciowych oraz ich wpływu na biologię guza in vivo.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów genetycznych w immunokompetentnym systemie odpowiadającym przebiegowi choroby.
- Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez modelowanie profili mutacji pacjentów oraz interakcji immunologicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia platformę do oceny środków immunoterapeutycznych w kontekście odzwierciedlającym dynamikę interakcji między guzem a układem odpornościowym pacjenta.
- Dostarcza powtarzalnych, ilościowych odczytów wzrostu guza i populacji komórek odpornościowych do oceny związków.
- Wspiera standaryzację testów poprzez unikanie efektów zakłócających wywołanych przez wektory wirusowe lub transplantację komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje przedkliniczne testy skuteczności do sygnatur mutacyjnych oraz mikrośrodowisk immunologicznych istotnych dla pacjentów.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do przedklinicznej walidacji w programach immunoonkologicznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do translacji klinicznej poprzez modelowanie stopniowego, endogennego rozwoju guza.
Integracja z potokiem i przepływem pracy
Model ten integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami nad mechanizmami a translacyjną oceną immunoterapii.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących tumorigenzy napędzanej mutacjami oraz modulacji odpornościowej.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych pomiarów komórek nowotworowych i odpornościowych w celu priorytetyzacji kandydatów.
- Analityka: Umożliwia analizę wyników sekwencjonowania genomicznego i jednokomórkowego w celu porównania efektów mutacji i odpowiedzi na leczenie.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do profili biomarkerów pacjentów i sygnatur odpornościowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje reużywalną, modułową platformę dla różnorodnych kombinacji mutacji i metod leczenia.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad immunoonkologią.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje modelowanie nowotworów bez czynników zakłócających w postaci wirusów lub transplantacji, co poprawia powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez odfiltrowanie wyników fałszywie dodatnich przed badaniami klinicznymi.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na immunoterapię.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z noworodkami myszy, mikroiniekcji oraz technik elektroporacji.
- Wymaga dostępu do sprzętu do elektroporacji i infrastruktury do analiz genomowych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności indukcji nowotworów i gromadzenia danych.
- Może być konieczna adaptacja w zależności od różnych sygnatur mutacyjnych lub podtypów nowotworów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wymagane umiejętności techniczne oraz ramy czasowe opracowania modelu.
