Mysi model neowaskularyzacji rogówki za pomocą oparzenia alkalicznego
30 czerwca 2023
Ten protokół skupia się na neowaskularyzacji rogówki wywołanej oparzeniami alkalicznymi u myszy. Metoda ta pozwala na stworzenie powtarzalnego i kontrolowanego modelu choroby rogówki w celu zbadania patologicznej angiogenezy i związanych z nią mechanizmów molekularnych oraz przetestowania nowych środków farmakologicznych zapobiegających neowaskularyzacji rogówki.
Staramy się opracować wysoce powtarzalny model indukcji neowaskularyzacji rogówki oraz zidentyfikować najistotniejsze metody histologiczne i immunobarwiące w celu monitorowania terapii mających na celu zapobieganie i ograniczanie neowaskularyzacji. Wadami modeli oparzeń alkalicznych rogówki są trudności w kontrolowaniu obszaru i ciężkości oparzenia alkalicznego, zmienność neowaskularyzacji rogówki oraz niezamierzone oparzenia krawędzi i tkanek z powodu nadmiaru roztworu alkalicznego. Neowaskularyzacja rogówki jest stanem zagrażającym wzrokowi.
Patogeneza tego schorzenia jest słabo poznana. Model ten zostanie wykorzystany do uzyskania nowych informacji na temat tego schorzenia i zidentyfikowania odpowiednich celów terapeutycznych. W porównaniu z modelem angiogenezy kieszeni rogówkowej, modele oparzeń alkalicznych są stosunkowo proste do stworzenia i mogą być również wykorzystywane do badania zapalenia rogówki, zwłóknienia i proliferacji nabłonka.
Modele te są również ściślej związane z klinicznymi oparzeniami chemicznymi niż modele angiogenezy za pomocą szwów rogówkowych. Wykorzystamy zasadowe oparzenia rogówki jako model choroby do zbadania nowej terapii antyangiogennej w leczeniu neowaskularyzacji i zmętnienia rogówki. Na początek wstrzyknij meloksykam podskórnie sześcio- do ośmiotygodniowej myszy płci męskiej C57 Black 6J na 30 minut przed zabiegiem w celu złagodzenia bólu.
Po znieczuleniu myszy uszczypnij palce u nóg i potwierdź brak odruchu. Nałóż jedną kroplę 0,5% proparakainy na powierzchnię rogówki jednego z nich i kroplę sztucznych łez na drugie oko. Następnie, za pomocą dwumilimetrowego dziurkacza do biopsji, wybij papierowe krążki filtracyjne Whatmana.
Dodaj dwa mikrolitry jednego normalnego wodorotlenku sodu do czystej szalki Petriego i umieść krążek z bibuły filtracyjnej na kropli wodorotlenku sodu, pozwalając mu wsiąknąć przez 15 sekund. Za pomocą kleszczy podnieś bibułę filtracyjną i przyłóż ją do oka potraktowanego proparakainą w środku rogówki na 30 sekund. Przemyć oko, przepłukując je 20 mililitrami sterylnej soli fizjologicznej w strzykawce.
Delikatnie wytrzyj nadmiar soli fizjologicznej z oczu i okolic za pomocą jednorazowych miękkich chusteczek. Umieść mysz w klatce regeneracyjnej na ciepłej poduszce grzewczej do czasu rozpoczęcia chodzenia. W 10 dniu po oparzeniu wykonaj obrazy OCT przedniego odcinka oczu jako skan objętości w trybie HRA+OCT z 30-stopniowym polem widzenia i intensywnością 100% podczerwieni.
Neowaskularyzacja rogówki wyrosła z naczyń rąbka w kierunku środka rogówki w oku myszy oparzonym alkaliami, ale nie w zdrowym oku. Grupa oparzeń alkalicznych wykazała znacznie podwyższone wyniki neowaskularyzacji i zmętnienia w porównaniu z grupą kontrolną. Barwienie immunologiczne rogówek naczyń krwionośnych i limfatycznych wykazało istotnie większą gęstość naczyń krwionośnych i limfatycznych po 10 dniach w grupie oparzonej w porównaniu z grupą kontrolną.
Grubość rogówki zobrazowana i określona ilościowo za pomocą OCT była znacznie wyższa w grupie oparzeń.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na opracowaniu powtarzalnego modelu neowaskularyzacji rogówki indukowanej oparzeniami alkalicznymi u myszy. Model ten ma na celu wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw patologicznej angiogenezy oraz ocenę potencjalnych interwencji farmakologicznych w celu ograniczenia neowaskularyzacji rogówki.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Patologiczna angiogeneza
- Zaburzenia rogówki
- Ocena terapii farmakologicznej
Wstęp
- Neowaskularyzacja rogówki stanowi poważne zagrożenie dla wzroku.
- Obecny stan wiedzy na temat jej patogenezy jest ograniczony.
- Istniejące modele wykazują problemy z powtarzalnością i kontrolą.
Zastosowane metody
- Model oparzenia alkalicznego z użyciem wodorotlenku sodu
- Samce myszy szczepu C57 Black 6J
- Techniki histologiczne i immunobarwienia do oceny
Główne wyniki
- Zwiększona neowaskularyzacja i zmętnienie w rogówkach po oparzeniu alkaliami w porównaniu z grupą kontrolną.
- Wyższa gęstość naczyń krwionośnych i limfatycznych w grupie po oparzeniu.
- Istotne różnice w grubości rogówki mierzonej za pomocą OCT.
Wnioski
- Model ten ułatwia badanie nowych terapii antyangiogennych.
- Dostarcza on informacji istotnych dla klinicznych oparzeń chemicznych oraz gojenia rogówki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Solidne modele przedkliniczne neowaskularyzacji rogówki są niezbędne do ograniczania ryzyka w procesie odkrywania leków antyangiogennych oraz wyjaśniania mechanizmów choroby. Mysi model oparzenia alkalicznego zapewnia odtwarzalny, mierzalny system do oceny interwencji terapeutycznych i zrozumienia patologicznej angiogenezy w dostępnej, beznaczyniowej tkance. Model ten wspiera ciągłość translacyjną od wczesnej fazy odkrywania po walidację przedkliniczną, co bezpośrednio wpływa na priorytetyzację portfolio w programach ukierunkowanych na choroby oczu i angiogenezę.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków angiogennych i identyfikację celów terapeutycznych w kontrolowanym kontekście in vivo.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie klinicznie istotnych uszkodzeń chemicznych i ich następstw.
- Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad zaangażowaniem celu oraz mechanizmem działania czynników antyangiogennych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę do oceny potencjalnych związków i leków biologicznych ukierunkowanych na neowaskularyzację.
- Dostarcza ilościowych wyników za pomocą immunostainingu (CD31, LYVE-1) oraz obrazowania OCT w celu obiektywnej oceny.
- Umożliwia skalowalność testu i porównywalność między badaniami dzięki określonym parametrom urazu i wskaźnikom końcowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodne z mechanizmami obrażeń istotnymi dla choroby, obserwowanymi w klinicznych oparzeniach chemicznych.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po przedkliniczną ocenę skuteczności i walidację biomarkerów.
- Wspiera decyzje o rozwoju programów angiogenezy ocznej i systemowej, skorygowane o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten stanowi pomost między wczesną fazą odkrywania, identyfikacją związków wiodących a walidacją przedkliniczną terapii antyangiogennych ukierunkowanych na neowaskularyzację rogówki i struktur pozgałkowych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniu szlaków angiogenezy in vivo.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalne, ilościowe punkty końcowe dla oceny związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównanie neowaskularyzacji, limfangiogenezy i obrzęku rogówki w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i zwiększa istotność translacyjną w kontekście klinicznej patologii chemicznych oparzeń.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, zwalidowaną platformę do ciągłego przesiewu leków antyangiogennych i preparatów biologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad angiogenezą.
- Wartość operacyjna: Poprawia odtwarzalność, standaryzację i skalowalność przedklinicznych badań skuteczności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie solidnych danych in vivo.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów ukierunkowanych na oko i angiogenezę.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w mikrochirurgii oka oraz w pracy ze zwierzętami w celu zapewnienia powtarzalności indukcji urazu.
- Wymagany jest dostęp do odczynników do immunobarwienia (anty-CD31, anty-LYVE-1) oraz infrastruktury do obrazowania OCT.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów urazu i kryteriów oceny pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności wyników.
- Protokół można dostosować do różnych podłoży genetycznych i metod terapeutycznych poprzez optymalizację procedury.
- Ograniczenia obejmują potencjalną zmienność stopnia nasilenia oparzenia oraz konieczność ścisłej kontroli proceduralnej.
