Name: Mysi model neowaskularyzacji rogówki za pomocą oparzenia alkalicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Poznaj model neowaskularyzacji rogówki u myszy wywołany oparzeniem alkalicznym. Ta metoda pozwala badać patologiczną angiogenezę i oceniać terapie farmakologiczne w leczeniu chorób rogówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez SRB Charitable Corporation, National Institutes of Health (NIH) P30EY002520, oraz nieograniczony grant instytucjonalny od Research to Prevent Blindness (RPB) dla Wydziału Okulistyki, Baylor College of Medicine. W.L. jest wspierany przez The Knights Templar Eye Foundation Endowment in Ophthalmology.

Wszystkie prace na zwierzętach, w tym procedury eksperymentalne i eutanazja, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Baylor College of Medicine z numerem protokołu AN-8790.
1. Przygotowanie 1 N NaOH
<ol>
	<li>Dodaj 4 ml sterylnej wody dejonizowanej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odważyć 400 mg wodorotlenku sodu (NaOH) i ostrożnie dodać do probówki.</li>
	<li>Rozpuścić NaOH, powoli mieszając roztwór za pomocą szklanej pałeczki. Uzupełnić objętość do 10 ml, dodając sterylną wodę dejonizowaną do probówki, a następnie ponownie wymieszać, delikatnie obracając probówkę w górę i w dół. Zamknij szczelnie nakrętkę i przechowuj roztwór w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Świeży roztwór należy przygotowywać co miesiąc, ponieważ stężenie roztworu NaOH może być zmniejszone przez roztwór absorbujący dwutlenek węgla z powietrza.</li>
	<li>Zawsze delikatnie wymieszaj roztwór NaOH przed użyciem. 
	UWAGA: Przygotuj roztwór w kapturze chemicznym i noś odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).</li>
</ol>
2. Przygotowanie 4% roztworu paraformaldehydu (PFA)
<ol>
	<li>Dodaj 30 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do szklanej zlewki. Odważyć 4 g paraformaldehydu (PFA) i dodać go do zlewki.</li>
	<li>Przechowywać zlewkę na gorącym talerzu w temperaturze 60 °C, mieszając. Dodawać kroplami 1 N roztwór NaOH, aby podnieść pH, aż roztwór się klaruje.</li>
	<li>Sprawdź i dostosuj pH do 7,4 za pomocą 1 N kwasu solnego (HCl). Dostosuj końcową objętość do 50 ml za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Ostudzić i przefiltrować roztwór. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Przygotuj roztwór w dygestorium, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie koktajlu ketamina/ksylazyna
<ol>
	<li>Przygotuj koktajl ketamina/ksylazyna, dodając 0,8 ml ketaminy (stężenie podstawowe: 100 mg/ml) i 0,16 ml ksylazyny (stężenie podstawowe: 100 mg/ml) do 9,4 ml soli fizjologicznej.</li>
	<li>Koktajl należy przechowywać w sterylnych butelkach do wstrzykiwań w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
4. Oparzenie alkaliczne na rogówce myszy
<ol>
	<li>Meloksykam (4-6 mg/kg masy ciała) należy wstrzyknąć podskórnie 30 minut przed zabiegiem w celu złagodzenia bólu. Znieczulić myszy (C57BL/6J, 6-8 tygodni, samiec) za pomocą iniekcji dożylnej koktajlu ketamina/ksylazyna (ketamina 80 mg/kg i ksylazyna 16 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Sprawdź reakcję odruchową (wycofanie pedału), ściskając palce myszy i potwierdź brak odruchu. Nałóż jedną kroplę znieczulenia miejscowego, 0,5% proparakainy, na powierzchnię rogówki jednego oka i kroplę sztucznych łez na drugie oko.</li>
	<li>Za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 2 mm wybij papierowe krążki filtracyjne Whatmana.</li>
	<li>Dodać 2 μl 1N NaOH do czystej szalki Petriego. Umieść krążek z bibuły filtracyjnej o średnicy 2 mm na kropli 1 N NaOH i pozwól mu moczyć się przez 15 sekund.</li>
	<li>Podnieś bibułę filtracyjną za pomocą kleszczyków i nałóż bibułę filtracyjną na oko potraktowane proparakainą w środku rogówki przez 30 s. 
	UWAGA: Bibuła filtracyjna musi dotykać tylko środka rogówki i należy zachować ostrożność, aby uniknąć przesuwania się bibuły filtracyjnej po umieszczeniu, ponieważ przesuwanie bibuły filtracyjnej może spowodować oparzenia sąsiednich tkanek.</li>
	<li>Przepłukać oko przez przepłukanie 20 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej w sterylnej strzykawce. 
	UWAGA: Należy zadbać o to, aby rogówka wraz z workiem spojówkowym została dokładnie umyta, aby zapobiec dalszemu uszkodzeniu rogówki lub otaczającej tkanki. Mycie worka spojówkowego dodatkowo zapobiegnie symblefaronowi.</li>
	<li>Delikatnie wytrzyj nadmiar soli fizjologicznej z oczu i okolic za pomocą jednorazowych miękkich chusteczek. Następnie trzymaj myszy w klatce regeneracyjnej na ciepłej poduszce grzewczej do czasu rozpoczęcia chodzenia. 
	UWAGA: Myszy są monitorowane codziennie po oparzeniu alkaliów przez 3 dni. W przypadku zaobserwowania objawów bólu lub stresu meloksykam (4-6 mg/kg masy ciała) podaje się podskórnie.</li>
</ol>
5. Badanie i ocena neowaskularyzacji i zmętnienia
<ol>
	<li>U znieczulonych myszy zbadaj oczy pod mikroskopem preparacyjnym w 10 dniu po oparzeniu i uzyskaj obrazy za pomocą kamery dołączonej do lunety sekcyjnej, aby ocenić zmętnienie i neowaskularyzację. 
	UWAGA: Wystarczy zwykła luneta sekcyjna z dołączoną kamerą.</li>
	<li>Obserwując rogówkę przez mikroskop preparacyjny, oceń krycie po oparzeniu w oparciu o następującą skalę12: 
	0 = brak krycia; przezroczysta rogówka 
	1 = łagodne zmętnienie; lekkie zamglenie tęczówki i źrenic; Dobrze widoczna tęczówka i źrenica 
	2 = umiarkowane krycie; tęczówka i źrenica ledwo widoczna 
	3 = Silne zmętnienie; tęczówka lub źrenica niewidoczna 
	4 = Nieprzezroczysta rogówka; tęczówka i źrenica niewidoczne</li>
	<li>Obserwując rogówkę przez mikroskop preparacyjny, oceń CoNV na podstawie następującej skali12: 
	0 = Brak neowaskularyzacji; Brak nowych statków z limbus 
	1 = łagodna neowaskularyzacja; Nowe statki pochodzące z limbus 
	2 = umiarkowana neowaskularyzacja; Naczynia krwionośne wychodziły z rąbka i rosły w kierunku środka rogówki 
	3 = ciężka neowaskularyzacja; naczynia krwionośne wychodzące z rąbka rogówki i sięgające i/lub przecinające środek rogówki</li>
	<li>Użyj testu t-Studenta, aby statystycznie porównać wyniki zmętnienia i neowaskularyzacji między oparzeniami alkalicznymi a zdrowymi grupami oczu.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji w 10 dniu przez ekspozycję na izofluran w dawce 5% do 1 minuty po zatrzymaniu oddychania, a następnie zwichnięcie szyjki macicy i pobranie rogówki do obrazowania płaskiego.</li>
</ol>
6. Obrazowanie optycznej koherentnej tomografii (OCT)
<ol>
	<li>Wykonaj zdjęcia OCT przedniego odcinka oczu u znieczulonych myszy w 10 dniu po oparzeniu. Wykonaj akwizycję obrazu OCT jako skanowanie woluminu w trybie IR + OCT z polem widzenia 30° i intensywnością 100% podczerwieni.</li>
	<li>Określ ilościowo grubość rogówki za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
	<li>Aby zmierzyć grubość, użyj narzędzia Zaznaczanie linii w oprogramowaniu ImageJ, aby utworzyć linię prostą między przednią i tylną powierzchnią na centralnej rogówce.</li>
	<li>Kliknij opcję Analizuj > Mierz w narzędziach programowych, aby przenieść wartości do okna danych.</li>
	<li>Skopiuj wartości do pliku arkusza kalkulacyjnego i porównaj statystycznie grubość rogówki między oparzeniami alkalicznymi a zdrowymi grupami oczu za pomocą testu t-Studenta. 
	UWAGA: Grubość rogówki to odległość od punktu na przedniej powierzchni rogówki do najbliższego punktu na tylnej powierzchni rogówki w środku rogówki.</li>
</ol>
7. Barwienie immunologiczne CoNV na płaskich rogówkach
<ol>
	<li>Myszy należy poddać eutanazji w 10 dniu po oparzeniu alkalicznym i wyłuszczeniu oczu przez rozwarstwienie.</li>
	<li>Rozsuń powieki kciukiem i palcem wskazującym, a następnie umieść kleszcze pod gałką oczną. Zamknij kleszcze i delikatnie oderwij gałkę oczną od oczodołu.</li>
	<li>Umieść gałki oczne w 1x PBS. Dla każdej gałki ocznej usuń rogówkę z gałki ocznej, wykonując najpierw nacięcie za pomocą igły 30 G poniżej obszaru rąbka.</li>
	<li>Przetnij obszar rąbka za pomocą mikronożyczek rogówki, z nacięciem jako punktem wyjścia, i powoli oddziel rogówkę i rąbek od gałki ziemskiej.</li>
	<li>Delikatnie oczyść rogówki za pomocą cienkiego pędzla, aby usunąć tęczówkę. Utrwal rogówki w 4% paraformaldehydzie na 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj rogówki trzy razy po 20 minut w 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Inkubować w buforze blokującym (1x PBS uzupełniony 0,1% Triton-X 100 i 5% albuminą surowicy bydlęcej [BSA]) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść rogówkę do roztworu przeciwciała zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe. Przygotuj roztwór przeciwciała w 1x PBS uzupełniony 1% BSA, 0,1% Triton-X 100, mAb anty-CD31 sprzężonym z Dylight550 (1:100) i anty-LYVE-1 mAb sprzężonym z Alexa Fluor488 (1:100).</li>
	<li>Inkubować przez 3 dni w temperaturze 4 °C. Umyć rogówki w 1x PBS trzy razy po 20 minut każda.</li>
	<li>Jądra należy barwić roztworem barwnika Hoechst (1:1 000) przez 5 minut w ciemności.</li>
	<li>Spłaszcz rogówki za pomocą promienistych nacięć i zamontuj je na wstępnie oczyszczonym szkiełku podstawowym za pomocą podłoża montażowego i szkiełek nakrywkowych. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci i wysusz szkiełka przez noc w ciemności przed analizą za pomocą mikroskopii konfokalnej.</li>
	<li>Zobrazuj płasko zamontowane rogówki za pomocą mikroskopii konfokalnej, łącząc pojedyncze obrazy stosu Z; użyj obiektywu 10x, laserów 488 nm i 561 nm oraz rozdzielczości 512 pikseli x 512 pikseli na plaster na nierezonansowych skanerach galwanowych.</li>
	<li>Określ ilościowo gęstość naczyń krwionośnych CD31+ i limfatycznych LYVE-1+ za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
	<li>Aby określić gęstość naczyniową, przekonwertuj obrazy konfokalne na obraz 8-bitowy.</li>
	<li>Wybierz Gęstość naczyń krwionośnych z wtyczek.</li>
	<li>Wybierz obszar zainteresowania na obrazie i kliknij OK. Pomiary otworzą się w nowym oknie danych.</li>
	<li>Skopiuj wartości do pliku arkusza kalkulacyjnego i porównaj statystycznie gęstość naczyniową między oparzeniami zasadowymi a zdrowymi grupami oczu za pomocą testu t-Studenta. 
	UWAGA: CD31, zwana również cząsteczką adhezyjną komórek śródbłonka płytek krwi-1 (PECAM-1), jest cząsteczką adhezyjną komórek biorącą udział w angiogenezie i ulega silnej ekspresji w komórkach śródbłonka wczesnych i dojrzałych naczyń krwionośnych<klasa sup = "xref">13. LYVE-1 (receptor hialuronowy śródbłonka naczyń limfatycznych-1) jest markerem powierzchni komórki na komórkach śródbłonka limfatycznego i może być stosowany jako marker limfangiogenezy<klasa sup="xref">14.</li>
</ol>

Alkali Burn-Induced Corneal Neovascularization in Mice

<ol><li>Ellenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+aspects+of+corneal+angiogenic+and+lymphangiogenic+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Novel aspects of corneal angiogenic and lymphangiogenic privilege.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (3), 208-248 (2010).</li>
<li>Azar, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+angiogenic+privilege%3A+Angiogenic+and+antiangiogenic+factors+in+corneal+avascularity%2C+vasculogenesis%2C+and+wound+healing+%28an+American+Ophthalmological+Society+thesis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Ophthalmological+Society%22%5BJournal%5D)">Corneal angiogenic privilege: Angiogenic and antiangiogenic factors in corneal avascularity, vasculogenesis, and wound healing (an American Ophthalmological Society thesis).</a> Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 264-302 (2006).</li>
<li>Rolfsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+neovascularization%3A+A+review+of+the+molecular+biology+and+current+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Corneal neovascularization: A review of the molecular biology and current therapies.</a> Expert Review of Ophthalmology. 8 (2), 167-189 (2013).</li>
<li>Skobe, M., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+the+path+of+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blocking the path of lymphatic vessels.</a> Nature Medicine. 15 (9), 993-994 (2009).</li>
<li>Lee, P., Wang, C. C., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+neovascularization%3A+An+epidemiologic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular neovascularization: An epidemiologic review.</a> Survey of Ophthalmology. 43 (3), 245-269 (1998).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacious%2C+safe%2C+and+stable+inhibition+of+corneal+neovascularization+by+AAV-vectored+anti-VEGF+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Efficacious, safe, and stable inhibition of corneal neovascularization by AAV-vectored anti-VEGF therapeutics.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 107-121 (2021).</li>
<li>Lasagni Vitar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+corneal+neovascularization+and+its+impact+on+visual+acuity+and+sensitivity%3A+A+14-year+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of corneal neovascularization and its impact on visual acuity and sensitivity: A 14-year retrospective study.</a> Frontiers in Medicine. 8, 733538(2021).</li>
<li>Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+burns+acid+or+alkali%2C+what%27s+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Chemical burns acid or alkali, what's the difference.</a> Eye. 34, 1299-1300 (2020).</li>
<li>Muthukkaruppan, V. R., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 2 (4413), 1416-1418 (1979).</li>
<li>Kenyon, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A model of angiogenesis in the mouse cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1625-1632 (1996).</li>
<li>Cursiefen, C., Maruyama, K., Jackson, D. G., Streilein, J. W., Kruse, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis+after+brief+corneal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Time course of angiogenesis and lymphangiogenesis after brief corneal inflammation.</a> Cornea. 25 (4), 443-447 (2006).</li>
<li>Yoeruek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((penetration+and+efficacy+of+topically+applied+bevacizumab%3A+Evaluation+of+eyedrops+in+corneal+neovascularization+after+chemical+burn%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: Evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn.</a> Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>DeLisser, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+endothelial+PECAM-1%2FCD31+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).</li>
<li>Johnson, L. A., Prevo, R., Clasper, S., Jackson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+uptake+and+degradation+of+the+lymphatic+endothelial+hyaluronan+receptor+LYVE-1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (46), 33671-33680 (2007).</li>
<li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li>
<li>Chung, J. H., Fagerholm, P., Lindström, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+corneal+epithelium+following+a+standardized+alkali+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The behaviour of corneal epithelium following a standardized alkali wound.</a> Acta Ophthalmologica. 65 (5), 529-537 (1987).</li>
<li>Chang, J. H., Gabison, E. E., Kato, T., Azar, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Corneal neovascularization.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 12 (4), 242-249 (2001).</li>
<li>Alves da Costa, T., Lang, J., Torres, R. M., Pelanda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+human+immune+system+mice+and+their+use+to+study+tolerance+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The development of human immune system mice and their use to study tolerance and autoimmunity.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 2, 100021(2019).</li>
<li>vander Weyden, L., White, J. K., Adams, D. J., Logan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+genetics+toolkit%3A+Revealing+function+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mouse genetics toolkit: Revealing function and mechanism.</a> Genome Biology. 12 (6), 224(2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Rogówka jest doskonałą tkanką do badania angiogenezy i stanu zapalnego, ponieważ jest dostępna i unaczyniona, co oznacza, że neowaskularyzację można wygodnie wykryć i udokumentować. Oparzenie rogówki u królików, szczurów i myszy wykorzystano do badania angiogenezy rogówki, stanu zapalnego i zmętnienia, owrzodzenia, perforacji rogówki i zwłóknienia 15,16,17. Co więcej, mysi model oparzenia rogówki jest cenny dla testowania różnych strategii terapeutycznych w zakresie angiogenezy i stanu zapalnego, ponieważ myszy mają układ odpornościowy ściśle spokrewniony z układem odpornościowym ludzi. Dostępność technik genetycznej manipulacji genomem myszy sprawia, że gatunek ten jest również doskonałym wyborem do tegotypu badań. Wyzwaniem w tych badaniach było opracowanie metody spalania rogówki, która zapewnia spójną, powtarzalną patofizjologię.
Model oparzeń alkalicznych jest szczególnie przydatny w farmakologicznych badaniach przesiewowych leków, które modulują angiogenezę, stan zapalny i zwłóknienie. Minimalne wymagania dotyczące odczynników i zasobów, prostota wykonywania spalania alkalicznego oraz korzyści płynące z krótkiego czasu trwania protokołu i bezpośredniej obserwacji wyników sprawiają, że oparzenie alkaliczne rogówki myszy jest podstawowym wyborem do badań przesiewowych leków farmakologicznych. Jednak podczas wykonywania tej procedury należy wziąć pod uwagę kilka środków ostrożności, aby zapewnić spójność i odtwarzalność. Po pierwsze, bibułę filtracyjną należy umieścić na środku rogówki, aby uniknąć poparzenia innych obszarów oka, zwłaszcza rąbka, powiek i spojówki; po drugie, objętość i stężenie NaOH powinny być odpowiednie, aby uzyskać spójne wyniki spalania alkalicznego na rogówce. Filtr nie może być mokry, ale powinien być namoczony w roztworze NaOH. Rozmiar i typ filtra oraz normalność i objętość roztworu stosowanego w tej metodzie są zoptymalizowane w celu uniknięcia przepełnienia NaOH. Użycie bibuły filtracyjnej o innym rozmiarze lub większej lub mniejszej objętości NaOH spowodowałoby niespójności w neowaskularyzacji. Po trzecie, ważne jest, aby zapobiec absorpcji CO2 przez roztwór NaOH w powietrzu w pomieszczeniu poprzez natychmiastowe dokręcenie nakrętki rurki roztworu po użyciu i zmniejszenie stosunku powietrze/roztwór. Należy zachować ostrożność, aby używać świeżych roztworów alkalicznych, aby zapobiec niespójnościom w neowaskularyzacji i uniknąć owrzodzenia rogówki. Na koniec konieczne jest dokładne przemycie całego roztworu NaOH z oka i spojówki solą fizjologiczną, aby zapobiec dalszym uszkodzeniom rogówki i otaczających tkanek oka. Dokładne umycie rogówki i sąsiednich tkanek również zapobiegnie symblepharonowi.
Opisany tutaj protokół jest skuteczną i wiarygodną metodą badania patofizjologii angiogenezy rogówki. Protokół ten może być dalej wykorzystywany do badania zapalenia rogówki, zwłóknienia i gojenia się ran.

Rogówka jest beznaczyniową tkanką, która zachowuje swoją przezroczystość poprzez ustanowienie przywileju angiogennego1,2. Uszkodzenie rogówki może skutkować stanem zapalnym oraz rozwojem naczyń krwionośnych i limfatycznych, a także zwłóknieniem3. Neowaskularyzacja rogówki (CoNV) prowadzi do upośledzenia wzroku i jest drugą najczęstszą przyczyną ślepoty na świecie4. CoNV dotyka około 1,4 miliona ludzi w Stanach Zjednoczonych rocznie5. CoNV może być wywołany przez różne czynniki, w tym oparzenia chemiczne, infekcje, stany zapalne i niedotlenienie3,6. Oparzenia chemiczne są jednym z najczęstszych nagłych przypadków ocznych i stanowią około 13,2% urazów oka i wymagają natychmiastowej oceny i leczenia7. Oparzenia chemiczne mogą być oparzeniami alkalicznymi lub kwasowymi, ale oparzenia alkaliczne powodują poważniejsze obrażenia, ponieważ zasady wnikają głębiej w tkankę8.
Mysie modele oparzeń alkalicznych są powszechnie używane do badania CoNV i gojenia się ran. W porównaniu z modelem angiogenezy kieszeni rogówkowej9,10, modele oparzeń alkalicznych są stosunkowo proste do stworzenia i mogą być również wykorzystywane do badania zapalenia rogówki, zwłóknienia i proliferacji nabłonka. Modele te są również ściślej związane z klinicznymi oparzeniami chemicznymi niż modele angiogenezy szwów rogówkowych11. W przypadku oparzenia zasadowego, w skądinąd beznaczyniowej rogówce rozwijają się naczynia krwionośne z powodu stanu zapalnego i braku równowagi czynników antyangiogennych i proangiogennych1,2. Wadami modeli oparzeń alkalicznych rogówki są trudności w kontrolowaniu obszaru i ciężkości oparzenia alkalicznego, zmienność neowaskularyzacji rogówki oraz niezamierzone spalenie sąsiednich tkanek z powodu nadmiaru roztworu alkalicznego. Celem tego badania jest opisanie kontrolowanego modelu oparzenia zasadowego rogówki u myszy przy użyciu bibuły filtracyjnej wstępnie nasączonej roztworem wodorotlenku sodu. Model ten może być wykorzystany do badania czynników angiogennych, antyangiogennych odczynników terapeutycznych oraz innych czynników i odczynników, które mogą modulować stan zapalny i zwłóknienie.

<table><tbody><tr><td>0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań</td><td>Hospira</td><td>KL-7302</td><td></td></tr><tr><td>30 G Igła</td><td>McKesson</td><td>16-N3005</td><td></td></tr><tr><td>A1R Konfokalne</td><td>instrumenty Nikon</td> Anti-CD31 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-1642R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LYVE-1</td><td>Life technologies</td><td>53-0443-82</td><td></td></tr><tr><td>Moduł ASM</td><td>Heidelberg Inżynieria</td><td></td><td>Obiektyw przedniego odcinka</td></tr><tr><td>Stempel do biopsji</td><td>McKesson</td><td>16-1309</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Thermoscientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR International</td><td>22X22-1-601640G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>AmScope</td><td>SM-4TZ-30WY-10M3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-157</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-4905</td><td></td></tr><tr><td>Hypromeloza Gonak&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>17478006412</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad Sotware, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>K& H Produkty dla zwierząt 100213018</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT Spectralis</td><td>Heidelberg Engineering</td> Strzykawka <td></td><td></td></tr><tr><td>insulinowa</td><td>Mckesson</td><td>102-SN310C31516P</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly Clark Professional</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Szkło z mikro osłoną</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki mikroskopowe</td><td>Roboz</td><td>RS-5110</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Siarczany neomycyny i polimyksyny B oraz deksametazon&nbsp;</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208-0795-35</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica</td><td>Jackson Immuno</td><td>008-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Proparakaina HCl</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208073006</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Henry Schein</td><td>1531042</td><td></td></tr><tr><td>SMZ125</td><td>Nikon Instruments</td> Strzykawka <td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml</td><td>McKesson</td><td>16-S10C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann Bibuła</td><td>filtracyjna Cytiva</td><td>WHA1003323</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model neowaskularyzacji rogówki za pomocą oparzenia alkalicznego

A Mouse Model for Corneal Neovascularization by Alkali Burn

Neowaskularyzacja rogówki (CoNV), patologiczna forma angiogenezy, polega na wzroście naczyń krwionośnych i limfatycznych do beznaczyniowej rogówki z rąbka i niekorzystnie wpływa na przezroczystość i widzenie. Oparzenie alkaliczne jest jedną z najczęstszych form urazu oka, który prowadzi do CoNV. W tym protokole CoNV jest indukowany eksperymentalnie przy użyciu roztworu wodorotlenku sodu w kontrolowany sposób, aby zapewnić odtwarzalność. Model oparzenia alkalicznego jest przydatny do zrozumienia patologii CoNV i może być rozszerzony o ogólne badanie angiogenezy ze względu na unaczynienie, przezroczystość i dostępność rogówki. W tej pracy CoNV analizowano przez bezpośrednie badanie pod mikroskopem preparacyjnym oraz przez barwienie immunologiczne płaskich rogówek przy użyciu mAb anty-CD31. Limfangiogenezę wykryto na płaskich rogówkach poprzez barwienie immunologiczne przy użyciu mAb anty-LYVE-1. Obrzęk rogówki uwidoczniono i określono ilościowo za pomocą optycznej koherentnej tomografii (OCT). Podsumowując, model ten pomoże udoskonalić istniejące testy neowaskularyzacji i odkryć nowe strategie leczenia patologicznej angiogenezy oka i zewnątrzgałkowej.

Niniejsze badanie opisuje metodę indukowania angiogenezy rogówki w oku myszy poprzez oparzenie zasadami. Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu sekcyjnego (Rycina 1A,B) wykazały znacznie podwyższony stopień neowaskularyzacji i zmętnienia rogówek w grupie z oparzeniem zasadami (P &lt; 0,05; Rycina 1C,D). Rogówki pobrane w 10. dniu poddano następnie barwieniu immunohistochemicznemu odpowiednio z użyciem przeciwciała mAb przeciwko CD31 dla naczyń krwionośnych oraz mAb przeciwko LYVE-1 dla naczyń limfatycznych (Rycina 2A-I). W grupie z oparzeniem zasadami po 10 dniach odnotowano znacznie wyższą gęstość naczyń krwionośnych i limfatycznych (odpowiednio P &lt; 0,001 oraz P &lt; 0,05; Rycina 2J,K). Zaobserwowano, że grubość rogówki, obrazowana i ilościowo oznaczana przy użyciu OCT (Rycina 3A,B), była znacznie większa w grupie z oparzeniem zasadami (P &lt; 0,01; Rycina 3C).
<img alt="Neowaskularyzacja rogówki, efekt oparzenia alkalicznego, wykresy porównawcze, zdrowie oczu, analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Neowaskularyzacja i zmętnienie rogówki wywołane oparzeniem alkalicznym. (A,B) Neowaskularyzacja rogówki rozwijająca się z naczyń limbalnych w kierunku centrum rogówki w (B) oku myszy po oparzeniu alkalicznym (A) w porównaniu do zdrowego oka 10 dni po urazie. (C,D) Ilościowe określenie (C) neowaskularyzacji rogówki oraz (D) zmętnienia na panelach A i B (± SEM; t-test; *P &lt; 0.05; n = 3 oczu, 1 oko/mysz). Czerwone strzałki wskazują limbus, a żółta strzałka wskazuje rozwijające się nowe naczynia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja CD31, LYVE oraz wykresy ilustrujące porównanie gęstości naczyń krwionośnych i limfatycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Neowaskularyzacja i limfangiogeneza rogówki wywołana oparzeniem alkalicznym. Immunohistochemia wykazała obecność naczyń krwionośnych (A,D,G) i limfatycznych (B,E,H) z zastosowaniem odpowiednio przeciwciał mAb anty-CD31 i anty-LYVE-1. (A-C) Zdrowa rogówka myszy. (D-I) Rogówka po oparzeniu alkalicznym 10 dni po urazie. (C,F,I) Nałożone na siebie obrazy sygnałów CD31 i LYVE-1. (G-I) Powiększone obrazy dla paneli D-F. Paski skali = (A-F) 200 µm oraz (G-I) 500 µm. (J,K) Ilościowe oznaczenie gęstości naczyń krwionośnych i limfatycznych w panelach A-F, zgodnie z oznaczeniami (± SEM; t-test; *P &lt; 0.05; ***P &lt; 0.001; n = 3 oczy, 1 oko/mysz). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie grubości rogówki w OCT. Schemat z wykresem słupkowym pokazujący wyniki dla grupy zdrowej i po oparzeniu zasadą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zwiększenie grubości rogówki spowodowane oparzeniem zasadą. (A) Obraz OCT zdrowego oka myszy. (B) Obraz OCT rogówki myszy 10 dni po oparzeniu zasadą. (C) Ilościowe określenie grubości rogówki na panelach A i B, pomiar wykonany w centrum rogówki (± SEM; t-test; **P &lt; 0.01; n = 3 oczy, 1 oko/mysz). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół skupia się na neowaskularyzacji rogówki wywołanej oparzeniami alkalicznymi u myszy. Metoda ta pozwala na stworzenie powtarzalnego i kontrolowanego modelu choroby rogówki w celu zbadania patologicznej angiogenezy i związanych z nią mechanizmów molekularnych oraz przetestowania nowych środków farmakologicznych zapobiegających neowaskularyzacji rogówki.

Mysi model neowaskularyzacji rogówki za pomocą oparzenia alkalicznego

Corneal neovascularization (CoNV), a pathological form of angiogenesis, involves the growth of blood and lymph vessels into the avascular cornea from the ...

Staramy się opracować wysoce powtarzalny model indukcji neowaskularyzacji rogówki oraz zidentyfikować najistotniejsze metody histologiczne i immunobarwiące w celu monitorowania terapii mających na celu zapobieganie i ograniczanie neowaskularyzacji. Wadami modeli oparzeń alkalicznych rogówki są trudności w kontrolowaniu obszaru i ciężkości oparzenia alkalicznego, zmienność neowaskularyzacji rogówki oraz niezamierzone oparzenia krawędzi i tkanek z powodu nadmiaru roztworu alkalicznego. Neowaskularyzacja rogówki jest stanem zagrażającym wzrokowi.Patogeneza tego schorzenia jest słabo poznana. Model ten zostanie wykorzystany do uzyskania nowych informacji na temat tego schorzenia i zidentyfikowania odpowiednich celów terapeutycznych. W porównaniu z modelem angiogenezy kieszeni rogówkowej, modele oparzeń alkalicznych są stosunkowo proste do stworzenia i mogą być również wykorzystywane do badania zapalenia rogówki, zwłóknienia i proliferacji nabłonka.Modele te są również ściślej związane z klinicznymi oparzeniami chemicznymi niż modele angiogenezy za pomocą szwów rogówkowych. Wykorzystamy zasadowe oparzenia rogówki jako model choroby do zbadania nowej terapii antyangiogennej w leczeniu neowaskularyzacji i zmętnienia rogówki. Na początek wstrzyknij meloksykam podskórnie sześcio- do ośmiotygodniowej myszy płci męskiej C57 Black 6J na 30 minut przed zabiegiem w celu złagodzenia bólu.Po znieczuleniu myszy uszczypnij palce u nóg i potwierdź brak odruchu. Nałóż jedną kroplę 0,5% proparakainy na powierzchnię rogówki jednego z nich i kroplę sztucznych łez na drugie oko. Następnie, za pomocą dwumilimetrowego dziurkacza do biopsji, wybij papierowe krążki filtracyjne Whatmana.Dodaj dwa mikrolitry jednego normalnego wodorotlenku sodu do czystej szalki Petriego i umieść krążek z bibuły filtracyjnej na kropli wodorotlenku sodu, pozwalając mu wsiąknąć przez 15 sekund. Za pomocą kleszczy podnieś bibułę filtracyjną i przyłóż ją do oka potraktowanego proparakainą w środku rogówki na 30 sekund. Przemyć oko, przepłukując je 20 mililitrami sterylnej soli fizjologicznej w strzykawce.Delikatnie wytrzyj nadmiar soli fizjologicznej z oczu i okolic za pomocą jednorazowych miękkich chusteczek. Umieść mysz w klatce regeneracyjnej na ciepłej poduszce grzewczej do czasu rozpoczęcia chodzenia. W 10 dniu po oparzeniu wykonaj obrazy OCT przedniego odcinka oczu jako skan objętości w trybie HRA+OCT z 30-stopniowym polem widzenia i intensywnością 100% podczerwieni.Neowaskularyzacja rogówki wyrosła z naczyń rąbka w kierunku środka rogówki w oku myszy oparzonym alkaliami, ale nie w zdrowym oku. Grupa oparzeń alkalicznych wykazała znacznie podwyższone wyniki neowaskularyzacji i zmętnienia w porównaniu z grupą kontrolną. Barwienie immunologiczne rogówek naczyń krwionośnych i limfatycznych wykazało istotnie większą gęstość naczyń krwionośnych i limfatycznych po 10 dniach w grupie oparzonej w porównaniu z grupą kontrolną.Grubość rogówki zobrazowana i określona ilościowo za pomocą OCT była znacznie wyższa w grupie oparzeń.

a-mouse-model-for-corneal-neovascularization-by-alkali-burn

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neowaskularyzacja (NV) rogówki może komplikować wiele patologii wzrokowych. Wykorzystując kontrolowany model uszkodzeń spowodowanych oparzeniami zasadowymi, można uzyskać wymierny poziom NV rogówki do mechanistycznego badania NV rogówki i oceny potencjalnych terapii zaburzeń neowaskularnych.

Model urazu neowaskularyzacji rogówki w oparzeniach zasadowych u myszy

Ten protokół opisuje metodę polegającą na otarciu powierzchni oka myszy i śledzeniu procesu gojenia się ran. Protokół wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka powierzchniowego oka u znieczulonych myszy.

Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Ten protokół opisuje metodę wywoływania dokładnego i powtarzalnego uszkodzenia rogówki i rąbków w modelu mysim. Protokół jest korzystny, ponieważ pozwala na równomierne rozłożenie uszkodzenia silnie zakrzywionej rogówki i rąbka myszy.

Indukcja alkaliów rogówki i rąbka za pomocą techniki stempla i trepanacji w modelu mysim

Ortotopowe modele zwierzęce raka jajnika lepiej odwzorowują przebieg choroby u ludzi, a tym samym zwiększają naszą wiedzę na temat progresji nowotworu i odpowiedzi guza na terapię. W modelu mysim wykonuje się wstrzyknięcie do wnętrza woreczka otrzewnej komórek nowotworu jajnika wykazujących ekspresję lucyferazy. Leczenie podaje się poprzez zgłębnik żołądkowy. Wzrost guza monitoruje się za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obrazowanie in vivo i leczenie terapeutyczne w ortotopowym modelu raka jajnika u myszy

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Aktywność nadnerczy może być oceniona u koniowatych poprzez analizę kału pod kątem metabolitów kortykosteronu. Metoda ta oferuje nieinwazyjną opcję oceny długoterminowych wzorców zarówno u koni domowych, jak i wolno żyjących. Protokół ten opisuje zaangażowany test immunologiczny sprzężony z enzymem i związaną z nim walidację biochemiczną.

Analiza glikokortykosteroidów w kale: nieinwazyjne monitorowanie nadnerczy u koniowatych

Ten manuskrypt zawiera szczegółową dwuetapową procedurę chirurgiczną do wykonania mysiej 5/6częściowej nefrektomii (PNx) z podwiązaniem bieguna. Cztery tygodnie po operacji, w porównaniu z myszami operowanymi pozorowanymi, myszy PNx rozwinęły upośledzoną czynność nerek, niedokrwistość, przerost serca, zwłóknienie serca oraz zmniejszoną czynność skurczową i rozkurczową serca.

Mysi model nefrektomii 5/6, który indukuje eksperymentalną kardiomiopatię mocznicową

Tutaj prezentujemy protokół zwiększający produkcję chimer bez użycia nowego sprzętu. Prosta zmiana orientacji zarodka do wstrzyknięcia może zwiększyć liczbę produkowanych zarodków i potencjalnie skrócić czas do transmisji w linii zarodkowej.

Wstrzyknięcie masy komórkowej trans-wewnętrznej embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do wyższych wskaźników chimeryzmu

Ten protokół opisuje metodę przygotowania wzbogaconych komórek ochronnych aparatów szparkowych, która jest przydatna do badań fizjologicznych i innych badań biologicznych.

Taśma szparkowa Tape-Peel: ulepszona metoda przygotowania próbki komórek ochronnych

Poznaj model neowaskularyzacji rogówki u myszy wywołany oparzeniem alkalicznym. Ta metoda pozwala badać patologiczną angiogenezę i oceniać terapie farmakologiczne w leczeniu chorób rogówki.

Mysi model neowaskularyzacji rogówki za pomocą oparzenia alkalicznego

Przeglądaj więcej filmów